Name: 生物质的使用限制金额高效的染色质免疫沉淀 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: 学习使用有限数量原代T细胞进行高效染色质免疫沉淀的方法，通过PCR扩增和定量PCR分析检测蛋白-DNA相互作用及组蛋白修饰，为转录调控和表观遗传学研究提供可靠工具。

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本工作得到美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 CA141009 和 GM39067 的资助。我们感谢 E. Parnell 和 R. Yarrington 对文稿部分提出的修改意见。

1. 小鼠脾脏初始CD4 T细胞的分离
<ol>
 <li>按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的协议，以人道方式处死小鼠。解剖取出脾脏，并置于含有10 ml DMEM（含10% FBS）的培养皿中。</li>
 <li>使用两片载玻片的磨砂端轻轻碾压脾脏，以释放脾细胞。将细胞悬液转移至15 ml锥形离心管中。</li>
 <li>在4 °C条件下，以200 × g（对于典型转子直径的临床离心机，约为1,200 rpm）离心5分钟，收集细胞。</li>
 <li>用2 ml ACK缓冲液重悬细胞，室温（RT）裂解红细胞1分钟。加入8 ml含FBS的DMEM终止反应。</li>
 <li>在4 °C条件下，以200 × g离心5分钟，收集细胞。</li>
 <li>用5 ml含FBS的DMEM重悬细胞，并通过70 μm细胞筛滤器（BD Falcon，货号# 352350）。计数细胞后，按照制造商说明书使用CD4分离试剂盒（Miltenyi，货号# 130-095-248）分离初始型CD4 T细胞。在4 °C条件下，以200 × g离心5分钟收集初始型CD4 T细胞。用10 ml含FBS的DMEM重悬细胞。</li>
</ol>
2. 染色质的制备
<ol>
 <li>向 DMEM 细胞悬液中加入 37% 甲醛，使其终浓度为 1%，并在室温下轻轻摇动（例如使用 Nutator）15 分钟，以交联 DNA:蛋白质复合物。</li>
 <li>加入 1 M 甘氨酸至终浓度 125 mM 以终止交联反应，继续在室温下摇动 5 分钟。</li>
 <li>在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟收集细胞。</li>
 <li>用含蛋白酶抑制剂的 5 ml 冰冷 PBS 重悬细胞进行洗涤。总共用含蛋白酶抑制剂的冰冷 PBS 洗涤 3 次，并在 4 °C 下离心收集细胞。</li>
 <li>将细胞重悬于 1 ml 含蛋白酶抑制剂的冰冷细胞裂解缓冲液中，冰上孵育 15 分钟。可通过将少量细胞等分试样重悬于 0.4% 台盼蓝溶液（Sigma，货号 T8154）中并在显微镜下观察，以评估细胞裂解效率。</li>
 <li>在 4 °C 条件下以 200 × g（通常约为 1,200 rpm）离心 5 分钟收集细胞核，小心弃去上清液。</li>
 <li>将细胞核重悬于 500 μl 含蛋白酶抑制剂的核裂解缓冲液中，冰上孵育 15 分钟。</li>
 <li>使用 Misonix Sonicator 3000（探头尺寸 1.6 mm）进行超声处理：输出功率设为 4，每次超声 15 秒，共重复 4 次，全程在冰上操作。每次超声后需将样品在冰上冷却 1–2 分钟，以防止样品过热。过热可能导致交联逆转。</li>
 <li>在 4 °C 条件下以 16,000 × g（在微量离心机中约为 13,200 rpm）离心超声处理后的染色质 5 分钟。</li>
 <li>取 20 μl 清亮上清液，加入 DNA 上样染料，通过 2% 琼脂糖凝胶电泳检测超声破碎后的 DNA（大多数应用中理想的 DNA 片段大小为 200–500 bp）。</li>
 <li>使用紫外分光光度计测定 DNA 浓度。剪切后的染色质可立即用于染色质免疫沉淀反应，或储存于 -80 °C。通常每只小鼠 2–3 × 106 个纯化的 CD4 T 细胞可获得 7.5–10 μg DNA。</li>
</ol>
3. 染色质免疫沉淀（所有步骤必须在 0-4 °C 下进行）
<ol>
 <li>在含有蛋白酶抑制剂的 ChIP 稀释缓冲液中，将超声处理后的染色质稀释至 DNA 浓度为 5–10 μg/ml（总体积 = 1 ml）。</li>
 <li>保留 100 μl（10%）作为输入样品，置于冰上保存。</li>
 <li>将 450 μl 样品分别分装至两个标记为同型对照（小鼠或兔 IgG）和目标抗体的 1.7 ml 微量离心管中。若使用多个相同同型的抗体，则单个同型对照足以完成该分析。若使用不同动物来源或不同同型的抗体，则需要多个同型对照。</li>
 <li>根据所用抗体的特异性，向相应管中加入 2–5 μg 的特异性抗体或同型对照抗体。</li>
 <li>将离心管置于 4 °C 条件下，在旋转仪（Nutator）上轻轻摇动过夜，以促进染色质-抗体复合物的形成。</li>
 <li>向上述混合物中加入 25 μl 蛋白 G 磁珠（悬浮珠的 1:1 悬液），并在 4 °C 条件下继续摇动至少 2 小时。供应商提供的磁珠可直接使用。</li>
 <li>将微量离心管置于磁力架上，使磁珠吸附至管壁的磁化侧。</li>
 <li>小心吸取上清液，避免扰动磁珠。</li>
 <li>加入 1 ml 低盐洗涤液，在旋转仪上轻柔摇动 5 分钟。使用磁力架收集磁珠，并移除洗涤液。重复一次。</li>
 <li>加入 1 ml 高盐洗涤液，在旋转仪上摇动 5 分钟。使用磁力架收集磁珠，并移除洗涤液。重复一次。</li>
 <li>加入 1 ml 氯化锂洗涤液，在旋转仪上摇动 5 分钟。使用磁力架收集磁珠，并移除洗涤液。重复一次。使用 LiCl 可有效去除染色质与磁珠之间的非特异性结合。</li>
 <li>加入 1 ml TE 溶液，在旋转仪上摇动 5 分钟。使用磁力架收集磁珠，并移除洗涤液。</li>
 <li>通过加入 250 μl 洗脱缓冲液从磁珠中洗脱 DNA，在室温下摇动 15 分钟。用移液器吸取洗脱液，将此样品保存至新的 1.7 ml 微量离心管中。重复一次，并合并两次洗脱液。弃去磁珠。</li>
 <li>向洗脱的 DNA 中加入 5 M NaCl 至终浓度为 0.3 M，并加入 1 μl RNase A（20 mg/ml）。向第 3.2 步保存的输入样品中加入 400 μl 洗脱缓冲液，使总体积达到 500 μl。向输入样品中加入 NaCl 至终浓度 0.3 M、1 μl RNase A、10 μl 0.5 M EDTA、20 μl 1 M Tris-HCl（pH 6.5）和 1 μl 蛋白酶 K（20 mg/ml）。</li>
 <li>将离心管置于 65 °C 干式加热块中孵育过夜。为防止样品蒸发，应密封管口或在管盖上加压以防止其开启。也可使用杂交炉进行孵育。</li>
 <li>让离心管冷却至室温。加入 1 ml 100% 乙醇，在 -80 °C 条件下孵育 2 小时至过夜，以沉淀 DNA。</li>
 <li>在 16,000 × g 离心 15 分钟以收集 DNA 沉淀。用 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀一次，并将沉淀空气干燥。将 DNA 沉淀重悬于 100 μl 经高压灭菌的蒸馏水中。</li>
 <li>使用 QiaQuick 离心柱纯化 DNA，并用 50 μl 洗脱缓冲液进行洗脱，总洗脱体积为 50 μl。所得 DNA 可直接用于 PCR 分析。</li>
</ol>
4. PCR 反应的准备（所有步骤必须在冰上进行）
<ol>
 <li>收集所有来自ChIP实验及其相应的input样本的DNA样本。同时，准备靶向区域以及对照区域的全部PCR试剂和引物。使用“热启动”Taq DNA聚合酶。本实验将采用基于SYBR Green的方法定量DNA扩增，但如有需要，也可使用qPCR预混试剂盒。</li>
 <li>对input DNA进行系列稀释，以在qPCR分析中建立标准曲线：例如，在洗脱缓冲液（来自步骤3.18中的QiaQuick离心柱）中分别稀释为10%、1%、0.1%和0.01%。该标准曲线模板的浓度范围和梯度可根据预期的ChIP富集水平等进行调整。将10 μl input DNA样本分别加入96孔板（Genemate，货号 T-3182-1）的相应孔中，每样本设两个复孔。</li>
 <li>将同型对照抗体及特异性抗体的ChIP DNA各取10 μl，分别加入相应孔中，每样本设三个复孔。</li>
 <li>配制“主混合液”，其中包含靶向引物或对照引物（每种引物的终浓度为0.1 μM），并将10 μl主混合液分别加入各孔中。例如，在下方模板中，将含靶向引物的主混合液加入标记为绿色的孔中，将含对照引物的主混合液加入标记为红色的孔中。</li>
 <li>用光学塑料封膜覆盖PCR板，然后在临床离心机中以500 × g（约1,200 rpm）离心1分钟，室温操作，使所有液体沉降至孔底。</li>
 <li>启动PCR反应。本示例中将使用Roche公司的LightCycler 480 II仪器，并运行LightCycler 480SW 1.5软件进行qPCR检测。</li>
</ol>
预孵育：1个循环：95 °C/5分钟。
扩增：40-45个循环：94 °C/5秒，60 °C/5秒，72 °C/10秒（退火温度应比引物的熔解温度低2-3 °C）。
熔解曲线：1 个循环。
冷却：1 个循环。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>1</td>
 <td>2</td>
 <td>3</td>
 <td>4</td>
 <td>5</td>
 <td>6</td>
 <td>7</td>
 <td>8</td>
 <td>9</td>
 <td>10</td>
 <td>11</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>A</td>
 <td>10% 输入</td>
 <td>10% 输入</td>
 <td>同型对照</td>
 <td>特异性抗体</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B</td>
 <td>1% 输入</td>
 <td>1% 输入</td>
 <td>同型对照</td>
 <td>特异性抗体</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C</td>
 <td>0.1% 输入</td>
 <td>0.1% 输入</td>
 <td>同型对照</td>
 <td>特异性抗体</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D</td>
 <td>0.01% 输入</td>
 <td>0.01% 输入</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E</td>
 <td>10% 输入</td>
 <td>10% 输入</td>
 <td>同型对照</td>
 <td>特异性抗体</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>F</td>
 <td>1% 输入</td>
 <td>1% 输入</td>
 <td>同型对照</td>
 <td>特异性抗体</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>G</td>
 <td>0.1% 输入</td>
 <td>0.1% 输入</td>
 <td>同型对照</td>
 <td>特异性抗体</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H</td>
 <td>0.01% 输入</td>
 <td>0.01% 输入</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
绿色：使用靶向区域引物。
红色：使用对照区引物。
5. 分析
<ol>
 <li>设置qPCR软件以定量DNA的绝对量。重要的是，使用标准曲线对未知的特异性样本和同型对照样本中的DNA量进行插值，可评估并匹配所有引物组在样本中所含浓度范围内的质量和扩增效率。此外，与使用ΔΔCq及相关方法相比，该方法还能更可靠地将Cq（Ct或Cp）值转换为最终的相对倍数富集结果。</li>
 <li>进入样本编辑器，标记含有不同稀释度输入样本（10%、1%、0.1%和0.01%）的孔，并输入其对应的标准曲线值。同时，按照PCR板的实际布局，标注含有未知ChIP样本的孔。在其他qPCR仪器使用的等效软件中，应相应地为每对引物、标准曲线值以及实验样本和同型对照样本指定对应的反应子集。</li>
 <li>在LightCycler软件中，进入子集编辑器，标记包含输入样本和未知ChIP样本的子集。未知样本将通过由输入样本已知浓度生成的标准曲线进行定量分析。在其他qPCR仪器使用的等效软件中，应为每对引物的所有反应指定相应的子集。</li>
 <li>PCR扩增完成后，使用“绝对定量/二阶导数最大值”（Abs Quant/2nd Derivative Max）进行分析，选择待分析的子集并点击“确定”。在其他qPCR仪器使用的等效软件中，将每个子集的Cq值转换为对应的DNA量。</li>
 <li>点击“计算”按钮，软件将利用输入样本的已知浓度生成标准曲线，并显示未知样本中DNA的绝对量。</li>
 <li>如果剪切DNA的质量良好，且引物能特异性结合目标区域，则PCR扩增效率应接近2。</li>
 <li>如具备条件，对同一子集使用“Tm Calling”进行熔解曲线分析。单一峰形表明仅扩增出一种特异性产物。也可通过将PCR产物与DNA分子量标记物一同在琼脂糖凝胶中电泳，来验证特异性DNA的扩增。</li>
 <li>将数据导出为制表符分隔的文本文件，可在Microsoft Excel中打开以进行进一步分析。</li>
 <li>在Microsoft Excel中，将特异性抗体样本在目标引物处的DNA量除以同型对照的DNA量。对对照区域引物重复此步骤。若不同免疫沉淀实验中使用了多个相同同型的抗体，应使用同一同型对照的数值对每个样本进行归一化处理。此外，若使用了多对目标引物，应使用单一对照引物组的DNA量对各个目标进行归一化（图1和图2）。所得数值表示在各检测位点，特异性抗体免疫沉淀相对于非特异性抗体背景沉淀的富集倍数。</li>
 <li>将目标引物相对于同型对照的富集倍数除以对照区域引物相对于同型对照的富集倍数，以获得相对于对照非结合区域的相对富集值（图1）。重要的是，由于每个样本的总输入DNA均用于生成标准曲线，因此机器软件已将上述从标准曲线插值得到的每个免疫沉淀数值归一化，并以总输入量的分数形式表达。</li>
 <li>若免疫沉淀或洗涤所用缓冲液的严谨性过高，可能出现使用特异性抗体进行免疫沉淀的样本可获得强扩增信号，而同型对照样本则无扩增信号的情况。在此情形下，建议分别从目标区域和非结合区域的特异性抗体ChIP样本中减去同型对照ChIP的DNA量。相对富集倍数可通过将目标区域的差值除以非结合区域的差值来计算（图3）。</li>
</ol>

<ol><li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).</li>
<li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 37-47 (2002).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+nuclear+localization+of+NFAT+in+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+independent+of+calcineurin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity.</a> J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).</li>
<li>Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct1+is+a+switchable%2C+bipotential+stabilizer+of+repressed+and+inducible+transcriptional+states%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28microChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+localization+of+replication+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide localization of replication factors.</a> Methods. 57, 187-195 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).</li>
<li>Sikes, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+method+for+rapid+and+sensitive+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

上述方案提供了一种利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术从原代淋巴细胞中准确量化DNA富集的可靠方法。该方案具有可靠性的主要原因是包含了生物学重复。上述方案采用了三个生物学重复，分别独立计算其富集程度，然后对结果取平均值以获得富集水平，并计算标准差以评估变异性。对于每个样本，还进行了三次技术重复，以消除样本处理、PCR扩增等过程中的操作差异。技术重复之间的变异程度通常远小于不同生物学样本之间的变异。可靠性的第二个原因是设置了多种技术对照，包括同型匹配的对照抗体、标准输入DNA曲线，以及针对非特异性基因组区域的对照扩增子。
上述方法的局限性与通常使用染色质免疫沉淀（ChIP）时遇到的问题相似。该方法的空间分辨率相对较低，其限制因素在于超声处理对DNA片段的剪切作用。因此，该方法的分辨能力仅约为500 bp的DNA片段。对于需要更高分辨率的实验，可采用微球菌核酸酶消化法。8 ，或对回收片段进行外切核酸酶消化（ChIP-exo）9,10 此外，上述染色质免疫沉淀（ChIP）样品制备可与回收片段的高通量测序相结合（ChIP-seq、ChIP-seq ...

<table><tbody><tr><td>甲醛</td><td>Sigma</td><td>F-8775</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Roche</td><td>04693116001</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Protein G 磁珠</td><td>Active Motif</td><td>101945</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>RNase A (20 mg/ml)</td><td>EMD Millipore</td><td>556746</td><td>-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>蛋白酶K (20 mg/ml)</td><td>Roche</td><td>03115879001</td><td>溶于 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, pH 8.0</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA 聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>10966-034</td><td>-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7567</td><td>-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>1 M 甘氨酸</td><td></td><td></td><td>室温保存</td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液 (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)</td><td></td><td></td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>核裂解缓冲液 (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)</td><td></td><td></td><td>室温保存</td></tr><tr><td>ChIP 稀释缓冲液 (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)</td><td></td><td></td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>低盐洗涤缓冲液 (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)</td><td></td><td></td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>高盐洗涤缓冲液 (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)</td><td></td><td></td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>LiCl 洗涤缓冲液 (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% 脱氧胆酸钠, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)</td><td></td><td></td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>TE 缓冲液 (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>洗脱缓冲液 (1% SDS; 0.1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td>现配现用</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td></td><td></td><td>室温保存</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td></td><td></td><td>室温保存</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6.5</td><td></td><td></td><td>室温保存</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;特异性试剂表&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Clay Adams 品牌旋转混合仪</td><td>Becton Dickinson</td><td>型号：421105</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Masonix Sonicator 3000</td><td>QSonica</td><td>型号：S3000</td><td></td></tr><tr><td>紫外分光光度计</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>VWR</td><td>13259-030</td><td></td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>VWR</td><td>80085-692</td><td></td></tr><tr><td>台式制冷离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>型号：Allegra X-12R</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器设备表&lt;/strong&gt; </td></tr></tbody></table>

使用有限生物量进行高效的染色质免疫沉淀

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种广泛使用的方法，用于确定活细胞染色质中不同蛋白质与DNA之间的相互作用。这些蛋白质包括序列特异性的DNA结合转录因子、组蛋白及其不同的修饰状态、RNA聚合酶等酶类及辅助因子，以及DNA修复相关组分。尽管该技术应用广泛，但目前仍缺乏针对实验材料制备和精确分析的最新且详细的实验方法，难以实现对相互作用进行准确定量。由于此类信息的缺失，加之与所有免疫沉淀实验类似，ChIP实验的条件需针对新的实验体系重新优化，因此该检测方法容易产生不准确或定量性差的结果。
本方案最终源于转录因子与DNA相互作用的开创性研究1,2，但针对难以获取的细胞类型，在灵敏度和可重复性方面进行了多项改进。该方案已成功应用3,4，既可通过qPCR定量DNA富集程度，也可采用下述方案的一种半定量变体。
这种对PCR扩增产物的定量分析通过计算方法完成，是该检测方法中的一个限制因素。重要的对照和其他注意事项包括使用同型匹配的抗体，以及对基因组DNA中的对照区域进行评估，例如选择一个预测不会被目标蛋白结合的基因间区域（或预期在实验条件下不会发生改变的区域）。此外，对每个ChIP样品的输入材料均需建立标准曲线，以确定实验样品中富集的绝对水平。使用标准曲线有助于校正引物组之间的差异（无论其设计多么严谨），以及单个引物组在不同模板浓度范围内扩增效率的差异。我们的实验方案与其他已有方案5-8的不同之处在于，我们对后续的分析阶段进行了更为全面的覆盖。

本文所展示的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案通过使用一对引物扩增基因组中未结合的区域，从而对PCR中使用的DNA量的差异进行校正，该区域可作为“上样对照”。在图3所示的示例中，我们选用小鼠Actb基因的编码区作为目标蛋白不结合的区域，而以小鼠Il2基因启动子上转录因子NFAT的结合位点作为目标区域。或者，也可选择距离目标区域数千碱基对上游或下游、已知无目标蛋白结合的区域作为对照。在设计目标区域的引物对时，理想的PCR产物大小约为100–200 bp。此外，还需通过计算机分析确认这些引物在基因组中其他位置无结合位点。
如果选用相同的一组同型对照抗体和特异性抗体，则可以比较蛋白质在基因组不同区域上的相对富集程度。同一目标区域上各种蛋白质的富集程度取决于所用抗体的特异性和亲和力，以及结合到DNA上的特异蛋白的含量。例如，组蛋白的染色质免疫沉淀（ChIP）实验通常会得到较高的富集值，而转录因子可能仅在响应多种细胞信号时才结合DNA，其富集值通常较低。如果抗体的特异性良好，我们通常会观察到相对于非结合对照区域有2至10倍...

我们介绍一种使用原代T细胞进行染色质免疫沉淀的稳健方法。该方法基于标准流程，但采用了一套特定的条件和试剂，可提高对有限数量细胞的操作效率。尤为重要的是，本文详细描述了数据分析阶段的具体步骤。

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种广泛使用的方法，用于确定不同蛋白质在活细胞染色质中与DNA的相互作用。

以下实验的总体目标是检测DNA结合蛋白（如转录因子）的结合或组蛋白修饰。首先准备染色质，作为第二步，进行染色质免疫沉淀反应，以富集与目标蛋白结合的DNA片段。接下来，通过 PCR 扩增与目标蛋白结合的 DNA 片段。根据 QPCR 分析结果，可获得目标蛋白结合的 DNA 片段相对于未结合区域的富集倍数。该方法有助于回答转录、染色质和表观遗传学领域中的关键科学问题，例如不同修饰或未修饰蛋白出现的时间和位置。在DNA方面，尽管该方法可为T细胞基因调控提供见解，但也适用于其他系统，例如B淋巴细胞、白血病样本以及永生化细胞系。本实验所用的染色质将从小鼠脾脏初始CD4 T细胞中制备。开始此实验步骤时，向DMEM中的CD4+ T细胞悬液中加入37%甲醛，使其终浓度为1%，室温下轻轻摇动15分钟，以交联DNA-蛋白质复合物。随后加入1 M甘氨酸，使其终浓度为125 mM，以终止交联反应。室温下继续振荡五分钟。在4°C条件下，以200 G离心五分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于5毫升含蛋白酶抑制剂的预冷PBS中，再次离心，以此方式洗涤细胞，共洗涤三次。最后一次洗涤后，弃去上清液，将细胞重悬于1毫升含蛋白酶抑制剂的预冷细胞裂解缓冲液中。将细胞悬液转移至1.7毫升微量离心管中，在冰上孵育15分钟。在4°C下以200 G离心5分钟收集细胞核。小心弃去上清液，将细胞核重悬于500微升核裂解液中。加入蛋白酶抑制剂的缓冲液在冰上孵育15分钟。接着，使用1.6毫米探头，输出功率为4，超声处理细胞15秒。将样品在冰上冷却1至2分钟以防止过热，再超声处理15秒。重复超声处理和冷却，共进行四次。在 16,000 G 条件下于 4 °C 离心超声处理后的染色质 5 分钟。在 4 °C 条件下，收集澄清的上清液至新的微量离心管中。取20微升澄清上清液。加入DNA上样染料，通过2%琼脂糖凝胶电泳检测超声处理后的DNA。大多数应用中，超声处理后DNA的理想片段大小为200至500个碱基对。最后，使用紫外分光光度计测定DNA浓度。剪切后的染色质可立即用于染色质免疫沉淀反应，或在-80°C下保存以用于染色质免疫沉淀。将染色质免疫沉淀稀释缓冲液（含蛋白酶抑制剂）中的超声处理后染色质稀释至总体积为2毫升，DNA浓度为每毫升5至10微克。本实验步骤中的所有操作均须在0至4°C条件下进行。将超声处理后的稀释染色质样本中剩余的部分取 450 微升，分装到四个标记为同型对照和目的抗体的 1.7 毫升微量离心管中，作为输入样本，保存 10%（在此示例中为 200 微升），并将输入样本置于冰上。如果使用多个相同同型的抗体，则一个同型对照即可满足要求。为进行此分析，根据所用抗体的特异性，向相应的管中加入 2 至 5 微克的特异性抗体或同型对照抗体。在 4 摄氏度下轻轻摇动孵育过夜，以使染色质与抗体形成复合物，次日早晨进

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