在哺乳动物细胞中的内质网定位的mRNA的可视化

该程序的目的是可视化与内质网或 er 相关的信使 RNA。这是通过首先将哺乳动物组织培养细胞铺在盖玻片上来实现的。该程序的第二步是用提取缓冲液处理细胞，以去除未与 er 结合的细胞质 mRNA。

下一步是快速固定细胞并通过荧光原位杂交对 mRNA 进行染色。最后的步骤是成像，然后量化与 er 相关的荧光量。最终，结果可以显示 mRNA 在不同条件下如何与该细胞器表面相关联。

这种方法可以帮助回答关键的细胞生物学问题，例如编码分泌蛋白的 mRNA 是否可以独立于核糖体或蛋白质合成维持在 er 表面。这种方法的视觉演示至关重要，因为它涉及一些棘手的细胞作步骤。在实验成本 7 之前，将组织培养细胞接种在酸处理的盖玻片上至少一天，并且由于 OS 细胞都是合适的选择，因为它们具有高分泌的蛋白质产量和明确的 ER。

如果正在研究外源性 Mr NA，请在接种后 1 天转染细胞，然后将细胞再孵育 18 小时以允许 MR。NA 表达式。在实验当天。为了实现高提取效率，细胞在盖玻片上的共流畅度不应超过 80%，以检测 mRNA 是否独立于翻译细胞，可以使用破坏这些试剂或 mRNA 之间相互作用的试剂处理细胞提取前 30 分钟细胞的对照培养基。

在这种情况下，使用翻译抑制剂、纯 Mycin 和 Homo Harrington in 或 HHT。首先将含有 dig tonin 和一 XCHO 工作缓冲液的新鲜制备的提取溶液加热至 37 摄氏度。将加热块设置为 40 摄氏度，并插入一个倒置的金属块以形成平坦的工作表面。

用水润湿金属块，然后用一块新的寄生形式覆盖，并使用无 RNA 手套和无绒纸巾抚平任何气泡。接下来，对于每对盖玻片，准备一个六孔板，用于清洗细胞并将其固定到四个孔中。向最后两个孔中加入 2 毫升加热的 CHO 缓冲液。

加入 2 毫升固定液。然后将板存放在 37 摄氏度，直到需要为止。在加热块上，为要处理的每个细胞盖玻片滴入 100 微升提取溶液。

现在使用珠宝商的镊子，拿起细胞包被的盖玻片并将其浸入含有 CHO 缓冲液的第一和第二孔中。这会洗掉生长培养基。然后快速擦去盖玻片背面多余的缓冲液。

并将盖玻片槽的一面朝下短暂地放在提取溶液上。10 秒后，将盖玻片细胞侧向上转移到固定缓冲液中，应至少停留 15 分钟。细胞提取步骤对于去除所有未与 ER 结合的 cyop plasticky mRNA 至关重要。

此外，准备一个对照盖玻片，其中细胞固定而不提取。固定后步骤。用 PBS 洗涤这些未提取的对照细胞两次，然后在 PBS 和 TRITTON X 100 中洗涤通透酶。

虽然不是必需的，但提取的细胞也应使用相同的 PBS 和 Triton 溶液洗涤，以减少细胞渗透后的背景荧光。用 PBS 洗涤载玻片两次，以去除固定剂和清洁剂。接下来，在一次性柠檬酸钠缓冲液或 SSC 中用 60%fide 洗涤载玻片两次。

然而，如果使用 oligo DT fish 探针对所有细胞进行染色，poly mRNA 会将 fide 水平降低到 25%接下来，准备带有 fish 探针的杂交缓冲液。在杂交缓冲液中，用相同浓度的 fide 将鱼汤探针稀释至 0.2 μmol。现在准备染色室。

将 150 毫米培养皿的底部装满水。然后将一块 paraform 漂浮在水面上，将盘子倒置。当水逸出时，封口膜会粘附在培养皿底部。

如果有任何气泡，请用手套和无绒纸巾将其清除，对于每个盖玻片移液器，将 100 微升含有鱼探针的杂交溶液移液到对段膜上。现在将盖玻片单元的一面朝下放在溶液上。最后，在温暖的加湿室中孵育腔室 5 至 24 小时。

在鱼染色时间结束之前，准备一个不含 RNA 的洗涤区，用水弄湿平坦的平面，并用 param 条覆盖。用手套和无线纸巾清除任何气泡。染色完成后，将腔室转移到每个盖玻片的工作区域，将 1 毫升洗涤缓冲液移液到洗涤区域。

用于转移盖玻片的 Para 薄膜 首先，在每个盖玻片边缘附近吸取半毫升的鱼洗缓冲液。液体将通过毛细管作用被吸入盖玻片下方。接下来，使用镊子从腔室中取出盖玻片，并将其放在洗涤缓冲液的液滴上。

然后等待 5 分钟。再重复此洗涤技术 3 次。在洗涤区域使用新鲜的 1 毫升洗涤缓冲液。

同时，用 70% 乙醇清洁载玻片，并用无绒纸巾干燥。然后对于每个盖玻片，将 25 微升 DPI 封固液涂抹在载玻片上 使用镊子，拿起盖玻片并用无绒纸巾擦干其背面，以去除多余的洗涤缓冲液。然后将盖玻片槽面朝下转移到镶样液滴上。

完成的载玻片可以在 4 摄氏度下储存，直到它们被成像成本。用含有胎盘碱性磷酸酶或细胞色素 P 4 58 B 的质粒转染的 7 个细胞 B 1 用 tonin 提取，然后固定或直接固定以确定这些 mRNA 与 ER 相关的百分比。对两个样品中的非核荧光进行定量，并计算两种 mRNA 的 ER 相关 mRNA 的分数。

大约 60% 的细胞质部分与 ER 相关，以监测这些转录本的 ER 关联。核糖体解离转染成本后，用对照培养基、pur MYCIN 或 HHT 处理 7 个细胞，然后提取 tonin 和固定 mRNA。染色显示，核糖体破坏后，A LPP 而不是 CYP 8 P 1 mRNA 仍与 ER 相关。

mRNA 定量支持这一观察结果，重要的是表明所有样品中的核 mRNA 水平都是一致的。这些数据显示，在核糖体分解后，ER 靶向 mRNA 的一个子集（例如 A LPP 转录本）保留在 ER 表面。使用该方案，我们可以开始研究各种 mRNA 如何定位于不同的亚细胞区室，例如内质网当与用于分析 mRNA 核输出的其他测定相结合时。

该程序可用于研究新合成的 mRNA 对 er 表面的初始靶向。