哺乳动物细胞中内质网定位mRNA的可视化

本实验的目的是可视化与内质网（er）结合的信使RNA。首先将哺乳动物组织培养细胞接种于盖玻片上。实验的第二步是用提取缓冲液处理细胞，以去除未与内质网结合的胞质mRNA。

接下来的步骤是快速固定细胞，并通过荧光原位杂交对 mRNA 进行染色。最后的步骤是成像并定量与内质网相关的荧光量。最终结果可以显示在不同条件下 mRNA 如何与该细胞器的表面相关联。

该方法有助于回答关键的细胞生物学问题，例如编码分泌蛋白的 mRNA 是否能够在内质网表面独立于核糖体或蛋白质合成而存在。本方法的可视化演示至关重要，因为它涉及若干较为复杂的细胞操作步骤。在实验前至少一天，将组织培养细胞接种于经酸处理的盖玻片上。COS-7 和 CHO 细胞均为合适的选择，因为它们具有较高的分泌蛋白产量和结构清晰的内质网。

若研究外源性 mRNA，应在细胞接种后一天进行转染，并继续培养细胞额外 18 小时，以允许 mRNA 表达。在实验当天，为实现高效的提取效率，盖玻片上的细胞汇合度不应超过 80%。为检测 mRNA 是否独立于翻译过程与内质网相互作用，可在提取前 30 分钟向细胞加入可破坏核糖体与 mRNA 之间相互作用的试剂或对照培养基。

本实验中使用翻译抑制剂，即纯净的麦迪霉素（Mycin）和高三尖杉酯碱（Homo Harringtonine）或 HHT。首先将新配制的提取液（含有 dig 十二烷基磺酸钠和 1×CHO 工作缓冲液）预热至 37 摄氏度。将加热块温度设定为 40 摄氏度，并插入倒置金属块以形成平坦的工作表面。

用水润湿金属块，然后覆盖一层新的多聚甲醛，并使用无RNA酶的手套和无尘纸将气泡压平。接下来，对于每对盖玻片，准备一个六孔板，将细胞洗涤并固定在其中四个孔中。向最后两个孔中各加入两毫升预热的CHO缓冲液。

加入2 mL固定液。然后将培养板置于37°C保存，直至需要时使用。在加热块上，为每张待处理的细胞盖玻片放置一滴100 µL的提取液。

现在使用钟表镊夹取已接种细胞的盖玻片，将其浸入含有 CHO 缓冲液的第一和第二孔中，以洗去培养基。然后迅速用吸水纸吸去盖玻片背面多余的缓冲液。

将盖玻片细胞面向下短暂地放入提取液中。10 秒后，将盖玻片细胞面向上转移至固定缓冲液中，至少放置 15 分钟。细胞提取步骤至关重要，可去除所有未与内质网结合的胞质 mRNA。

此外，准备一个对照盖玻片，其中细胞在不进行抽提的情况下直接固定。固定后的步骤：用 PBS 清洗这些未经抽提的对照细胞两次，然后在 PBS 和 TRITON X-100 中进行透化处理。

尽管不是必需的，但在细胞透化后，提取的细胞也应用相同的 PBS 和 Triton 溶液洗涤，以降低背景荧光。用 PBS 将载玻片洗涤两次，以去除固定剂和去污剂。接着，用一次性柠檬酸钠缓冲液或 SSC 将载玻片洗涤两次，其中 SSC 浓度为 60%。

然而，如果使用寡聚dT FISH探针对所有细胞进行染色，多聚mRNA会将fide水平降低至25%。接下来，用FISH探针配制杂交缓冲液。将FISH探针储备液用杂交缓冲液稀释至0.2微摩尔，并保持与fide相同的浓度。现在准备染色室。

在直径150毫米的培养皿底部装满水，然后将一片多聚甲醛膜漂浮在水面上，并将培养皿倒置。随着水的流出，多聚甲醛膜将附着在培养皿底部。

如果有气泡，请使用手套和无绒纸巾将其去除。每张盖玻片上用移液器加入100微升含有FISH探针的杂交溶液至石蜡膜上。然后将盖玻片细胞面朝下放置于溶液上。最后，在温热且加湿的孵育 chamber 中孵育5至24小时。

在鱼类染色时间结束前，准备一个无RNAs酶的清洗区域，将湿润的水平表面用水浸湿，并覆盖上帕拉膜条。用手套和无绒纸巾去除所有气泡。染色结束后，将每个盖玻片的孵育腔转移到工作区域，在清洗区域滴加一毫升洗涤缓冲液。

用于转移盖玻片的石蜡膜：首先，用移液器将半毫升鱼类洗涤缓冲液滴加至每片盖玻片边缘附近。液体将通过毛细作用被吸入盖玻片下方。接着，使用镊子将盖玻片从培养室中取出，并将其放置在洗涤缓冲液液滴上。

等待五分钟。在清洗区域使用新鲜的1毫升洗涤缓冲液滴，重复此清洗步骤三次。

同时，用70%乙醇清洗载玻片，并用无绒布擦拭干燥。然后，对于每一片盖玻片，取25微升DPI封片液滴加至载玻片上。用镊子夹起盖玻片，用无绒布擦拭其背面，以去除多余的洗涤缓冲液。随后将盖玻片细胞面朝下转移至封片液液滴上。

制备完成的载玻片可保存在 4 摄氏度，直至进行成像分析。七种细胞被转染了含有胎盘碱性磷酸酶或细胞色素 P450B1 的质粒，这些细胞或经去污剂提取后再固定，或直接固定，以确定这些 mRNA 中与内质网（ER）相关的比例。在两种样品中均量化了非核荧光信号，并计算了两种 mRNA 与内质网相关的比例。

约60%的细胞质组分与内质网（ER）相关，用于监测这些转录本与内质网的结合情况。在核糖体解离后，将转染的COST7细胞分别用对照培养基、嘌呤霉素（puromycin）或放线菌酮（HHT）处理，随后提取总RNA并固定mRNA。染色结果显示，在核糖体破坏后，ALPP mRNA仍与内质网保持结合，而CYP8P1 mRNA则不再与内质网结合。

mRNA 定量结果支持了这一观察结果，更重要的是显示所有样品中核内 mRNA 的水平保持一致。这些数据表明，一部分定位于内质网（ER）的 mRNA（例如 A LPP 转录本）在核糖体解离后仍保留在内质网表面。通过使用本方案，我们可以开始研究各种 mRNA 如何定位于不同的亚细胞区域（如内质网），尤其是在结合其他用于分析 mRNA 核输出的检测方法时。

该实验步骤可用于研究新合成的 mRNA 初始靶向内质网膜的过程。