生物质的使用限制金额高效的染色质免疫沉淀
May 1st, 2013
我们描述了一个可靠的方法，使用的主要的T细胞染色质免疫沉淀。该方法是建立在标准的方法，但使用一组特定的条件和试剂，提高效率有限的数量的细胞。重要的是，在数据分析阶段的详细描述。
以下实验的总体目标是检测 DNA 结合蛋白（如转录因子）的结合或 his 结石修饰。这是通过首先准备染色质作为第二步来实现的。设置染色质免疫沉淀反应以拉下与目标蛋白质结合的 DNA 片段。
接下来，通过 PCR 扩增与目标蛋白质结合的 DNA 片段。获得的结果显示，与基于 QPCR 分析的未结合区域相比，与目标蛋白质结合的 DNA 片段的倍数富集。这种方法可以帮助回答转录、染色质和表观遗传学领域的关键问题，例如何时何地存在不同的修饰或未修饰的蛋白质。
在 DNA 上，虽然这种方法可以提供对 T 细胞基因调控的见解。它也可以应用于其他系统，例如 B 淋巴细胞、白血病样本和永生化细胞系。本实验的染色质将从小鼠脾幼稚 CD 四个 T 细胞制备。
要开始此程序，将 37% 甲醛添加到终浓度为 1% 的 DMEM 中的 CD 四个 T 细胞悬液中，并在室温下轻轻摇动 15 分钟。这将交联 DNA 蛋白复合物。通过添加 1 摩尔甘氨酸至终浓度为 125 毫摩尔来终止交联。
在室温下继续摇晃 5 分钟。通过在 4 摄氏度下以 200 G 离心 5 分钟来收集细胞。去除上清液，将细胞重悬于 5 毫升含有蛋白酶抑制剂的冰冷 PBS 中，再次离心，最后一次洗涤后以这种方式洗涤细胞共 3 次，弃去上清液，将细胞重悬于 1 毫升含有蛋白酶抑制剂的冰冷细胞裂解缓冲液中。
将细胞悬液转移至 1.7 mL 微量离心管中，并在冰上孵育 15 分钟。在 4 摄氏度下以 200 G 离心 5 分钟，收集细胞核。小心丢弃上清液，将细胞核重悬于 500 μL 细胞核裂解液中。
含有蛋白酶抑制剂的缓冲液在冰上孵育 15 分钟。接下来，使用 1.6 毫米探针和输出水平为 4 的超声处理细胞 15 秒。将样品在冰上冷却 1 到 2 分钟以防止过热，然后再次超声处理 15 秒。
重复超声处理和冷却，共离心 4 次，声波染色质在 16， 000 G 下离心 5 分钟。在四四摄氏度。将澄清的上清液收集在新的微量离心管中。
取出 20 微升等分试样的透明上清液。加入 DNA 上样染料，并通过 2% agro 凝胶电泳检查超声处理的 DNA。对于大多数应用，超声处理的 DNA 的理想大小为 200 至 500 个碱基对。
最后，使用紫外分光光度计测定 DNA 浓度。剪切的染色质可立即用于建立染色质免疫沉淀反应，或储存在零下 80 摄氏度下进行染色质免疫沉淀，或将超声处理的染色质稀释至 5 至 10 μg/mL，总体积为 2 mL，在含有蛋白酶抑制剂的 ChIP 稀释缓冲液中。此程序中的所有步骤都必须在零到四摄氏度下进行。
节省 10%，在本例中为 200 微升，稀释的超声染色质作为输入，将剩余样品的 450 微升储存在冰上，放入四个 1.7 毫升微量管中，每个管标记为同种型对照和目标抗体。如果使用相同同种型的多种抗体，则单个同种型对照就足够了 要进行此分析，请根据所用抗体或同种型对照的特异性向相应试管中添加 2 至 5 μg 特异性抗体。在 4 摄氏度下摇动试管过夜，以便在第二天早上形成染色质抗体复合物。
向每种混合物中加入 25 μL 蛋白 G 磁珠，并在 4 摄氏度下摇动至少两个小时。接下来，将离心管放在磁力架上 15 到 20 秒，让磁珠聚集在磁化侧。小心地通过抽吸去除溶液，不要干扰珠子。
加入 1 毫升低盐洗涤液，在 mutator 上轻轻摇动 5 分钟。使用磁力架收集珠子并去除洗涤液。再次加入 1 毫升低盐洗涤液，轻轻摇动 5 分钟。
去除低盐洗涤液后，加入 1 毫升高盐洗涤液，振荡 5 分钟。使用磁力架收集珠子并去除洗涤液。用高盐洗涤液重复洗涤。
去除高盐洗涤液后，加入 1 毫升氯化锂洗涤液，摇动 5 分钟。使用磁力架收集珠子并去除洗涤液。重复氯化锂洗涤一次。
加入 1 毫升 TE 溶液，摇动 5 分钟。使用磁力架收集珠子并去除洗涤液。在室温下加入 250 μL Elucian 缓冲岩石 15 分钟，从珠子中洗脱 DNA。
吸出 EIT 并将此材料保存在新的 1.7 毫米离心管中。再次重复，将两个 elu 混合，丢弃珠子以反转交联。向逃脱的 DNA 中加入 5 摩尔氯化钠（终浓度为 0.3 摩尔）和 1 μL RNA。
A 向之前保存的起始量中加入 400 μL 洗脱缓冲液。要使每个输入的体积为 500 微升，将氯化钠加入 0.3 摩尔的 1 微升 RNA、10 微升 0.5 摩尔的 EDTA、20 微升的 1 摩尔 tris、HCL pH 6.5 和 1 微升蛋白酶 K.密封试管并在第二天早上在 65 摄氏度的干燥加热块中孵育过夜， 让试管冷却至室温。然后加入 1 毫升 100% 乙醇，在零下 80 摄氏度下孵育 2 小时至过夜。
要沉淀 DNA 离心机，请将试管以 16， 000 G 离心 15 分钟。为了沉淀 DNA 洗涤液，DNA 沉淀用 70% 乙醇沉淀一次并风干，沉淀重悬，DNA 沉淀在 100 微升高压灭菌蒸馏水中，使用 kayak、Quick Spin 柱纯化 DNA，并在总体积为 50 μL 的洗脱缓冲液中洗脱。该 DNA 现在可用于 PCR 扩增。
分析 QPCR 储备以获得对照未结合区域的完全富集是该方案最重要的方面。使用 QPCR 软件，转到编辑器并用其标准曲线值标记包含各种稀释液的输入样品的孔。还要按照 PCR 板的布局，用未知芯片样品标记孔。
使用标准曲线在未知、特异性和同种型样品中插入 DNA 量，可以评估和匹配样品中发现的浓度范围内所有引物对的质量和效率。转到子集编辑器并标记子集，包括带有输入样品的孔以及未知的芯片样品。未知样品将使用从已知浓度的输入样品生成的标准曲线进行量化，用于分析。
PCR 扩增完成后，使用 ABS 定量进行分析。最大二阶导数选择要分析的子集，然后按 。好。
按计算，这将使用已知浓度的输入样品生成标准曲线，并显示未知样品中存在的 DNA 的绝对量，如果 she DNA 的质量良好并且引物特异性结合到目标区域，则 PCR 效率应接近 2。使用 TM 进行熔解曲线分析，如果可用，则调用相同的子集。单个峰表示仅扩增了一种特定产物。
特异性 DNA 的扩增也可以通过 PCR 产物电和 DNA 分子量标准通过 AROS 凝胶进行检测。然后，获得的数据将导出为制表符分隔的文本文件，该文件可以在 Microsoft Excel 中打开以进行进一步分析。将特异性抗体的 DNA 量与靶向引物的同种型对照除以。
对对照区域引物重复此步骤。如果相同同种型的多种抗体用于不同的免疫沉淀，则使用来自相同同种型对照的值对每种抗体进行归一化。此外，如果使用多个靶向引物对，则应使用来自单个对照引物修复组的 DNA 数量来对每个靶标进行归一化。
输出值表示相对于非特异性抗体的每个位置的特异性抗体免疫沉淀倍数富集背景免疫沉淀将靶向引物的倍数富集与对照区引物的倍数富集除以对照区引物的倍数富集，以获得相对于对照未结合区域的富集。重要的是，请注意，由于每个样品生成了包含总输入 DNA 的标准曲线，因此从标准品中插值的每个免疫沉淀值都已被机器软件标准化并表示为总输入分数。此处演示的染色质免疫沉淀方案通过使用扩增基因组未结合区域的引物对来控制 PCR 中使用的 DNA 量的差异（如果有），从而用作上样对照。
在这个例子中，小鼠 β 肌动蛋白基因的编码区被用作未与目标蛋白质结合的区域，小鼠上的转录因子和脂肪结合位点，IL 二启动子被用作靶区。此 Excel 电子表格快照描述了在黄色、绿色和紫色框中的三个实验重复序列的分析数据中描述的计算方案的使用，其中包含三个技术重复。每个都用于计算折叠富集。
如果选择相同的同种型对照和特异性抗体，则可以比较与基因组不同区域结合的蛋白质的相对富集。如果抗体的特异性良好，通常会观察到未结合对照区域的富集 2 到 10 倍。该图显示了从小鼠中分离的常规 CD 4 T 细胞和调节性 CD 4 T 细胞的芯片实验结果。
用 PMA 和离子霉素刺激一小部分常规 T 细胞 30 分钟。观察到 NFA 转录因子、N 脂肪 C 1 和 NFA C 2 在 IL 2 启动子处的相对富集，此处描述为未结合区域上的倍数富集遵循此程序。其他方法（如 ChIP-seq）可用于解决转录因子的全局占用率或响应刺激的表观遗传标记的全球变化。
观看此视频后，您应该对如何使用有限数量的细胞进行染色质免疫沉淀，并分析 QPCI 数据以确定转录因子条带与对照未结合区域相比
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概述
本文介绍了一种用于染色质免疫沉淀（ChIP）的稳健方法，该方法使用初级T细胞，提高了有限细胞数量的效率。它包括对数据分析阶段的详细描述。
关键研究组成部分
科学领域
- 染色质生物学
- 转录调控
- 表观遗传学
背景
- 染色质免疫沉淀是一种用于研究蛋白质-DNA相互作用的技术。
- 初级T细胞对理解免疫反应至关重要。
- 需要有效的方法来处理有限的细胞样本。
- 数据分析对解释ChIP结果至关重要。
研究目的
- 检测DNA结合蛋白和组蛋白修饰的结合。
- 改进初级T细胞的ChIP方法。
- 提供对结果数据的全面分析。
使用的方法
- 从初级T细胞中制备染色质。
- 设置染色质免疫沉淀反应。
- 使用PCR扩增与感兴趣蛋白质结合的DNA片段。
- 定量PCR（QPCR）分析以评估倍数富集。
主要结果
- 成功检测到蛋白质-DNA相互作用。
- 在有限细胞数量的ChIP中提高了效率。
- 对结合事件和组蛋白修饰进行了详细分析。
- 对转录、染色质和表观遗传动力学的洞察。
结论
- 该方法增强了对转录因子和组蛋白修饰的研究。
- 它为染色质和表观遗传学研究人员提供了一个有价值的工具。
- 未来的应用可能包括免疫细胞生物学的更广泛研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) enables target validation by mapping protein-DNA interactions, a critical step in de-risking therapeutic hypotheses. This protocol improves sensitivity and reproducibility for limited primary cell samples, supporting early discovery workflows where material is constrained. Quantitative analysis via standard curves and qPCR provides predictive confidence in binding specificity, informing go/no-go decisions in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates transcription factor binding to specific genomic regions, clarifying mechanistic hypotheses.
- Operational Value: Enables functional validation of targets using limiting biomass, reducing reliance on large-scale cell culture.
- Predictive Value: Standard curve normalization allows quantitative comparison across conditions, supporting data-driven target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces enriched DNA fragments suitable for PCR-based quantification, enabling reproducible readouts.
- Standardization: Use of input DNA standard curves controls for primer efficiency and sample variability, improving assay consistency.
- Scalability: Protocol adapted for low-input systems, facilitating screening in primary or rare cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker-aligned studies by linking protein binding to functional genomic regions in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes specific binding from background using isotype controls and unbound genomic regions, reducing false positives.
- Preclinical Alignment: Enables chromatin state analysis in primary immune cells, relevant for immunomodulator target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly when working with primary or limited primary cell samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining where and when proteins bind DNA in chromatin.
- Screening: Generates quantitative ChIP-qPCR data suitable for evaluating compound effects on protein-DNA interactions.
- Analytics: Absolute quantification via standard curves enables inter-sample comparison and statistical rigor.
- Translational Research: Connects binding events to functional outcomes in primary T cells, relevant for immune-targeted therapies.
- Enterprise Reuse: Standardized workflow allows reuse across antibody and target panels in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-DNA interactions, increasing confidence in target biology.
- Operational Value: Standardized lysis, immunoprecipitation, and wash steps improve reproducibility across users and sites.
- Strategic Value: Enables early de-risking of targets by confirming chromatin engagement, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Quantitative enrichment data supports risk-adjusted prioritization of targets for lead identification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin handling, antibody validation, and qPCR data analysis.
- Dependent on sonication equipment for consistent chromatin shearing and magnetic separation tools for immunoprecipitation.
- Necessitates standardized reagent lots and antibody qualification to ensure reproducibility across experiments.
- Adaptation to different cell types may require optimization of crosslinking and lysis conditions.
- Limited by antibody specificity and the need for appropriate control regions to distinguish specific from nonspecific binding.
