在哺乳动物细胞中的内质网定位的mRNA的可视化
December 17th, 2012
在这里，我们描述了一种方法，可视化在哺乳动物组织培养细胞的内质网相关的mRNA。这项技术涉及的质膜的选择性通透性毛地黄皂苷以除去细胞质随后通过荧光的内容
该程序的目的是可视化与内质网或 er 相关的信使 RNA。这是通过首先将哺乳动物组织培养细胞铺在盖玻片上来实现的。该程序的第二步是用提取缓冲液处理细胞，以去除未与 er 结合的细胞质 mRNA。
下一步是快速固定细胞并通过荧光原位杂交对 mRNA 进行染色。最后的步骤是成像，然后量化与 er 相关的荧光量。最终，结果可以显示 mRNA 在不同条件下如何与该细胞器表面相关联。
这种方法可以帮助回答关键的细胞生物学问题，例如编码分泌蛋白的 mRNA 是否可以独立于核糖体或蛋白质合成维持在 er 表面。这种方法的视觉演示至关重要，因为它涉及一些棘手的细胞作步骤。在实验成本 7 之前，将组织培养细胞接种在酸处理的盖玻片上至少一天，并且由于 OS 细胞都是合适的选择，因为它们具有高分泌的蛋白质产量和明确的 ER。
如果正在研究外源性 Mr NA，请在接种后 1 天转染细胞，然后将细胞再孵育 18 小时以允许 MR。NA 表达式。在实验当天。为了实现高提取效率，细胞在盖玻片上的共流畅度不应超过 80%，以检测 mRNA 是否独立于翻译细胞，可以使用破坏这些试剂或 mRNA 之间相互作用的试剂处理细胞提取前 30 分钟细胞的对照培养基。
在这种情况下，使用翻译抑制剂、纯 Mycin 和 Homo Harrington in 或 HHT。首先将含有 dig tonin 和一 XCHO 工作缓冲液的新鲜制备的提取溶液加热至 37 摄氏度。将加热块设置为 40 摄氏度，并插入一个倒置的金属块以形成平坦的工作表面。
用水润湿金属块，然后用一块新的寄生形式覆盖，并使用无 RNA 手套和无绒纸巾抚平任何气泡。接下来，对于每对盖玻片，准备一个六孔板，用于清洗细胞并将其固定到四个孔中。向最后两个孔中加入 2 毫升加热的 CHO 缓冲液。
加入 2 毫升固定液。然后将板存放在 37 摄氏度，直到需要为止。在加热块上，为要处理的每个细胞盖玻片滴入 100 微升提取溶液。
现在使用珠宝商的镊子，拿起细胞包被的盖玻片并将其浸入含有 CHO 缓冲液的第一和第二孔中。这会洗掉生长培养基。然后快速擦去盖玻片背面多余的缓冲液。
并将盖玻片槽的一面朝下短暂地放在提取溶液上。10 秒后，将盖玻片细胞侧向上转移到固定缓冲液中，应至少停留 15 分钟。细胞提取步骤对于去除所有未与 ER 结合的 cyop plasticky mRNA 至关重要。
此外，准备一个对照盖玻片，其中细胞固定而不提取。固定后步骤。用 PBS 洗涤这些未提取的对照细胞两次，然后在 PBS 和 TRITTON X 100 中洗涤通透酶。
虽然不是必需的，但提取的细胞也应使用相同的 PBS 和 Triton 溶液洗涤，以减少细胞渗透后的背景荧光。用 PBS 洗涤载玻片两次，以去除固定剂和清洁剂。接下来，在一次性柠檬酸钠缓冲液或 SSC 中用 60%fide 洗涤载玻片两次。
然而，如果使用 oligo DT fish 探针对所有细胞进行染色，poly mRNA 会将 fide 水平降低到 25%接下来，准备带有 fish 探针的杂交缓冲液。在杂交缓冲液中，用相同浓度的 fide 将鱼汤探针稀释至 0.2 μmol。现在准备染色室。
将 150 毫米培养皿的底部装满水。然后将一块 paraform 漂浮在水面上，将盘子倒置。当水逸出时，封口膜会粘附在培养皿底部。
如果有任何气泡，请用手套和无绒纸巾将其清除，对于每个盖玻片移液器，将 100 微升含有鱼探针的杂交溶液移液到对段膜上。现在将盖玻片单元的一面朝下放在溶液上。最后，在温暖的加湿室中孵育腔室 5 至 24 小时。
在鱼染色时间结束之前，准备一个不含 RNA 的洗涤区，用水弄湿平坦的平面，并用 param 条覆盖。用手套和无线纸巾清除任何气泡。染色完成后，将腔室转移到每个盖玻片的工作区域，将 1 毫升洗涤缓冲液移液到洗涤区域。
用于转移盖玻片的 Para 薄膜 首先，在每个盖玻片边缘附近吸取半毫升的鱼洗缓冲液。液体将通过毛细管作用被吸入盖玻片下方。接下来，使用镊子从腔室中取出盖玻片，并将其放在洗涤缓冲液的液滴上。
然后等待 5 分钟。再重复此洗涤技术 3 次。在洗涤区域使用新鲜的 1 毫升洗涤缓冲液。
同时，用 70% 乙醇清洁载玻片，并用无绒纸巾干燥。然后对于每个盖玻片，将 25 微升 DPI 封固液涂抹在载玻片上 使用镊子，拿起盖玻片并用无绒纸巾擦干其背面，以去除多余的洗涤缓冲液。然后将盖玻片槽面朝下转移到镶样液滴上。
完成的载玻片可以在 4 摄氏度下储存，直到它们被成像成本。用含有胎盘碱性磷酸酶或细胞色素 P 4 58 B 的质粒转染的 7 个细胞 B 1 用 tonin 提取，然后固定或直接固定以确定这些 mRNA 与 ER 相关的百分比。对两个样品中的非核荧光进行定量，并计算两种 mRNA 的 ER 相关 mRNA 的分数。
大约 60% 的细胞质部分与 ER 相关，以监测这些转录本的 ER 关联。核糖体解离转染成本后，用对照培养基、pur MYCIN 或 HHT 处理 7 个细胞，然后提取 tonin 和固定 mRNA。染色显示，核糖体破坏后，A LPP 而不是 CYP 8 P 1 mRNA 仍与 ER 相关。
mRNA 定量支持这一观察结果，重要的是表明所有样品中的核 mRNA 水平都是一致的。这些数据显示，在核糖体分解后，ER 靶向 mRNA 的一个子集（例如 A LPP 转录本）保留在 ER 表面。使用该方案，我们可以开始研究各种 mRNA 如何定位于不同的亚细胞区室，例如内质网当与用于分析 mRNA 核输出的其他测定相结合时。
该程序可用于研究新合成的 mRNA 对 er 表面的初始靶向。
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概览
本文介绍了一种在哺乳动物组织培养细胞中可视化内质网相关mRNA的方法。该技术涉及选择性地使质膜通透，然后使用荧光原位杂交来检测mRNA。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- 了解mRNA定位对于细胞功能至关重要。
- 内质网（ER）在mRNA翻译中扮演重要角色。
- 可视化与ER相关的mRNA可以揭示基因表达调控的洞见。
- 荧光原位杂交是检测特定mRNA的强大技术。
研究目的
- 可视化与内质网相关的mRNA。
- 区分细胞质和ER结合的mRNA。
- 量化不同条件下与ER相关的荧光。
使用的方法
- 将哺乳动物组织培养细胞接种在盖玻片上。
- 用提取缓冲液处理细胞以去除未结合的细胞质mRNA。
- 快速固定细胞以保持mRNA完整性。
- 使用荧光原位杂交染色mRNA。
主要结果
- 成功可视化与ER相关的mRNA。
- 荧光量化指示了mRNA定位。
- 结果展示了mRNA在不同条件下如何与ER结合。
- 关于mRNA定位在细胞过程中的角色的洞见。
结论
- 该方法提供了一种可靠的研究mRNA定位的方法。
- 了解mRNA-ER相互作用可以为基因表达调控提供信息。
- 这种技术可以应用于关于mRNA动力学的各种生物学问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing ER-associated mRNAs enables mechanistic de-risking of secretory and membrane protein expression hypotheses in early discovery. This method supports target validation by clarifying whether mRNA-ER interactions persist independently of translation, informing predictive confidence in pathway models. It provides a quantitative, reproducible assay for assessing subcellular mRNA localization under varying experimental conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses about mRNA-ER association for secreted and membrane proteins.
- Operational Value: Enables biological de-risking by distinguishing ER-bound from cytoplasmic mRNA pools.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying ER-association under ribosome-disrupting conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via selective cytoplasmic mRNA removal.
- Operational Value: Delivers assay standardization and reproducibility through controlled permeabilization and fixation.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by generating quantitative fluorescence readouts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mRNA localization insights to preclinical validation of secretory protein expression.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by revealing ribosome-independent mRNA-ER interactions.
- Biomarker Alignment: Supports disease-relevant systems when studying transcripts linked to secretion pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing mRNA-ER interactions under defined conditions.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via fluorescence intensity measurements associated with the ER.
- Analytics: Enables comparison of mRNA localization across conditions using fluorescence quantification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by assessing mRNA localization relevance to secretory protein expression.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for evaluating mRNA localization across multiple targets and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in mRNA localization.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of mRNA-ER association assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in secretory protein programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on ER-association data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, fluorescent in situ hybridization, and microscopy.
- Needs instrumentation for perfusion, fixation, and fluorescence imaging.
- Demands cross-team standardization of extraction timing, fixation, and washing protocols.
- Involves adaptation considerations for different cell lines and transcript types.
- Includes practical limitations such as accessibility of low-abundance transcripts and potential ER stress from extraction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Preparation of Cells and Treatment with Translation Inhibitors
2:29
Digitonin Extraction and Cell Fixation
4:47
Fluorescent In situ Hybridization
6:21
Washing and Mounting the Stained Samples
8:08
Placental Alkaline Phosphatase and Cytochrome P450-8B1 mRNA ER-association
9:50
Conclusion
