T细胞的定量高通量单细胞细胞毒性检测方法

该实验系统提供了一种高通量的方法，可在单细胞水平上监测T细胞介导的细胞毒性。首先，用荧光染料对效应T细胞和肿瘤靶细胞进行标记。将两种细胞加载到纳米孔阵列上，并将整个芯片浸入含有Cyt Green和荧光标记Nexin.V五的培养基中。

为了识别坏死细胞和凋亡细胞，现在记录初始的预成像，以确定实验开始时的孔板占据率及细胞活力。经过六小时孵育后，记录第二张图像。然后使用自动化的图像分析来定量分析CAR阳性T细胞对EL4 CD19阳性细胞的抗原特异性裂解作用。

通过这种高通量方法获得的结果，可根据细胞毒素的阳性染色情况，筛选效应细胞对靶细胞的抗原特异性裂解。该技术相较于现有的铬51释放实验，其主要优势在于能够实现真正的一对一有效靶细胞相互作用，并可测量卫星频率。该技术的应用意义延伸至癌症治疗领域，因为它能够用于研究自体细胞治疗中疗效的相关因素。使用硅胶母版制备纳米孔时，首先在一次性杯子中用塑料刀将PDMS Sylgard 180 4弹性体试剂盒的基础剂与固化剂按10:1的重量比充分混合，然后将混合物置于真空腔中脱气一小时。

然后将混合物倒入硅胶母模上，静置30分钟。接下来，为固化弹性体，先在室温下冷却1小时，再将组装件置于80摄氏度的烘箱中加热2小时。小心地将PDMS纳米孔阵列从硅胶母模上取下。

用透明胶带覆盖，留待实验前一天使用。实验当天，在5毫升培养基中传代500万个靶细胞。将500万个细胞于无菌15毫升锥形管中，以340 ×g离心5分钟，收集细胞沉淀。

吸除多余培养基，保留约 50 µL 培养基用于标记细胞。加入 150 µL 新鲜的细胞追踪红染料工作液，使用 P200 移液器充分混匀，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 20 分钟。使用血细胞计数板对从培养物中收获的效应细胞进行计数。

然后通过离心将500万个细胞在无菌的15毫升锥形管中沉淀。吸除多余培养基。随后加入5微摩尔的Vibrant D Cycle Violet染色剂新鲜工作液，并使用P200移液器重悬细胞。

将细胞与染料在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育20分钟，靶细胞和效应细胞分别加入6.8毫升和6.0毫升的RPMI-PLGH，通过移液混匀。然后缓慢将3.5毫升Fial Pack Plus加至每根试管底部，将两根试管在340 ×g条件下离心30分钟，离心过程中不设刹车和加速。准备纳米孔阵列：首先将7毫升预热的PBS转移至四孔板中。使用等离子氧化仪以乙醇清洁玻片底部。

将PDMS在高射频设置下处理30至45秒。然后将芯片放入PBS中。将培养板转移至生物安全柜中，吸除多余的PBS，在玻片的顶部和底部边缘涂上温热的1% noble agar以固定芯片。

确保在加入三毫升 PBS 后 10 分钟内不要让 PDMS 干燥，并吸除多余的琼脂。然后在纳米孔阵列上方加入三毫升 R 10 培养基，平衡约 10 分钟。在菲亚尔离心后，从每根试管的上层吸出五毫升培养基。

使用 P 1000 移液器时需小心，避免吸出含有细胞的层。收集离心管与培养基之间的白色细胞层，将细胞转移至新的无菌锥形管中。

现在用三毫升预热的RPMI-PLGH培养基将收获的效应细胞和靶细胞洗涤两次。最后一次离心后，吸去上清液，将细胞沉淀重悬于500微升R10培养基中，使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上计数活细胞，并从纳米孔阵列中吸去多余培养基。

然后加入 2 毫升新鲜的 R 10 悬浮液。再次确保纳米阵列表面既不太湿也不太干，因为这会影响细胞的分布。现在将 200 微升 R 10 中含有 1 × 10⁵ 个效应细胞的细胞悬液滴加到纳米阵列表面，静置 5 分钟使细胞沉降。

然后使用标准的组织培养显微镜确认细胞的预期分布情况。接下来，将1 × 10⁵个靶细胞溶于200 µL R10培养基中，接种至含有效应细胞的纳米孔阵列表面。5分钟后，通过显微镜评估细胞分布情况。

然后用2毫升R10轻柔冲洗纳米孔阵列，并将多余的培养基吸除至另一个无菌的15毫升锥形管中。用移液器加入3毫升预热的R10，其中包含3微升0.5毫摩尔的cyt绿色核酸染料以及60微升X in 5 LOR 647，通过移液操作充分混匀。现在将染色液轻柔地加入四孔板中，确保细胞不从孔中移位，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育15分钟，然后使用荧光显微镜（如Zeiss Observer Z1显微镜，配备电动载物台和Lambda DG-4光源系统）对纳米孔阵列进行成像。

启动软件和显微镜。检查透射光及其他荧光通道的信号强度。调整显微镜设置，以确保信噪比最大化，同时避免信号饱和。

现在打开nelle阵列的X和Y位置列表。将XY零位设为nelle阵列左上角七乘七nelle阵列模块中心，并将焦平面归零。设置XY位置与每个模块的中心重合，Z值则准确反映每个模块的焦平面位置。

现在将图像采集设置为线性模式并采集图像。完成第一次成像序列后，将纳米孔阵列放回细胞培养孵育箱中孵育六小时。注意避免振荡，以免引起细胞移位。

然后在第二个时间点重复采集图像。该高通量细胞毒性检测用于测量抗原特异性裂解的频率，其中标记的CD19特异性CAR阳性T细胞与标记的小鼠EL4靶细胞在纳米升阵列的各个微孔中共同孵育。靶细胞直方图显示的是含有单个效应细胞和单个靶细胞的微孔。

经过六小时的共孵育后，将无效应细胞的靶细胞匹配直方图用作阴性对照，以报告背景细胞死亡的发生频率。理想情况下，非特异性裂解的发生频率应达到较低水平，范围在2%至4%之间。纳米孔阵列可适用于延时成像，从而实现对效应细胞与靶细胞结合及后续细胞死亡过程的观察。在此实验中，未标记的CAR阳性T细胞与NA-LM6-GFP靶细胞在NOL中进行共孵育，并接受动态监测。

当在培养基中加入 Annexin V 时，凋亡细胞会被标记为红色。掌握该技术后，按照本方案可在 10 至 12 小时内正确完成实验。其他方法如微流控抓取技术也可用于测定细胞的细胞因子分泌谱。