Name: 产生和回收的β-细胞的细胞球体从逐步增长的PEG-肽水凝胶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学习使用硫醇-烯光点击PEG-肽水凝胶封装胰腺β细胞并回收细胞聚集体的方法。该技术为细胞封装提供生物相容性环境，支持细胞存活与增殖，并可实现可控回收用于后续生物学表征。

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本项目由美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：R21EB013717）和印第安纳大学与普渡大学印第安纳波利斯联合分校校务研究办公室（IUPUI OVCR，研究支持基金）资助。作者感谢 Han Shih 女士提供的技术协助。

A. 大分子单体与多肽的合成
<ol>
	<li>使用已建立的方案合成4臂PEG-降冰片烯（PEG4NB）和光引发剂芳基磷酸锂（LAP）。18,19</li>
	<li>使用微波多肽合成仪（CEM Discover SPS）通过标准固相多肽合成方法合成含双半胱氨酸的胰蛋白酶敏感性多肽CGGY↓C（箭头表示胰蛋白酶切割位点）。
	<ol class="lalpha">
		<li>根据树脂的取代率和合成规模计算所需树脂（Rink-酰胺MBHA树脂）的量。在反应瓶（RV）中用二甲基甲酰胺（DMF）溶胀树脂15分钟。</li>
		<li>使用含20%哌啶和0.1 M HOBt的DMF溶液去除树脂上的Fmoc保护基。采用下表所列参数进行微波辅助Fmoc去保护（适用于所有Fmoc-氨基酸）：
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>合成规模</td>
					<td>0.1 mmol</td>
					<td>0.2 mmol</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>功率</td>
					<td>20 W</td>
					<td>50 W</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>温度</td>
					<td>75 °C</td>
					<td>75 °C</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>时间</td>
					<td>3 min</td>
					<td>3 min</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>去保护后，用DMF冲洗树脂，并进行茚三酮测试以确认Fmoc已去除（暴露出N端氨基）。树脂在95 °C下反应2分钟后应变为蓝色。</li>
		<li>成功去保护后，在活化碱溶液（0.28 M二异丙基乙胺（DIEA）的DMF溶液）中偶联C端的第一个Fmoc-氨基酸（合成方向为从C端到N端），参数如下表所示：
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>合成规模</td>
					<td>0.1 mmol</td>
					<td>0.2 mmol</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>功率</td>
					<td>20 W</td>
					<td>50 W</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>温度*</td>
					<td>75 °C</td>
					<td>75 °C</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>时间*</td>
					<td>5 min</td>
					<td>5 min</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		 
		* 对于Cys和His，使用50 °C和10分钟以减少消旋化。</li>
		<li>冲洗树脂后进行茚三酮测试，定性确认偶联完成（N端氨基消失）。树脂在95 °C下反应5分钟后应无色。若茚三酮测试呈阳性（蓝色），则重复偶联步骤（A.2.d）。</li>
		<li>对序列中的其余氨基酸重复去保护（步骤A.2.b）和偶联（步骤A.2.d），最后进行一次去保护。</li>
		<li>排空反应瓶，用25 ml二氯甲烷（DCM）冲洗树脂。此步骤旨在去除DMF，因DMF为碱性，会阻碍多肽裂解。</li>
		<li>通过将250 mg苯酚溶于4.75 ml三氟乙酸（TFA）、0.125 ml三异丙基硅烷（TIS）和0.125 ml ddH2O中，配制裂解混合液。</li>
		<li>将裂解液加入反应瓶中，在微波多肽合成仪中裂解30分钟（功率 = 20 W；温度 = 38 °C）。</li>
		<li>使用真空歧管将多肽溶液收集至50 ml离心管中。</li>
		<li>在40 ml乙醚中沉淀裂解后的多肽，涡旋混匀后以3,000 rpm离心5分钟收集多肽。</li>
		<li>弃去上清液，并重复步骤A.2.k两次。</li>
		<li>收集多肽并在真空下干燥。</li>
		<li>使用HPLC纯化多肽，并通过质谱进行表征。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
B. 材料准备与灭菌
<ol>
	<li>在 PBS 中配制 20 wt% PEG4NB 溶液，涡旋混合至大分子单体完全溶解，使用注射器滤器对大分子单体溶液进行灭菌。将灭菌后的溶液于 -20 °C 保存（建议分装后长期保存）。</li>
	<li>在 PBS 中配制并灭菌 2 wt% 光引发剂（LAP）溶液。将灭菌后的溶液避光保存于室温。</li>
	<li>将多肽（CGGYC）溶解于PBS中，涡旋混匀，使用注射器滤器过滤溶液以实现灭菌。分装多肽溶液，于-20 °C保存备用（避免反复冻融）。</li>
	<li>使用Ellman试剂测定所制备的多肽溶液中的巯基（-SH）浓度（遵循试剂生产商的说明书）。此步骤可获得准确的多肽浓度。即，[SH]/2）是计算硫醇-烯烃光点击反应中所需肽段用量所必需的。</li>
	<li>使用剃刀将无菌的一次性1 ml注射器的顶部切下，制备凝胶模具（切口朝上以便取出凝胶）。通过高压灭菌对注射器模具进行灭菌。</li>
	<li>根据所需的凝胶配方（巯基与烯烃比例 = 1根据储备材料的浓度，计算所需聚合物、肽交联剂、光引发剂和缓冲液的体积。</li>
</ol>
C. 细胞制备
<ol>
	<li>将细胞培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM，含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、250 ng/ml两性霉素B的抗生素-抗真菌剂，以及50 μM β-巯基乙醇）、Hank's平衡盐溶液（HBSS，无Ca2+、Mg2+）和胰蛋白酶-EDTA预热至37 °C。</li>
	<li>从CO2培养箱中取出含有MIN6 β细胞的培养瓶，并将其放入超净工作台中。</li>
	<li>吸除培养瓶中的细胞培养基，并用HBSS冲洗细胞。</li>
	<li>使用3 ml 2X（0.1%）胰蛋白酶-EDTA消化细胞，在37 °C、5% CO2条件下孵育4分钟。
	<ul>
		<li>注意：使用2X胰蛋白酶溶液可使MIN6 β细胞完全解离为单细胞悬液。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>孵育结束后，轻轻敲击培养瓶表面，使细胞完全脱落。使用显微镜确认细胞的脱落和解离情况。</li>
	<li>加入等体积的细胞培养基以中和胰蛋白酶。通过轻柔吹打充分混匀溶液，然后将混合液转移至离心管中，在1,000 rpm条件下离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并用4–5 ml培养基轻柔重悬细胞。</li>
	<li>使用50%台盼蓝染液在血细胞计数板上测定细胞密度。</li>
</ol>
D. 水凝胶制备与细胞包封
<ol>
	<li>当细胞准备就绪后，根据1:1的巯基与烯基比例，在微量离心管中混合所需体积的PEG4NB、CGGYC、LAP、细胞溶液和HBSS。</li>
	<li>使用移液器轻轻混匀溶液以获得均匀混合物，并将25 μl该混合液加入到注射器模具中。将注射器置于紫外光（365 nm，5 mW/cm2）下照射2分钟。</li>
	<li>光聚合反应完成后，将凝胶浸入含有细胞培养基的无菌24孔板中，并在37 °C、5% CO2条件下孵育水凝胶。</li>
	<li>用细胞培养基洗涤载细胞的水凝胶30分钟，以去除松散附着的细胞和未交联的大分子单体。将凝胶转移至新鲜培养基中。</li>
	<li>每2至3天更换一次细胞培养基。</li>
</ol>
E. 细胞活力检测
由于合成的水凝胶具有透明性，可使用光学显微镜观察包封细胞的形态。细胞活力可通过活/死染色进行定性观察和测量，也可通过AlamarBlue试剂进行定量分析。
E.1. 活/死染色
<ol>
	<li>在室温下解冻活/死细胞染色试剂。</li>
	<li>在离心管中根据待染色样品数量（n）加入 PBS： 
	PBS 总体积=n × 500 μl</li>
	<li>向含有 PBS 的离心管中，每 1 ml PBS 加入 0.25 μl Calcein AM 和 2 μl EthD-1。涡旋混匀溶液以充分混合组分。</li>
	<li>将载有细胞的水凝胶在活/死染色溶液（每样品 0.5 ml）中，于室温下在摇床上孵育 1 小时。</li>
	<li>使用巴斯德吸管移除染色液，并用 PBS 清洗样品两次。</li>
	<li>将样品置于盖玻片或载玻片上，使用共聚焦显微镜观察并成像细胞。</li>
</ol>
E.2. AlamarBlue 检测法
<ol>
	<li>在细胞培养基中配制10%（v/v）的AlamarBlue溶液。</li>
	<li>从培养箱中取出凝胶，吸除各孔中的培养基，注意不要接触凝胶本身。</li>
	<li>将含细胞的凝胶以及一个空孔（阴性对照）分别加入500 μl的10% AlamarBlue溶液，于37°C孵育16小时。</li>
	<li>孵育结束后，用移液器将200 μl AlamarBlue溶液转移至96孔板中，使用酶标仪检测荧光信号（激发波长：560 nm，发射波长：590 nm）。
	<ul>
		<li>细胞代谢活性越高，染料还原程度越大，荧光信号越强。</li>
		<li>实验中至少设置两个仅含10% AlamarBlue溶液的孔作为空白对照。数据分析时，需从样品的荧光读数中扣除空白组的平均荧光值。</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
F. 胰凝乳蛋白酶介导的凝胶侵蚀与类球体回收
<ol>
	<li>在HBBS中配制1 mg/ml的无胰蛋白酶α-糜蛋白酶溶液，并对溶液进行无菌过滤。</li>
	<li>将水凝胶置于糜蛋白酶溶液中（每块凝胶500 μl），室温下轻轻振荡孵育，直至凝胶完全降解。
	<ul>
		<li>对于25 μl的凝胶，完全降解所需时间约为5分钟。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>将培养板置于冰上数分钟，以降低糜蛋白酶的活性。</li>
	<li>将细胞悬液转移至1 ml离心管中，在4 °C、300 rpm条件下离心2分钟。</li>
	<li>使用移液管小心吸除上清液，并轻轻将类球体重悬于HBSS中。</li>
	<li>将回收的类球体悬液转移至24孔板中，将板置于冰上，使类球体沉降。</li>
	<li>进行尺寸分析时，使用光学显微镜获取沉降后类球体的相差图像，并利用Nikon Element软件或ImageJ等软件测量回收类球体的直径。</li>
</ol>
G. 复苏类球体的功能检测
G.1. 从回收的细胞球体中进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌
<ol>
	<li>在24孔板中，将凝胶置于500 μl的2 mM低葡萄糖Kerbs-Ringer缓冲液（KRB）中，37 °C孵育1小时。</li>
	<li>消化凝胶并使用步骤F.1至F.6回收细胞球体。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免接触细胞球体，将细胞球体重悬于500 μl的2 mM低葡萄糖KRB中。</li>
	<li>取100 μl细胞球体悬液转移至0.6 ml离心管中，置于冰上，用于细胞内ATP定量分析。</li>
	<li>将剩余的细胞球体悬液均分为两份（分别加入两个微量离心管中），在300 rpm、4 °C条件下离心2分钟。</li>
	<li>吸除上清液（几乎至管底），将第一份细胞球体重悬于1 ml的25 mM高葡萄糖KRB中，第二份重悬于1 ml的2 mM低葡萄糖KRB中。</li>
	<li>轻柔吹打并转移含有回收细胞球体的溶液至24孔板中。将板置于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。</li>
	<li>孵育结束后，将溶液转移至微量离心管中，在1,000 rpm、4 °C条件下离心2分钟。</li>
	<li>从离心后的管中转移500 μl上清液至另一微量离心管中，4 °C保存，用于胰岛素ELISA检测。</li>
	<li>按照试剂盒制造商的说明书进行胰岛素ELISA检测。</li>
</ol>
G.2. CellTiter Glo 检测
<ol>
	<li>ATP 标准品：配制 10 μM ATP 溶液，并进行系列稀释，得到一系列 8 个标准溶液。</li>
	<li>向白色 96 孔板中加入 50 μl 细胞球状体溶液（来自步骤 G.1.6）以及标准品溶液。</li>
	<li>向含有样品和标准品的每个孔中加入 50 μl CellTiter Glo 试剂，在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，使用微孔板读数仪测定样品和标准品的发光值，并根据 ATP 标准品生成的线性回归曲线校准样品的 ATP 浓度。</li>
	<li>确定样品中的总 ATP 浓度，再乘以样品稀释倍数，得到一个载细胞水凝胶中的细胞内 ATP 浓度。</li>
</ol>
G.3. 测定胰岛素分泌
<ol>
	<li>通过计算高葡萄糖培养基中分泌的胰岛素量与低葡萄糖培养基中分泌的胰岛素量的比值，确定从回收的球状体中分泌的胰岛素量。</li>
	<li>将细胞球状体的定量胰岛素含量与其回收后细胞内ATP含量进行归一化处理。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

所述方案详细介绍了通过逐步增长光聚合形成巯基-烯烃水凝胶以实现细胞简易包封的技术细节。本方案中采用降冰片烯与巯基官能团1:1的化学计量比，但该比例可根据具体实验需求进行调整。除正确的配方外，保持预聚物溶液的均一性至关重要。尤其应注意使用轻柔的移液操作，确保细胞在预聚物溶液中均匀分布，从而避免细胞聚集以及凝胶性能的不一致。尽管本方案采用2分钟的聚合时间进行凝胶交联，但在大多数与细胞包封相关的配方中，巯基-烯烃水凝胶的凝胶点通常短于10秒。例如，4 wt% PEG4NB/CGGYC水凝胶的凝胶点为7 ± 2秒，5 wt%的凝胶点为6 ± 1秒。该水凝胶体系的快速凝胶化可迅速固定细胞，与需要数分钟甚至数小时才能达到凝胶点的其他光聚合体系相比，实现了更优的三维细胞分布。7,20 
此外，通过胰蛋白酶家族酶介导的凝胶侵蚀，可从硫醇-烯烃水凝胶中回收自然形成的β细胞球体。然而，胰凝乳蛋白酶属于胰蛋白酶家族，其高浓度或长时间孵育可能对细胞间相互作用产生负面影响，甚至在回收过程中破坏球体结构。为避免这一潜在局限，可使用其他巯基化底物交联水凝胶，并通过不会引起...

水凝胶是一类亲水性交联聚合物，作为组织修复与再生的支架材料具有巨大的应用潜力1-3。水凝胶的高含水量有利于氧气扩散以及营养物质和细胞代谢产物的交换，这些因素对于维持细胞活性至关重要。此外，由于水凝胶具有高度可调控性，因此也是实现可控释放和细胞递送的优良载体2。合成水凝胶（例如由聚乙二醇（PEG）制备的水凝胶）在组织工程中的应用日益广泛，这主要归因于其良好的细胞相容性、类似组织的弹性以及在材料物理和力学性能方面的高度可调性4-6
尽管聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）是一种常用的水凝胶平台，但研究表明，通过链增长光聚合形成的PEGDA水凝胶在网络交联过程中容易对包封的细胞造成损伤 原位 细胞封装7 细胞损伤在很大程度上归因于光引发剂分子产生的自由基物种，这些自由基通过PEGDA上的乙烯基传播，使聚合物链交联形成水凝胶。然而，这些自由基物种在细胞包封过程中也会引起应力和细胞损伤，尤其对自由基敏感的细胞（如胰腺β细胞）更为显著。8-10 为了获得更大的网格尺寸以促进扩散和提高细胞存活率，细胞封装通常采用较高分子量的 PEGDA。然而，这会损害聚合动力学，并导致凝胶的生物物理性能次优化。7,11,12 除了上述缺点之外，由于交联网络的异质性和不可降解性，从 PEGDA 水凝胶中回收细胞结构非常困难。虽然可通过将蛋白酶敏感性肽段引入 PEG 大分子单体骨架，使原本惰性的 PEGDA 水凝胶对酶切敏感，但该偶联过程通常需要使用昂贵的试剂，且由于链式增长聚合反应的固有特性，所得网络仍具有较高的异质性。13-15
最近研究表明，通过逐步增长型硫醇-烯光聚合形成的PEG-多肽水凝胶，相较于通过链式增长光聚合形成的水凝胶，在细胞包封方面表现出更优的特性7。硫醇-烯水凝胶优异的凝胶动力学归因于硫醇与烯基官能团之间反应的“点击”特性。与PEGDA的链式增长聚合相比，硫醇-烯反应受氧气抑制的程度较低，因而具有更快的凝胶化速率16,17。此外，硫醇-烯水凝胶相较于链式增长型PEGDA水凝胶具有更高的聚合效率和更优的凝胶生物物理性能7,18，从而在光聚合过程中显著减少了自由基物种对细胞造成的损伤。
此前，已利用由四臂聚乙二醇-降冰片烯（PEG4NB）大分子单体与含双半胱氨酸的肽交联剂（如蛋白酶敏感性肽）形成的硫醇-烯烃水凝胶进行细胞包封7,18。聚乙二醇水凝胶网络具有高度可调性，可为研究细胞存活与活性提供灵活且可控的三维微环境，而使用蛋白酶敏感性肽序列则为从水凝胶内自然形成的细胞结构中温和回收细胞提供了有效途径。本实验方案采用基于四臂聚乙二醇-降冰片烯（PEG4NB）与胰蛋白酶敏感性肽交联剂（CGGY↓C）通过逐步增长光聚合形成的硫醇-烯烃水凝胶，用于MIN6 β细胞的包封。本方案系统阐述了在硫醇-烯烃水凝胶中研究MIN6 β细胞存活、增殖及球状体形成的实验技术。此外，我们还提供了β细胞球状体的回收方法以及对回收球状体进行生物学表征的技术。

<table><tbody><tr><td>4臂PEG（20kDa）</td><td>Jenkem Technology USA</td><td>4ARM-PEG-20K</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-氨基酸</td><td>Anaspec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>活细胞/死细胞活力检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>包含钙黄绿素AM和碘化乙啶同型二聚体-1</td></tr><tr><td>AlamarBlue 试剂</td><td>AbD Serotec</td><td>BUF012</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter Glo 试剂</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>无钙&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>10547F</td><td>无钙&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>高糖DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522-100ML</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>无胰蛋白酶 &amp;alpha;-胰凝乳蛋白酶</td><td>沃辛顿生化公司</td><td>LS001432</td><td></td></tr><tr><td>小鼠胰岛素ELISA试剂盒</td><td>Mercodia</td><td>10-1247-01</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 一次性注射器</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从逐步生长的peg-肽水凝胶中生成与回收β细胞球体

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

水凝胶是一类亲水性交联聚合物，可为具有治疗意义的细胞或组织培养提供具有类似组织弹性且高通透性的三维微环境。由聚乙二醇（PEG）衍生物制备的水凝胶因其可调控的理化特性和良好的细胞相容性，正被广泛应用于多种组织工程领域。在本实验方案中，我们采用巯基-烯烃逐步生长光聚合反应制备用于包封胰腺MIN6 β细胞的PEG-肽类水凝胶。该凝胶由四臂PEG-降冰片烯（PEG4NB）大分子单体与一种对胰蛋白酶敏感的肽交联剂（CGGYC）形成。PEG的亲水性和抗非特异性吸附特性为细胞在三维环境中的存活与增殖提供了良好的细胞相容性微环境，而采用胰蛋白酶敏感肽序列（CGGY↓C，箭头表示酶切位点，末端半胱氨酸残基用于巯基-烯烃交联）则可实现对在水凝胶内形成的细胞结构进行快速回收。本方案详细阐述了以下技术：（1）将MIN6 β细胞包封于巯基-烯烃水凝胶中；（2）通过定性和定量细胞活力检测评估细胞存活与增殖情况；（3）利用胰蛋白酶介导的凝胶降解回收细胞球体；（4）对回收的细胞球体进行结构与功能分析。

图1-4展示了在巯基-烯烃水凝胶中包封、存活、增殖、球状体形成及球状体回收的代表性结果。图1显示了（1）使用PEG4NB和CGGYC进行逐步增长型巯基-烯光聚合反应的示意图，以及（2）由胰蛋白酶介导的凝胶侵蚀过程，该过程遵循表面侵蚀机制。图2和图3展示了通过活/死细胞染色和AlamarBlue检测获得的细胞活力结果。我们观察到，即使在较低的细胞密度下，细胞仍能在PEG4NB-CGGYC水凝胶中增殖，表明巯基-烯烃水凝胶体系具有良好的细胞相容性。图4展示了包封后回收的β细胞球状体的相差显微图像，以及回收后β细胞球状体的尺寸分布情况。
<img alt="PEG4NB-CGGYC 聚合示意图；紫外光诱导交联、酶降解过程。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50081/50081f...

以下方案提供了通过巯基-烯烃光点击反应形成逐步增长型聚乙二醇-多肽水凝胶来包封胰岛β细胞的技术。该材料平台不仅为细胞包封提供了细胞相容性的微环境，还可实现用户可控地快速回收在水凝胶内形成的细胞结构。

从逐步生长的PEG-肽水凝胶中生成与回收β细胞球体

水凝胶是一类亲水性交联聚合物，可提供具有类似组织弹性和高通透性的三维微环境，用于……

本实验的总体目标是展示将细胞包埋于光聚合水凝胶中的技术，以及随后从酶敏感型水凝胶中回收天然形成的β细胞并进行生物学表征的方法。该过程首先将MIN6 β细胞与前臂PEG、诺伯汀酸酯以及酶敏感性肽交联剂混合。随后通过自由基介导的光引发聚合反应将细胞包埋，形成水凝胶。第二步是在37摄氏度的二氧化碳培养箱中，将包封的细胞在薄层水凝胶中进行培养。待细胞增殖形成聚集体后，用缓冲液冲洗载有细胞的水凝胶，随后将其在奇亚胰蛋白酶溶液中孵育。在温和振荡条件下促进凝胶降解，然后小心洗涤回收的细胞聚集体，以去除酶溶液和降解的聚合物。最终，这些细胞聚集体可用于结构和功能分析。因此，逐步增长光化学反应的主要优势在于，其反应条件比传统的链式增长PEG-ddE更为温和。因此，这种水凝胶为多种细胞类型（包括胰岛β细胞）提供了优良的微环境。该技术的应用前景广泛，可拓展至多种细胞治疗领域，因为这种DIN系统为体外实验提供了优良的微环境，同时也为细胞递送提供了一个理想的平台。尽管我们在实验室中自行合成这些实验所用的多肽，但所述的多肽交联剂也可从多家公司购得。开始该实验前，需在PBS中配制20% PEG四NB溶液，并涡旋混合物直至引发剂完全溶解。然后将Kermer溶液通过注射器滤器过滤以实现灭菌，并将Eloqua储存于-20摄氏度，直至使用时取出。接着，配制2%的光引发剂锂盐磷酰基化合物（lithium arol phosphonate）在PBS中的溶液。将光引发剂溶液通过注射器滤器过滤，并将灭菌后的溶液避光保存于室温条件下。另一个准备步骤是将黄芩素敏感肽交联剂溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并通过注射器滤器过滤溶液以实现灭菌。额外的等分试样储存于-20摄氏度。根据制造商的说明书，使用Ellman试剂测定所制备肽溶液中巯基的浓度。接下来，通过切下无菌的一毫升一次性注射器顶部一厘米部分来制备模具。使用经重新灭菌的剃刀片对注射器模具进行再次灭菌。使用高压灭菌器灭菌后，准备一个电子表格，其中包含所需凝胶配方的计算，包括储备材料的体积和浓度，如聚合物肽、交联剂、光引发剂以及缓冲溶液。首先将细胞培养基、Hank's 平衡盐溶液以及含 EDTA 的两倍胰蛋白酶预热至 37 摄氏度。接着，从培养箱中取出 min six beta 细胞的培养瓶，并将其置于超净工作台中。吸除培养瓶中的细胞培养基后，用预热的平衡盐溶液冲洗细胞。然后使用三毫升预热的含EDTA的2×胰蛋白酶溶液消化细胞，将培养瓶放入其中，孵育四分钟。孵育结束后，轻轻敲击培养瓶在生物安全柜表面，以彻底解离细胞。在显微镜下观察，确认细胞已完全解离和悬浮。接下来，加入等体积的细胞培养基。为中和胰蛋白酶，用移液器轻轻吹打溶液数次使其充分混匀。然后将混合液转移至无菌的锥形离心管中，于200 × g离心5分钟。离心结束后，吸去上清液，并将细胞轻轻重悬于4至5毫升预热的培养基中。最后，通过将部分细胞悬液与50%台盼蓝混合，并使用血细胞计数板计数细胞，以确定细胞密度。待细胞准备好后，根据1:1的TH与EEN比例，在微量离心管中混合所需体积的4% PEG四臂交联剂、B肽交联剂和光引发剂，使细胞终浓度为1毫摩尔，并用HBSS溶液调节，通过移液轻轻混匀。本实验演示中使用的是4% PEG四臂和B肽交联体系。接下来，将25微升上述溶液用移液器加入每个注射器模具中。将注射器模具置于波长为365纳米、功率为5毫瓦/平方厘米的紫外光下照射2分钟。光聚合完成后，为使凝胶充分聚合，将凝胶浸入含有1毫升细胞培养基的无菌24孔板中，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟，以洗去任何松散附着的细胞或未交联的大分子。30分钟后，从培养箱中取出培养板，将凝胶转移至1毫升新鲜培养基中。每两到三天更换一次培养基。通过将Hanks平衡盐溶液加入无胰蛋白酶的α-糜蛋白酶中，制备1毫克/毫升的酶溶液。然后使用注射器滤器对混合物进行灭菌。接着，从培养箱中取出培养板，用Hank's平衡盐溶液冲洗凝胶。然后每孔加入500 µL的混合胰蛋白酶溶液，随后在摇床上室温轻柔振荡孵育约5至10分钟，以实现凝胶的完全降解。待凝胶完全解离后，将培养板置于冰上数分钟，以降低CH胰蛋白酶的活性。下一步是将细胞悬液转移至1毫升离心管中，在45 RCF和4°C条件下缓慢离心2分钟。离心后，使用PEI移液器小心吸除上清液，并用Hank's平衡盐溶液轻轻重悬细胞沉淀。然后将回收的类固醇溶液转移至新的24孔板中，并将该板置于冰上5至10分钟，以使类固醇沉降并附着于表面，便于进行尺寸分析。使用光学显微镜获取已沉降类球体的相差图像，并使用Nikon Elements软件或ImageJ等软件测量回收类球体的直径。这种包封方法可确保细胞初始存活率较高，这一点已通过活/死细胞染色定量验证。在细胞培养过程中，通过Alamar Blue试剂测定的细胞代谢活性在所有研究浓度下均随时间延长而增加，持续10天。经过10天的细胞培养后，类固醇体积增大且仍保持较高的细胞活力。在水凝胶中，PEG肽水凝胶支持包封的β细胞的存活与增殖，如图所示为培养10天后的结果；在体细胞恢复过程中，α-胰蛋白酶可将类固醇从水凝胶基质中释放出来，产生尺寸分布狭窄的类固醇，其尺寸与基质浓度无关。这些类固醇随后可用于进一步的表征与应用。在尝试该操作过程中。在包封过程中，保持预聚物溶液的均一性对于确保细胞均匀分布至关重要。通过本方案回收的细胞，可进一步采用其他技术（如全 mount 免疫染色和蛋白质印迹）进行表征，以研究水凝胶基质条件对细胞蛋白表达及表型的影响。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将细胞包封于水凝胶中，以及如何从凝胶中回收细胞以进行后续的生物学表征。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

产生和回收的β-细胞的细胞球体从逐步增长的PEG-肽水凝胶

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三维自组装肽水凝胶中人类神经前体细胞的培养

本方案所述的三维培养方法可重现小鼠胚胎胰腺前体细胞发育为分支器官的过程，包括前体细胞的大量扩增、分化及形态发生。该方法适用于对微环境进行成像观察、功能干扰及操作干预。...

体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

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胰腺癌仍然是最难治疗的癌症之一。因此，用于评估治疗效果的临床前模型必须具有可重复性和临床相关性，这一点至关重要。本方案描述了一种简单的共培养方法，用于生成可重复且具有临床相关性的纤维化球状体。...

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利用新型印章装置从二维细胞培养生成三维球状体/类器官

学习使用硫醇-烯光点击PEG-肽水凝胶封装胰腺β细胞并回收细胞聚集体的方法。该技术为细胞封装提供生物相容性环境，支持细胞存活与增殖，并可实现可控回收用于后续生物学表征。

从逐步生长的PEG-肽水凝胶中生成与回收β细胞球体

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