对黑色素瘤修饰符一个斑马鱼原地肿瘤模型的筛选

以下实验的总体目标是使用斑马鱼自体肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰因子。这是通过创造转基因动物来实现的，其中黑色素细胞表达感兴趣的基因，而鱼容易患黑色素瘤。接下来对黑色素瘤发作进行评分，以评估感兴趣的基因是否会改变肿瘤起始。

然后进行肿瘤侵袭和细胞特异性测定，以确定目标基因对黑色素瘤和癌前黑色素细胞的任何其他影响。最后，移植黑色素瘤细胞以测量目标基因如何影响已建立肿瘤中黑色素瘤起始细胞的频率。结果显示了候选基因如何影响黑色素细胞和黑色素瘤的各种特性，包括起始侵袭和移植能力。

与种系转基因等现有方法相比，该技术用于检测候选癌症基因的主要优点是节省了时间、精力和费用，并通过检测提高了通量。chime 转基因动物肿瘤发生的各个方面 演示此程序的是 sherania 琼脂，我实验室的研究生 生成用于注射的构建体。首先通过 PCR 创建门户中间进入克隆，扩增目标基因的全长开放阅读框并重组到 P don R 2 21 中。

然后使用多位点网关技术将黑色素细胞特异性 mifa 启动子目标基因和多聚腺苷酸化信号重新组合到微型 Cooper 载体中，将目标基因置于 mifa 启动子的控制下，将每个克隆注入 25 pg pg，以及 25 pg TOL 2 转座 mRNA 到一个细胞转基因三重纯合斑马鱼胚胎中。米法·布拉夫 FP 53.突变动物是黑色素细胞缺陷的，容易发生转化和黑色素瘤形成。

以及感兴趣的基因。Mini Cooper 载体包含一个拯救 MVA mini 基因。因此，成功注射的动物将发育出拯救的黑色素细胞，这些细胞表达感兴趣的基因。

在受精后 28.5 小时或 HPF 后 24 摄氏度下孵育注射的胚胎。受精后 72 小时，在白色背景下的入射光下使用解剖显微镜去除任何死胚胎。选择具有挽救的黑色素细胞的转基因动物。

当动物受精后达到 4 天时，将它们转移到斑马鱼设施苗圃的 3 升水箱中。在两个月大时，选择至少有一个黑色素细胞拯救面积大于 4 平方毫米的动物。每周筛查选定的动物是否存在肿瘤。

分离荷瘤动物进行研究。在 absa 上绘制无黑色素瘤生存曲线，以周为单位，在纵坐标上绘制无黑色素瘤生存率。将动物与表达目标基因的黑色素细胞与表达 EGFP 和黑色素细胞的对照动物进行比较。

使用对数秩检验可以确定两条曲线在统计意义上是否不同。进行肿瘤侵袭测定。首先选择孤立的斑马鱼，这些斑马鱼在后脑后缘和背鳍前缘之间的区域背侧发育肿瘤。

黑色素瘤发作两周后，在将鱼固定并包埋在石蜡中后，使用 trica 对鱼实施安乐死。通过病变制作 5 微米的横截面。一。每 50 微米切开整个病变，以便确定最深的浸润点。

使用血红素和 eoin 对切片进行染色。通过测量肿瘤细胞是否保持在胶原层之外、紧密侵入背肌组织或进一步侵入脊柱来评估肿瘤侵袭。确定两组样品之间的统计差异以进行免疫染色。

在解剖显微镜下用入射光用每毫升 0.17 毫克的 trica 麻醉鱼。使用锋利的细尖镊子拔取背鳞。注意不要损坏含有一半水垢的黑色素细胞。

将鳞片直接从镊子中取出放入 1 毫升固定剂中，并在室温下孵育，同时转动大于或等于 2 小时。将鱼转移到鱼水中并监测鱼以确认成功恢复为漂白有色黑色素细胞。首先在 PBST 中在室温下洗涤固定刻度 2 次，每次 5 分钟。

接下来，加入一毫升新鲜制备的漂白剂溶液，并盖上香水或瓶盖锁，以防止气体爆裂管子。继续漂白，直到色素消失。然后在室温下每 5 分钟在 PBST 中洗涤 4 次。

在封闭溶液中孵育至少 30 分钟，然后与约 400 μL 一抗和封闭溶液孵育过夜第二天在室温下，在室温下用 PBS 洗涤鳞片 3 次，每次 30 分钟，与二抗孵育 2 小时至在室温下过夜。用 dpi 站立后，将一滴矢量防护罩滴在载玻片上并安装刻度，使刻度的凹面朝下靠在载玻片上。将玻璃盖玻片放在样品上。

使用透明指甲油密封边缘并在荧光显微镜下观察载玻片。在接受辐射后，2 到 3 个月大的 Casper 鱼在移植前一天接受 25 格雷的伽马射线照射。让鱼在鱼水中恢复。

使用 trica 对携带肿瘤的鱼实施安乐死，切下肿瘤并将其放入含有约 5 毫升过滤器的培养皿中，用剃刀切块消毒肿瘤，同时在室温下工作并使用 P 1000 移液器迭代以产生单细胞。将体积增加到 25 毫升。通过 40 微米网状过滤器过滤溶液，并在台式离心机中以 453 RCF 离心 10 分钟。

将沉淀重新悬浮在 0.9%PBS 5%FBS 中至所需浓度。使用血细胞仪，计算准确的细胞数量并稀释细胞悬液，使最终注射体积约为 5 微升。例如，如果要注射 50， 000 个细胞，则应将细胞悬液稀释至每微升 10， 000 个细胞的最终浓度。

每隔几分钟轻弹含有细胞悬液的试管，以防止细胞与 100% 乙醇和 0.9 XPBS 结块。清洗 26 秒规斜面尖端 7、0、1 和 10 微升汉密尔顿注射器两到三次，然后向注射器中加入 5 微升细胞悬液。在 trica 中麻醉受辐照的受体鱼后，将其侧放在潮湿的 Kim 抹布上。

用一只手稳定鱼，然后将针头斜面朝上以 45 度角插入腹膜腔上方的鱼侧面。大约在后脑后缘和背鳍前缘之间的中间。轻轻按下柱塞。

让鱼在新鲜的鱼水中恢复，并每天观察鱼的肿瘤植入情况。如果发生植入，还可以观察到持续生长和疾病发展。如图所示，在 MFA 启动子的控制下，将一个细胞 BRAF FP 53 MIFA 斑马鱼胚胎注射含有黑色素瘤癌基因集 DB one 或 EGFP 的微型 Cooper 载体。

成人的肿瘤发病率曲线显示，与 EGFP 对照相比，SET DB one 显着加速了黑色素瘤的发作，如此处所示，血红素和 EOSIN 染色显示表达 SET DB one 的黑色素瘤比 EGFP 对照黑色素瘤更具局部侵袭性。该图显示了漂白或未漂白的斑马鱼背鳞，这些鳞片用识别核定位 mifa 转录因子的抗体染色，以评估肿瘤的移植能力。黑色素瘤细胞是从注射迷你杯 R-E-G-F-P 50， 000 细胞的 BRAF FP 53 mifa 鱼中分离出来的，该细胞被皮下注射到受体 Casper 突变体中，该突变体在前一天用 25 个戈瑞射线照射，如图所示，在两周龄时可以看到。

色素沉着的供体来源的细胞很容易识别。因此，在开发之后，这项技术为癌症生物学领域的研究人员通过使用斑马鱼研究黑色素瘤相关遗传变化的功能后果铺平了道路。看完这个视频后，您应该对如何使用斑马鱼自身肿瘤模型通过检测筛选黑色素瘤修饰物、肿瘤发作侵袭的差异、基因表达和移植能力有很好的了解。