使用有限生物量进行高效的染色质免疫沉淀

以下实验的总体目标是检测DNA结合蛋白（如转录因子）的结合或组蛋白修饰。首先准备染色质，作为第二步，建立染色质免疫沉淀反应，以富集与目标蛋白结合的DNA片段。

接下来，通过 PCR 扩增与目标蛋白结合的 DNA 片段。根据 QPCR 分析结果，可获得目标蛋白结合的 DNA 片段相对于未结合区域的富集倍数。该方法有助于回答转录、染色质和表观遗传学领域中的关键科学问题，例如不同修饰或未修饰蛋白出现的时间和位置。

在DNA方面，尽管该方法可为T细胞基因调控提供见解，但也适用于其他系统，例如B淋巴细胞、白血病样本以及永生化细胞系。本实验所用的染色质将从小鼠脾脏初始CD4 T细胞中制备。

开始此实验步骤时，向DMEM中的CD4+ T细胞悬液中加入37%甲醛，使其终浓度为1%，室温下轻轻摇动15分钟，以交联DNA-蛋白质复合物。随后加入1 M甘氨酸，使其终浓度为125 mM，以终止交联反应。

室温下继续振荡五分钟。在4°C条件下，以200 G离心五分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于5毫升含蛋白酶抑制剂的预冷PBS中，再次离心，以此方式洗涤细胞，共洗涤三次。最后一次洗涤后，弃去上清液，将细胞重悬于1毫升含蛋白酶抑制剂的预冷细胞裂解缓冲液中。

将细胞悬液转移至1.7毫升微量离心管中，在冰上孵育15分钟。在4°C条件下以200 G离心5分钟收集细胞核。小心弃去上清液，将细胞核重悬于500微升核裂解液中。

加入蛋白酶抑制剂的缓冲液置于冰上孵育15分钟。接着，使用1.6毫米探头，输出功率为4，超声处理细胞15秒。将样品置于冰上冷却1至2分钟，以防止过热，再超声处理15秒。

重复超声处理和冷却，共进行四次。在 16,000 G 条件下于 4 °C 离心超声处理后的染色质 5 分钟。在 4 °C 条件下，收集澄清的上清液至新的微量离心管中。

取20微升澄清上清液。加入DNA上样染料，通过2%琼脂糖凝胶电泳检测超声处理后的DNA。大多数应用中，超声处理后DNA的理想片段大小为200至500个碱基对。

最后，使用紫外分光光度计测定DNA浓度。剪切后的染色质可立即用于染色质免疫沉淀反应，或在-80°C下保存以用于染色质免疫沉淀实验。将染色质用含蛋白酶抑制剂的ChIP稀释缓冲液稀释至总体积为2毫升，DNA浓度为每毫升5至10微克。本实验步骤中的所有操作均需在0至4°C条件下进行。

将超声处理后的稀释染色质样本中剩余的部分取 450 微升，分装至四个标有“同型对照”和“目标抗体”的 1.7 毫升微量离心管中，作为输入样本，保存 10%（在此示例中为 200 微升），置于冰上。若使用多个相同同型的抗体，则仅需一个同型对照即可。为进行此分析，根据所用抗体的特异性，向各相应管中加入 2 至 5 微克的特异性抗体或同型对照抗体。在 4 摄氏度下轻轻摇动孵育过夜，以使染色质与抗体形成复合物，次日早晨进行后续操作。

向每种混合物中加入25 µL蛋白G磁珠，并在4 °C下轻轻摇动至少两小时。随后将离心管置于磁力架上15至20秒，使磁珠吸附至管壁的磁化侧。用移液法小心吸除上清液，注意不要扰动磁珠。

加入1 mL低盐洗涤液，在突变仪上轻轻摇动5分钟。使用磁力架收集磁珠，并移除洗涤液。再次加入1 mL低盐洗涤液，在突变仪上轻轻摇动5分钟。

除去低盐洗涤液后，加入一毫升高盐洗涤液，摇动五分钟。使用磁力架收集磁珠，并移除洗涤液。用高盐洗涤液重复洗涤一次。

去除高盐洗涤液后，加入一毫升氯化锂洗涤液，振荡五分钟。使用磁力架收集磁珠，并移除洗涤液。重复氯化锂洗涤一次。

加入1毫升TE溶液，室温下轻轻摇动5分钟。将磁珠置于磁力架上收集，弃去洗涤液。加入250 µL洗脱缓冲液，室温下轻轻摇动15分钟，使DNA从磁珠上洗脱。

用移液器吸除 EIT，并将此材料保存至新的 1.7 毫米离心管中。重复一次，合并两次洗脱液，弃去珠子以逆转交联。向洗脱的 DNA 中加入五倍体积的 0.3 摩尔终浓度的氯化钠和 1 微升 RNAs。

向之前保存的上清液中加入 400 微升洗脱缓冲液。为使每个上清液的体积达到 500 微升，加入氯化钠至终浓度为 0.3 摩尔、1 微升 RNA、10 微升 0.5 摩尔 EDTA、20 微升 1 摩尔 Tris-HCl（pH 6.5）以及 1 微升蛋白酶 K。密封试管，并在干燥加热块中 65 摄氏度孵育过夜。次日早晨，让试管冷却至室温。然后加入 1 毫升 100% 乙醇，并在负 80 摄氏度下孵育 2 小时至过夜。

将DNA沉淀物在16,000 G离心15分钟。用70%乙醇洗涤DNA沉淀一次，空气干燥后，将DNA沉淀重悬于100微升经高压灭菌的蒸馏水中。使用Kayak快速旋转柱纯化DNA，并用50微升洗脱缓冲液进行洗脱，总体积为50微升。此DNA现已可用于PCR扩增。

对qPCR结果进行分析，以获得相对于对照未结合区域的完全富集，是本实验方案中最重要的环节。使用qPCR软件进入编辑界面，标记含有不同稀释度input样本的孔，并输入其标准曲线数值。同时，按照PCR板的实际布局，准确标注含有未知ChIP样本的孔。

利用标准曲线对未知的特异性样本和同型对照样本中的DNA含量进行插值，可评估并比较所有引物组在样本所含浓度范围内的质量和扩增效率。进入子集编辑器，标记包括含有输入样本的孔以及未知芯片样本在内的各个子集。未知样本将通过基于已知浓度输入样本生成的标准曲线进行定量分析。

PCR 扩增完成后，使用 ABS 定量法进行分析，选择二阶导数最大值。选择要分析的子集，然后按“确定”。

点击“计算”，系统将使用已知浓度的输入样本生成标准曲线，并显示未知样本中DNA的绝对数量。如果DNA质量良好，且引物能够特异性结合目标区域，则PCR扩增效率应接近2。如有条件，对相同子集进行熔解曲线分析并进行熔解温度（TM）判定。单峰表明仅扩增出一种特异性产物。

也可通过 AROS 凝胶电泳检测特定 DNA 的扩增，同时使用 DNA Ladder 和 PCR 产物进行分析。所获得的数据可导出为制表符分隔的文本文件，可在 Microsoft Excel 中打开以进行进一步分析。将特定抗体对应的 DNA 量除以靶向引物的同型对照的 DNA 量。

对对照区域引物重复此步骤。如果不同免疫沉淀实验中使用了相同同种型的多个抗体，则应使用相应同种型对照的数值对每个实验进行归一化。此外，如果使用了多个靶向引物对，则应使用单个对照引物对的DNA量对每个靶标进行归一化。

输出值表示在每个位置处，相对于非特异性抗体背景免疫沉淀的特异性抗体免疫沉淀富集倍数。将靶向引物的富集倍数除以对照区域引物的富集倍数，以获得相对于对照非结合区域的富集程度。重要的是，需注意由于使用每个样本的总输入DNA生成标准曲线，因此从标准曲线插值得到的每个免疫沉淀值已经由仪器软件归一化，并表示为总输入DNA的分数形式。此处展示的染色质免疫沉淀实验方案通过使用一对扩增基因组非结合区域的引物来控制PCR中所用DNA量的差异（如有），从而作为上样对照。

在此示例中，小鼠β肌动蛋白基因的编码区被用作未与目标蛋白及转录因子结合的区域，而小鼠IL-2启动子上的脂肪结合位点则被用作目标区域。该Excel表格的截图显示了计算方法的应用：黄色、绿色和紫色框内分别为三次实验重复的数据，每次实验包含三个技术重复，均用于计算富集倍数。

如果选择相同的一组同型对照抗体和特异性抗体，则可以比较蛋白质在基因组不同区域结合的相对富集程度。若抗体的特异性良好，通常可在结合区域观察到比非结合对照区域高2至10倍的富集。该图显示了利用从小鼠中分离的常规CD4 T细胞和调节性CD4 T细胞进行的染色质免疫沉淀（ChIP）实验结果。

采用PMA和离子霉素刺激一小部分常规T细胞30分钟。在此操作后，观察到NFAT转录因子、NFATc1和NFATc2在IL-2启动子区域的相对富集，此处以相对于非结合区域的富集倍数表示。其他方法（如ChIP-seq）可用于研究转录因子的全基因组结合情况，或响应刺激后表观遗传修饰的全局性变化。

观看本视频后，您应能充分理解如何使用有限数量的细胞进行染色质免疫沉淀，并学会分析 QPCI 数据，以确定转录因子结合区域与对照未结合区域的差异。