Name: 蛋白转染小鼠肺 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: 学习使用脂质转染试剂和超细微喷雾器将蛋白质转染到小鼠肺部的实验方法。该技术可提高蛋白表达效率并减少脱靶效应，适用于慢性阻塞性肺病、哮喘及肺纤维化等呼吸系统疾病研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（7R01HL098528-03）和FAMRI临床创新者奖资助。

1. 蛋白转染试剂的制备
<ol>
	<li>向含有干膜的试管中加入 250 μl 甲醇或氯仿，溶解 Pro-Ject 试剂。</li>
	<li>涡旋振荡 10–20 秒，速度调至最高。</li>
	<li>将 20 μl Pro-Ject 试剂分别移入不同的微量离心管中。</li>
	<li>将含有 Pro-Ject 试剂的微量离心管置于室温下的层流罩中，蒸发溶剂至少 6 小时，确保完全干燥。或者，可使用真空干燥器干燥 Pro-Ject 试剂。</li>
	<li>将试管储存于 -20 °C。在此温度下可稳定保存一年。</li>
</ol>
2. 将蛋白质加入Pro-Ject试剂
<ol>
	<li>用移液器将含有2.0 μg目标蛋白的50 μl PBS加入含有20 μl干燥的Pro-Ject转染试剂的离心管中。</li>
	<li>加入蛋白后，低速涡旋混匀3–5秒，然后在室温下孵育30分钟。</li>
</ol>
3. 蛋白质的气管内给药
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（100 mg/kg 和 10 mg/kg）使小鼠麻醉。</li>
	<li>待小鼠进入镇静状态后，使用特制平台将其上切牙悬挂固定（图1）。</li>
	<li>用镊子和回形针作为喉镜打开小鼠口咽部，以便插入导管（图2）。将光源置于小鼠气管处，以观察声带。</li>
	<li>使用Penn Century Microsprayer通过气管注入蛋白/ProJect试剂混合液（50 μl）。</li>
</ol>

<ol><li>Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+models+for+study+of+pulmonary+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic models for study of pulmonary development and disease.</a> Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).</li>
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<li>Crystal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+an+adenovirus+containing+the+human+CFTR+cDNA+to+the+respiratory+tract+of+individuals+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis.</a> Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).</li>
<li>Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+gene+delivery+using+polymeric+nonviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors.</a> Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).</li>
<li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).</li>
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<li>Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+9-mediated+pulmonary+transgene+expression%3A+effect+of+mouse+strain%2C+animal+gender+and+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation.</a> Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).</li>
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<li>Wallace, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Phosphatase+2a+%28Pp2a%29+Regulates+Innate+Immune+and+Proteolytic+Responses+to+Cigarette+Smoke+Exposure+in+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung.</a> Toxicol. Sci. , (2012).</li>
<li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

该技术相较于其他方法的优势在于，它能够直接在肺组织内部提高蛋白质水平和活性。此外，该技术可渗透至肺的最远端区域，而不仅局限于气道内。即使使用生理盐水灌洗气道后，我们仍能检测到注射物的蛋白质活性升高15。组织活性分析表明，该蛋白质已进入细胞内部，而不仅仅停留在小鼠肺部的气腔中。免疫组织化学结果进一步证实了这一点，显示注射的蛋白质在小鼠肺泡和气道中呈现弥散性染色（图3）。重要的是，该实验方案不会引发肺部炎症或蛋白酶的表达。因此，所观察到的任何变化均可归因于所给予蛋白质的作用。由于缺乏炎症反应，该方法可用于多次重复注射，以研究蛋白质在较长时间内的效应。

<table><tbody><tr><td>Pro-Ject</td><td>Pierce Bio</td><td>89850</td><td></td></tr><tr><td>微型喷雾器</td><td>Penn Century</td><td>FMJ-250</td><td></td></tr><tr><td>β-半乳糖苷酶</td><td>Pierce Bio</td><td>89850</td><td></td></tr><tr><td>β-半乳糖苷酶抗体</td><td>Santa Cruz Bio</td><td>SC-19119</td><td></td></tr><tr><td>小鼠血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3139</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮/赛拉嗪</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K113</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肺部蛋白质转染

Protein Transfection of Mouse Lung

提高蛋白质表达水平可使研究人员更深入地理解该蛋白质在调控关键生物学过程中的功能作用1。在肺组织中，这一目标通常通过基因手段实现，例如使用转基因小鼠2,3，或利用病毒及非病毒载体通过增强基因表达来提升蛋白质水平4。然而，转基因小鼠的制备成本高且耗时较长，外源基因的随机插入或长期持续表达可能干扰正常的肺发育，从而限制模型的应用价值5。尽管条件性转基因技术可避免长期基因表达带来的问题6，但用于实现条件性表达的反向四环素调控转录激活因子（rtTA）小鼠会出现自发性肺泡腔扩大现象7。与转基因模型类似，病毒和非病毒载体的使用同样成本较高8，并可能引发剂量依赖性的炎症反应，干扰实验结果9并抑制目标蛋白的表达10。此外，重复给药的效果会因机体对载体的免疫应答增强而受到限制11,12。目前，研究人员正在开发腺相关病毒（AAV）载体，这类载体引发的炎症反应较轻，并可在肺组织中实现更持久的表达13。
利用β-半乳糖苷酶，我们介绍一种通过直接蛋白转染技术快速有效地提高肺内蛋白表达的方法。该方案将固定量的纯化蛋白与20 μl基于脂质的转染试剂（Pro-Ject，Pierce Bio）混合，以促进其穿透肺组织。随后，通过气管将脂质体-蛋白混合物使用微雾化喷雾器（Penn Century，Philadelphia，PA）注入小鼠肺部。微雾化喷雾器可在整个肺内产生精细的液态气溶胶喷雾。利用该技术，我们已证明注射的蛋白可均匀沉积于小鼠的气道和肺泡中14。脂质转染技术可使用少量蛋白即达到效应，从而限制了高剂量蛋白给药可能引发的炎症反应。事实上，我们已发表的研究表明，利用该技术可显著提高肺组织中PP2A的活性，同时不影响支气管肺泡灌洗液中的细胞数量15。在刺激后24小时采集的肺灌洗液细胞数与对照组相当（对照组27±4 vs. 转染白蛋白组31±5；每组N=6）。此外，该方法可在不诱导肺发育改变或转基因模型中可能出现的肺结构改变的情况下提高蛋白水平。然而，由于需要重复给药，该技术在研究长期蛋白表达升高效应的研究中可能不具优势，对于半衰期较短的蛋白尤其如此。

为了证明本技术的有效性，我们使用微喷雾器（Penn Century）向小鼠气管内注射含有20 μl Pro-Ject转染试剂的50 μl PBS溶液，该溶液中溶解了2 μg小鼠白蛋白（Sigma）。将白蛋白处理的小鼠与以相同方式处理但注射2 μg β-半乳糖苷酶蛋白（Pierce Bio）的小鼠进行比较。24小时后，处死小鼠并取肺组织进行组织学分析。对经白蛋白和β-半乳糖苷酶处理的小鼠的福尔马林固定肺组织切片进行β-半乳糖苷酶免疫组织化学染色。即使在蛋白转染24小时后，我们仍可在β-半乳糖苷酶处理小鼠的气道（大箭头）中检测到强烈的染色信号，而在白蛋白处理小鼠中则未见此信号（图3A和3B）。
<img alt="行为实验装置中的啮齿类动物，透明观察室；关于平衡与运动控制的研究。" src="/files/ftp_upload/50080/50080fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data...

转基因小鼠或病毒载体已被用于增加肺组织内的蛋白表达。然而，这些技术耗时较长，技术难度较高，且存在脱靶效应，可能干扰实验结果。我们的蛋白转染方案采用基于脂质的转染试剂和超细雾化微喷器，可将活性蛋白均匀递送至肺细胞。

提高蛋白质表达水平使研究人员能够更深入地理解该蛋白质在调控关键生物过程中的功能作用¹。在……

本实验的总体目标是将蛋白质转染至小鼠肺部。首先将目的蛋白质悬浮于项目转染试剂中，随后对小鼠进行麻醉，并将其置于专用注射平台上进行操作。使用光源辅助将微型喷雾器插入气管。最后，注入50微升含有目的蛋白的液体。最终，该蛋白转染技术可用于显示小鼠肺组织内蛋白水平的升高。尽管该方法最初设计用于慢性阻塞性肺疾病，但也可应用于其他疾病状态，如哮喘或肺纤维化。该方法的可视化演示至关重要。由于气管内注射步骤较难掌握，需要对小鼠气道进行准确定位，并对声门进行透照 illumination。首先准备蛋白质转染试剂。向含有干燥薄膜的试管中加入 250 微升甲醇或氯仿。接着，以最高速度涡旋振荡试管 10 至 20 秒。溶解后，将20微升项目试剂分别用移液器加入不同的微量离心管中。将这些试管置于层流罩下，挥发溶剂至少六小时。在室温下，试管必须完全干燥。将管子置于零下20摄氏度保存，在此条件下可稳定保存一年。转染当天，取出一份转染试剂，并加入50微升含有2微克目标蛋白的PBS溶液。低速涡旋振荡3至5秒以混匀溶液，然后在室温下孵育30分钟后再使用。当蛋白制备完成后，麻醉小鼠以准备进行气管内给药。气管内注射使用一种特殊设计的平台，该平台从底座起呈45度角倾斜，并在顶部有两个钩子悬挂着一根金属丝。麻醉后，用该金属丝钩住小鼠的上门齿将其悬挂。固定小鼠后，将光源紧贴气管，以辅助使用镊子和回形针观察声门。作为喉镜使用，打开口咽部，插入导管。使用Micros喷雾器时，推动活塞需施加足够的力度。否则，将无法产生细雾，而是形成可能阻塞小鼠气道的液滴。一切准备就绪后，使用笔式世纪微喷器经气管注入50 µL蛋白混合物。在此示例中，小鼠在蛋白质转染后24小时通过气管内注射给予小鼠白蛋白或β-半乳糖苷酶。在给予β-半乳糖苷酶的小鼠气道中（此处由大箭头指示）检测到明显的β-半乳糖苷酶染色，而在给予白蛋白的小鼠中则未检测到。一旦熟练掌握，该技术若操作得当，可在10至15分钟内完成。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对小鼠进行气管内注射以实现蛋白质转染。

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