Name: 彗星试验测定DNA损伤的海马神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习使用彗星试验测定海马神经元DNA损伤的方法。该技术通过电泳分离受损DNA片段，结合荧光显微镜和专用软件定量分析单细胞水平的DNA损伤程度，为神经退行性疾病研究提供可靠的检测手段。

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本工作由阿拉巴马大学伯明翰分校综合癌症中心放射肿瘤学系的IMPACT奖、抗击儿童癌症基金会以及加布里埃尔天使基金会（授予ESY.）提供资助。

1. 细胞培养
 <ol>
 <li>培养神经元细胞，并根据需要进行处理。</li>
 <li>将细胞收集至15 ml离心管中：吸除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS，无钙、无镁）洗涤，加入胰蛋白酶消化，收集至15 ml离心管中，并用含适当血清的培养基中和胰蛋白酶。</li>
 <li>以1,000 × g离心5分钟。</li>
 <li>吸除上清液。</li>
 <li>用PBS重悬细胞。</li>
 <li>以1,000 × g离心5分钟。</li>
 <li>吸除上清液，用新鲜PBS重悬细胞。</li>
 <li>使用血细胞计数板或您偏好的细胞计数仪对细胞进行计数。</li>
 <li>细胞样品应在开始检测前立即制备。</li>
 <li>所有样品均应在避光或黄光条件下操作，以防止紫外线引起的DNA损伤。</li>
</ol>
 2. 彗星试验
 1. 载玻片制备
 <ol>
 <li>将1%琼脂糖（1 g / 100 ml，溶于1X Tris-硼酸-EDTA缓冲液，TBE）放入微波炉中加热3分钟，直至所有颗粒完全溶解。</li>
 <li>将载玻片浸入熔化的琼脂糖中，用无尘纸（kimwipe）擦去一侧多余液体。静置晾干，形成透明薄膜。此步骤可预先完成，制备好的载玻片可储存备用。</li>
</ol>
 2. 中性彗星实验
 <ol>
 <li>使用前将裂解液（2.5 M NaCl、100 mM EDTA pH 10、10 mM Tris碱、1% 月桂酰肌氨酸钠、1% Triton X-100，pH 10）在4 °C下预冷至少1小时。</li>
 <li>2.2.2. 在微波炉中加热1%低熔点琼脂糖（1 g / 100 ml 1X Tris碱、硼酸、EDTA缓冲液）3分钟，直至颗粒完全溶解。琼脂糖需在水浴中冷却至37 °C，以避免人为诱导彗尾形成。理想情况下，琼脂糖应在使用前冷却约30分钟。</li>
 <li>2.2.3. 将细胞悬液稀释至每毫升含100,000个细胞。按1:10（v/v）的比例将细胞悬液与37 °C的低熔点琼脂糖混合，短暂涡旋混匀后立即吸取50 μl滴加至彗星电泳载玻片上。用移液器吸头侧面将细胞悬液在样品区域均匀铺开。每个处理组至少设三个重复。</li>
 <li>将载玻片平放于冰箱中30分钟，直至玻片边缘出现环形凝固圈。</li>
 <li>预先将裂解液冷却，将载玻片完全浸入该溶液中，在4 °C（或冰箱中）避光孵育30分钟。</li>
 <li>倒出或吸除裂解液，加入1X中性电泳缓冲液（Tris碱、硼酸、EDTA，1X TBE）。将载玻片在冰箱中继续孵育30分钟。</li>
 <li>在电泳槽中加入预冷的1X中性电泳缓冲液（TBE），将载玻片放入电泳槽托架中。调整载玻片位置，使其与电极距离相等。</li>
 <li>加入1X中性电泳缓冲液至载玻片上方约0.2英寸处。缓冲液过多将干扰电泳过程。</li>
 <li>将电源电压设定为1 V/cm（电极至电极距离），在4 °C（或低温室）避光条件下运行30分钟。</li>
</ol>
 3. 碱性彗星实验
 <ol>
 <li>使用前，将裂解液（2.5 M NaCl、100 mM EDTA pH 10、10 mM Tris碱、1% 月桂酰肌氨酸钠和1% Triton X-100，pH 10）在4 °C预冷至少1小时。</li>
 <li>将1%低熔点琼脂糖（1 g / 100 ml，溶于1X Tris碱、硼酸、EDTA缓冲液）在微波炉中加热3分钟，直至颗粒完全溶解。随后在37 °C水浴中冷却至少30分钟。</li>
 <li>将细胞浓度调整为1 × 10⁵ / ml，与37 °C熔融的低熔点琼脂糖按1:10（v/v）比例混合，短暂涡旋混匀后，立即吸取50 μl滴加至彗星电泳载玻片上。用移液器吸头侧面将细胞悬液均匀铺展于样品区域。每个处理组至少设置三个重复。</li>
 <li>将载玻片平放于冰箱中静置30分钟，直至玻片边缘出现环形凝固圈。</li>
 <li>将载玻片浸入预冷的裂解液中，于4 °C避光孵育1小时至过夜。</li>
 <li>从裂解液中取出载玻片，沥干后用冷的中和缓冲液冲洗一次，每次5分钟，以去除碱性解旋步骤前残留的去垢剂和盐分。</li>
 <li>将载玻片放入电泳槽中，加入新配制并预冷的电泳缓冲液（300 mM NaOH、1 mM EDTA，pH > 13），液面高度不超过载玻片上方0.5 cm。调整载玻片位置，使其与两侧电极距离相等。</li>
 <li>在避光条件下，让载玻片于碱性缓冲液中静置30分钟，以使DNA充分解旋并暴露碱性敏感性损伤位点。</li>
 <li>将电源电压设定为1 V/cm（以电极间距离为准），在4 °C（或冷藏室环境）下电泳运行30分钟。</li>
</ol>
 4. 固定与染色细胞
 <ol>
 <li>排去过量电泳缓冲液</li>
 <li>将载玻片浸入预冷的蒸馏水中，室温下处理 5 分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入预冷的 70% 乙醇中，室温下处理 5 分钟。</li>
 <li>干燥样品过夜。切勿将载玻片暴露于强光下。此阶段样品可在室温下保存数月，之后再进行评分。</li>
 <li>将载玻片浸入 Sybr green（1X 稀释于 PBS 中）溶液中，于冰箱中染色 20 分钟。</li>
 <li>取出载玻片，置于暗处彻底干燥。完全干燥后，琼脂糖将变为透明。</li>
</ol>
4. 图像采集与分析
 <ol>
 <li>使用荧光显微镜（Zeiss AxioVision）在绿色滤光片下采集图像，并使用彗星分析软件（Perceptive Instruments）进行分析。</li>
 <li>点击“彗星头部”（即细胞核），软件将自动计算相关参数，包括平均尾矩和细胞核中的DNA含量。</li>
 <li>每种处理组至少分析200个细胞。</li>
 <li>将数据导出至 Microsoft Excel。</li>
 <li>计算每组处理的平均尾矩，并根据需要绘制数据图表。</li>
</ol>
 5. 代表性结果
 神经元细胞彗星实验分析示例如下所示 图2 和 图3在此情况下，神经元细胞经照射后会诱导产生DNA损伤。当细胞处于电场中时，由于DNA片段大小不同，其迁移速率也不同，随后使用Comet Assay软件进行分析。DNA损伤越严重，DNA从细胞核中迁移出的距离就越远，导致细胞核内的荧光强度降低。该变化被软件检测到，从而产生更高的尾矩值。 表1 展示了彗星实验分析的一个代表性表格 图4 显示了通过彗星实验测量辐射后神经元细胞中DNA损伤的代表性图表。
 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="彗星试验流程图；琼脂糖凝胶电泳中的细胞；通过荧光显微镜进行分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 彗星试验流程图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="海马神经元的彗星实验结果，DNA损伤分析，显微镜图像。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 神经元细胞的代表性图像：(A) 无彗星尾；(B) 有彗星尾。
 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="荧光显微镜流程图、发射分析、样品观察步骤 A-C。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 使用Comet Assay软件进行彗星试验分析。（A）使用Carl Zeiss荧光显微镜获取图像并用Comet Assay软件分析的代表性截图。（B）点击细胞核或“彗星头部”（绿色圆圈标示）将生成荧光图谱和曲线图（黄色圆圈标示）以及（C）数据表（红色圆圈标示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="柱状图；辐射对DNA损伤的影响；平均尾矩比较；有辐射与无辐射结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 通过中性彗星实验分析经辐射与未经辐射的神经元细胞中的DNA损伤，绘制出的代表性图表。如预期所示，3 Gy辐射（X射线）可诱导DNA损伤，表现为经辐射神经元细胞中较高的平均尾矩。图中显示的是平均尾矩（±标准误差），**P&lt;0.01。
 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="彗星实验结果数据表：头部长度、尾部强度、总面积和时间细节。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 
表 1. 经彗星实验分析辐照与未辐照神经元细胞所获得的代表性数据表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay.+An+overview+of+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li>
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<li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li>
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<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

彗星试验具有分析单个细胞的独特能力。这对于识别对细胞毒性试剂表现出不同反应的细胞亚群具有优势。但需考虑一些实际限制因素。可单独评估的细胞数量可能因个体而异。如果群体内DNA损伤存在变异，则需要增加样本量。该试验的关键在于获得有活力的单细胞悬液，因为坏死或凋亡细胞的大量存在会增加实验误差。裂解和电泳步骤可去除凋亡细胞、小片段DNA（小于50 kb）以及线粒体DNA，因此这些成分无法被彗星试验检测到1,3-11。
	如上所述，彗星试验是检测DNA单链和双链断裂的有效方法，包括碱不稳定位点以及DNA-DNA或DNA-蛋白质交联。本文概述了两种不同的实验方案：碱性彗星试验可检测单链断裂和双链断裂，而中性彗星试验仅能检测双链断裂。酶修饰的彗星试验可用于检测氧化性DNA加合物。例如，使用Endo III（内切核酸酶）和hOGG1（糖基化酶）分别识别氧化的嘧啶类物质，包括胸腺嘧啶乙二醇和尿嘧啶乙二醇12,13，以及8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxoGua）14,15。同样也可使用甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶（FPG）。在此修饰后...

<table><tbody><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc</td><td>Sc-200271</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE（Tris 碱、硼酸、EDTA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13331</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553851</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A5093</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>01213101</td><td></td></tr><tr><td>烧杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB102300</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004261PR</td><td></td></tr><tr><td>彗星分析软件</td><td>Comet Assay IV Image Analysis System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>量筒</td><td>Fisher Scientific</td><td>08555F</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GIBCO</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>电泳槽</td><td>Thermo Scientific</td><td>09528101</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A407P4</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss Axio Vision</td><td></td><td>任何配备绿色滤光片的荧光显微镜均可使用</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267152</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Sears</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无钙无镁磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>HyClone</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>冰箱</td><td>Sears</td><td></td><td></td></tr><tr><td>直尺</td><td>Staples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550143</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>月桂酰肌氨酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S529</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>托盘</td><td>Fisher Scientific</td><td>15242B</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>HyClone</td><td>SH3023601</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher Scientific</td><td>02216108</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>154622Q</td><td></td></tr></tbody></table>

使用彗星试验法检测海马神经元中的dna损伤

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

多种药物通过造成DNA损伤来靶向DNA修复通路并诱导细胞死亡。因此，直接检测DNA损伤的方法已被广泛评估。传统方法耗时长、成本高、资源消耗大，且需要细胞处于复制状态。相比之下，彗星试验（comet assay），即单细胞凝胶电泳试验，是一种更快捷、无创、经济、直接且灵敏的DNA损伤与修复检测方法。利用这一强大技术，可在单细胞水平上直观检测各种形式的DNA损伤及DNA修复过程。
	彗星试验的基本原理是完整DNA具有高度有序的结构，而DNA损伤会破坏这种有序性。受损的DNA会渗入琼脂糖基质中，在电场作用下，带负电荷的DNA向带正电的阳极迁移。大分子量的未受损DNA片段无法从细胞核中迁移很远，而DNA损伤产生的较小DNA片段则能迁移得更远。彗星试验图像分析软件通过测量并比较细胞核内与迁移出细胞核的DNA的总体荧光强度来评估损伤程度。迁移DNA产生的荧光信号强度与DNA损伤程度成正比，DNA尾部越长、越亮，表明DNA损伤越严重。实验中测量的参数包括尾矩（反映尾部DNA的数量及其分布情况）、尾长以及尾部DNA所占百分比。由于DNA损伤的修复意味着损伤的消除，因此该方法也可用于检测DNA修复能力。该方法的检测灵敏度约为每二倍体哺乳动物细胞50个链断裂1,2。使用任何DNA损伤剂（如依托泊苷）处理的细胞均可作为阳性对照。因此，彗星试验是一种快速且有效的DNA损伤检测方法。

彗星试验是一种高效检测所有细胞（包括海马神经元）DNA中单链和双链断裂的方法，可检测碱性不稳定位点以及DNA-DNA/DNA-蛋白质交联。该方法利用不同DNA损伤程度导致DNA在电场中迁移率差异的原理进行检测。

使用彗星试验法检测海马神经元中的DNA损伤

多种药物通过造成DNA损伤来靶向DNA修复通路并诱导细胞死亡。因此，用于直接检测DNA损伤的技术已得到……

本实验的总体目标是利用彗星试验（COMET assay）检测并定量神经元中的DNA损伤程度。首先，将神经元暴露于不同的DNA损伤条件下，收集神经元后与低熔点琼脂糖混合。第二步是将神经元固定在载玻片上。接下来，裂解神经元并进行电泳作为最后一步。使用Cyber Green对DNA进行染色。最终利用荧光显微镜和COMET分析软件对单个神经元中DNA损伤水平进行可视化和定量分析。大家好，我叫Eddie Yang，是阿拉巴马大学伯明翰分校放射肿瘤学系的助理教授。今天我们将演示COMET实验，这是一种检测细胞中DNA损伤的简单方法。与现有的其他方法（如Gamma H2AX焦点染色和脉冲场凝胶电泳）相比，该技术的主要优势在于它是一种直接且灵敏的DNA损伤检测方法。此外，通过对该技术进行少量修改，可以确定 DNA 损伤的类型，因为许多癌症疗法通过在肿瘤中诱导 DNA 损伤发挥作用，并且通常通过改变 DNA 修复能力来实现治疗效果。该技术的应用可进一步拓展至评估癌症治疗的疗效。今天演示该实验操作的是我实验室的研究助理 Samara Noshin 女士。首先，将处于所需实验条件下处理的神经元细胞收集到 15 毫升离心管中。吸去上清液后，将离心管在1000 × g、4°C条件下离心5分钟。用PBS重悬沉淀，第二次洗涤后再次离心细胞。用更多PBS重悬细胞，计数，并在避光条件下保存，直至用于彗星试验。为避免在开始彗星实验前发生DNA损伤，将1%琼脂糖在微波炉中加热三分钟，直至所有颗粒完全消失。随后将载玻片浸入熔化的琼脂糖中，并用无尘纸（Kim wipe）擦去其中一侧的多余琼脂糖。让琼脂糖自然风干形成透明薄膜；在琼脂糖干燥的同时，将裂解液置于4°C环境中预冷至少一小时，并另熔化更多琼脂糖备用。1%低熔点琼脂糖。冷却。将此批琼脂糖在37摄氏度水浴中孵育半小时。为避免人为诱导彗星尾现象，现将收获的神经元细胞悬液稀释，使每毫升含有100,000个细胞。将细胞悬液与37摄氏度的低熔点琼脂糖按1:10的比例混合，短暂涡旋后立即用移液枪头侧面将50微升细胞悬液均匀铺展在空气干燥的彗星电泳载玻片的样品区域。将处理后的载玻片平放在冰箱中静置30分钟，直至载玻片边缘出现环状凝固圈。随后将载玻片浸入预冷的裂解液中，在4摄氏度避光条件下孵育。30分钟后，吸除裂解液。然后将载玻片置于1×中性电泳缓冲液中，在冰箱内孵育30分钟。接着，将预冷的1×中性电泳缓冲液加入电泳槽中，再将载玻片放入电泳载玻片架内，调整载玻片位置，使其与电极的距离相等。在充满电泳缓冲液（1×中性）后，使液面高出载玻片0.2英寸，将电源电压设定为每厘米1伏，在4°C避光条件下运行30分钟。首先，将新的琼脂糖凝胶载玻片以及经神经元细胞处理的载玻片浸入新鲜的预冷裂解液中，随后在4°C避光孵育1小时至过夜。接着，将载玻片从裂解液中取出，沥干后用冷的中和缓冲液漂洗一次，每次5分钟，以在进行碱性解旋步骤前去除任何残留物。然后将载玻片放入装有预冷的新鲜电泳缓冲液的凝胶电泳槽中，缓冲液液面不超过载玻片上方0.5厘米。在避光条件下，将载玻片于碱性缓冲液中孵育30分钟，以使DNA解链并暴露碱性敏感性损伤。随后在4°C条件下，以每厘米1伏的电压进行电泳，运行30分钟。运行彗星实验后，倒掉多余的电泳缓冲液，然后将载玻片浸入室温下预冷的蒸馏水中。五分钟后，将载玻片浸入同样处于室温的预冷70%乙醇中。再过五分钟后，将样品置于避光环境中过夜干燥。然后将载玻片置于冰箱中用 Cyber Green 染色 30 分钟。取出载玻片，避光完全干燥。完全干燥后，aros 会变得透明。为了获取实验图像，使用设置为绿色滤光片的荧光显微镜。然后打开 COMET 实验程序以分析所获得的图像。单击彗头按钮后，软件将计算包括平均尾矩和细胞核中 DNA 含量在内的各项参数。每种处理至少分析 200 个细胞后，将数据导出至 Microsoft Excel，用于计算平均尾矩并绘制数据图。第一张图展示了有或无彗尾的神经元细胞 COMET 实验分析示例。在使用 COMET 实验软件分析的第二个彗尾实验中，发现神经元细胞经照射后在电场作用下出现了 DNA 损伤。由于DNA片段大小不同，其迁移速率也不同，随后通过常用分析软件对结果进行分析。第一张截图显示了使用荧光显微镜结合彗形实验（COMET assay）程序获得的代表性图像。点击某一图像中的细胞核或彗形头部，即可生成相应的荧光分布图谱及数据表格。DNA损伤越严重，DNA从细胞核中迁移出来的距离就越远。这导致细胞核内的荧光强度下降，表现为绿色信号减弱，并由软件检测到更高的尾矩值。在本图中，展示了通过中性COMET实验分析辐照与未辐照神经元细胞中DNA损伤后所得的平均尾矩的代表性图表，结果表明辐照组神经元细胞的平均尾矩更高，提示存在由辐射诱导的三级灰度DNA损伤。在进行该实验操作时，重要的是要小心处理细胞，避免其暴露于直射光下，并控制pH环境中的温度。这是为了防止细胞受到额外的应激，从而影响实验结果。在完成该操作后，还可通过其他方法，如利用免疫荧光染色分析DNA修复焦点，来进一步探究哪些DNA修复通路发生了改变。例如，可通过检测 RAD51 焦点或磷酸化 DNA-PK 焦点的免疫荧光染色，分别评估同源重组修复和非同源末端连接修复。

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彗星试验测定DNA损伤的海马神经元

该视频演示了在暴露于有害物质后，利用彗星实验检测DNA损伤的方法。在碱性条件下，DNA解旋并发生变性，经过电泳后，未受损和受损的DNA在琼脂糖凝胶中的迁移行为不同，形成彗星状结构。迁移较慢的未受损DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的受损DNA片段则形成拉长的彗星尾部。...

用于细胞DNA损伤检测的彗星实验

本文介绍了一种能够以前所未有的通量进行彗星实验检测DNA损伤的平台。该装置可将哺乳动物细胞排列成微阵列，并实现96个样品的并行处理。该方法有助于分析基础水平的DNA损伤、暴露诱导的DNA损伤以及DNA修复动力学。...

CometChip：一种用于在微阵列化人细胞中高通量检测DNA损伤的96孔平台

彗星试验用于检测由不同因素引起的DNA断裂。如果除氧化应激外的所有其他导致DNA损伤的因素均保持恒定，则DNA损伤程度可作为氧化应激的一个良好间接参数。本实验方案的目标是利用彗星试验对氧化应激进行间接测定。...

彗星试验作为系统性氧化应激的间接检测方法

碱性彗星实验用于检测真核细胞中的DNA链断裂。通过添加内切核酸酶III或人8-氧代鸟嘌呤-DNA-糖基化酶消化步骤，该实验可有效检测氧化性DNA损伤。本文描述了利用这些实验方法检测大鼠肝脏中DNA损伤的技术流程。...

体内 碱性彗星试验及酶修饰碱性彗星试验用于检测大鼠肝脏中的DNA链断裂和氧化性DNA损伤

彗星试验是一种检测DNA损伤（包括单链和双链DNA断裂）的有效方法。我们描述了碱性和中性彗星试验，用于检测癌细胞中的DNA损伤，以评估化疗的治疗效果。...

评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤

本方案描述了在动物尸检时制备高质量冷冻组织样本的几种方法，用于彗星试验以评估DNA损伤：1）剪碎的组织，2）胃肠道刮取的上皮细胞，以及3）需使用组织剪切装置均质化的立方体组织样本。...

使用冻存组织进行彗星实验以评估DNA损伤

彗星试验是检测DNA损伤的常用方法。本研究介绍了一种用于运行彗星试验代表性变体的载玻片操作方法。该方法显著增加了样本数量，同时缩短了试验运行时间、减少了载玻片操作步骤以及凝胶损伤的风险。...

一种用于评估细胞DNA损伤的高通量彗星实验方法

本方案描述了一种通过彗星实验来定量分析I型和II型抑制剂在FLT3突变细胞中诱导DNA损伤差异的有效方法。...

彗星实验定量分析表达FLT3突变体的32D细胞在暴露于I型和II型FLT3抑制剂后的DNA损伤

关键词：彗星实验，DNA损伤，FLT3突变，32D细胞，I型FLT3抑制剂，II型FLT3抑制剂

被广泛研究的线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）可通过转基因技术表达人类β-淀粉样蛋白肽（Aβ）。在秀丽隐杆线虫（C.

使用转基因 C. elegans 模型检测β-淀粉样蛋白毒性

我们描述了一种通过荧光显微镜对活神经元中的线粒体进行长时间成像的实验方案。通过慢病毒介导表达线粒体靶向的荧光蛋白，并结合使用本实验室设计和构建的低成本载台式培养箱，可实现对样本的长期连续成像。...

神经调节与线粒体运输：对海马神经元进行长时间活体成像

学习使用彗星试验测定海马神经元DNA损伤的方法。该技术通过电泳分离受损DNA片段，结合荧光显微镜和专用软件定量分析单细胞水平的DNA损伤程度，为神经退行性疾病研究提供可靠的检测手段。

使用彗星试验法检测海马神经元中的DNA损伤

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