Name: 对黑色素瘤修饰符一个斑马鱼原地肿瘤模型的筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 了解利用斑马鱼原位肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰基因的方法。本研究使用miniCoopR载体在黑色素细胞中表达候选基因，通过评估肿瘤发生、侵袭和移植能力，实现高通量基因功能分析，为癌症生物学研究提供高效工具。

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我们感谢Leonard I. Zon博士，这些技术最初是在他的实验室中开发的；感谢Kristen Kwan和已故的Chi-Bin Chien惠赠本研究中使用的质粒；感谢James Lister和David Raible在抗体染色方面的协助；感谢James Neiswender提供显微注射视频。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R00AR056899-03支持，项目负责人为C.J.C。

1. 黑色素瘤发病调控因子的筛选
<ol>
	<li>通过PCR扩增目的基因（GOI）的全长开放阅读框，并利用BP Clonase II酶（Invitrogen）将其重组至pDONR 221载体中，构建Gateway中间入门克隆。使用Multisite Gateway技术（Invitrogen）将p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA6和miniCoopR5进行重组，使目的基因置于miniCoopR载体中的mitfa启动子下游（图1A）。</li>
	<li>将每种克隆的25皮克与25皮克Tol2转座酶mRNA共同注射到单细胞期的Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)三重纯合斑马鱼胚胎中，操作方法如前所述7。将注射后的胚胎在28.5 °C条件下孵育。在24 hpf时移除死亡胚胎。</li>
	<li>在72 hpf时，通过将含有注射胚胎的培养皿置于解剖显微镜下，在白色背景上使用透射光观察，筛选出黑色素细胞表型得到恢复的转基因个体（图1A）。</li>
	<li>在4 dpf时，将筛选出的个体转移至斑马鱼饲养设施的育苗区3 L水箱中，操作方法如前所述8。</li>
	<li>在2个月龄时，选择至少存在一个面积大于4 mm2黑色素细胞恢复区域的个体（图1A）。72 hpf时黑色素细胞恢复程度与2个月时的恢复程度之间存在显著相关性。若在72 hpf时挑选出黑色素细胞恢复的胚胎，则其中大多数（约80%）在2个月时将至少存在一个面积大于4 mm2的恢复区域。</li>
	<li>每周对筛选出的个体进行肿瘤发生情况的监测（图1B）。组织病理学变化与形态学变化之间存在高度相关性。当病灶隆起于动物体表时，即可通过形态学变化识别其由良性向恶性转变的过程。将携带肿瘤的个体分离出来用于后续研究。</li>
	<li>绘制无黑色素瘤生存曲线，横坐标为周龄，纵坐标为无黑色素瘤生存率。将表达目的基因的黑色素细胞个体与在黑色素细胞中表达EGFP（增强型绿色荧光蛋白）的对照个体进行比较（图1C）。注射miniCoopR-EGFP 的个体中位肿瘤发生时间约为18周。使用log-rank检验判断两条生存曲线之间的差异是否具有统计学意义。</li>
</ol>
2. 肿瘤侵袭实验
<ol>
	<li>选择在后脑后边界与背鳍前缘之间区域出现背部肿瘤的孤立斑马鱼（图2A）。</li>
	<li>黑色素瘤发病两周后，根据美国兽医协会安乐死专家组及马萨诸塞大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指南对鱼类实施安乐死。具体操作为：将鱼放入含有0.6 mg/ml三卡因的培养皿中，直至鳃部运动停止。</li>
	<li>用解剖刀在鱼的腹腔做切口，随后将鱼置于4%多聚甲醛（PFA）中，在4 °C下固定过夜。</li>
	<li>在0.5 M EDTA中于4 °C处理过夜，以进行脱钙。</li>
	<li>将组织在包埋盒中用福尔马林固定过夜，脱水1小时，用二甲苯透明处理3次、每次1小时，然后在60 °C下用石蜡处理2次、每次2小时。</li>
	<li>将组织置于模具中用石蜡包埋，并静置30分钟至1小时使其完全凝固。</li>
	<li>每隔50 μm切取5 μm厚的切片，确保切片为横断面并贯穿整个病灶，以便识别肿瘤浸润最深的位置。随后进行苏木精和伊红染色。</li>
	<li>通过检测肿瘤细胞是否超出胶原性致密层、侵入背部肌肉组织或进一步侵入脊柱来评估肿瘤浸润情况（图2B,C）。分析两组样本之间的统计学差异。</li>
</ol>
3. 鳞片黑色素细胞的抗体染色
<ol>
	<li>配制磷酸盐缓冲液：取80 ml 0.1 M Na2HPO4 和20 ml 0.1 M NaH2PO4 混合，确保pH为7.3。配制2×固定缓冲液：含8.0 g蔗糖、0.15 ml 0.2 M CaCl2 和90 ml 0.2 M PO4 缓冲液（pH 7.3）。如有必要，用NaOH或HCl将pH调至7.3，再用PO4 缓冲液定容至100 ml。</li>
	<li>称取最多300 mg固体PFA，加入微量离心管中。加入5 mM NaOH，体积为PFA质量（mg）的4.5倍（例如，100 mg PFA加入450 μl 5 mM NaOH）。在60–70 °C加热并间歇振荡，直至PFA完全溶解。离心去除不溶物，收集20% PFA上清液。每次均需新鲜配制。</li>
	<li>配制固定液：含1×固定缓冲液和4% PFA。</li>
	<li>用0.17 mg/ml三卡因麻醉斑马鱼。</li>
	<li>在解剖显微镜下使用尖头精细镊子，在透射光条件下拔除背侧鳞片，注意避免损伤含黑色素细胞的鳞片半部（图3A）。将鳞片直接从镊子转移至1 ml固定液中，室温避光孵育，持续振荡，时间不少于2小时。将鱼转移至养鱼用水中，并观察其恢复情况，确认复苏成功。</li>
	<li>为漂白色素化的黑色素细胞，将固定后的鳞片在PBST（1× PBS pH 7.4，0.1% Triton X-100）中室温洗涤2次，每次5分钟。加入1 ml新鲜配制的漂白液：含0.4 ml 10% KOH和0.15 ml 30% H2O2，用dH2O定容至5 ml。用Parafilm封口或拧紧管盖，防止气体积聚导致管子爆开。持续漂白至色素完全消失（通常约10分钟）（图3B,C）。随后在PBST中室温洗涤4次，每次5分钟。</li>
	<li>用封闭液（含1× PBS pH 7.4、0.2% Triton X-100、2 mg/ml BSA、1% DMSO、0.02% NaN3 和2%羊血清）在室温下封闭至少30分钟。若后续使用HRP反应显色，则省略NaN3。</li>
	<li>在封闭液中加入一抗，室温孵育过夜。确保样品完全浸没，液体体积不少于400 μl。</li>
	<li>在PBST中室温洗涤鳞片3次，每次30分钟。</li>
	<li>在封闭液中加入二抗，室温孵育2小时至过夜。</li>
	<li>用含0.1 μM DAPI的PBST+染色10分钟。</li>
	<li>用PBST室温洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>将鳞片置于载玻片上，滴加一滴Vectashield封片剂，使鳞片凹面朝下接触载玻片，然后加盖盖玻片。用透明指甲油密封玻片边缘，在荧光显微镜下观察样品（图3D,E,F,G）。</li>
</ol>
4. 移植实验
<ol>
	<li>在移植前一日，对2-3月龄的casper9受体鱼进行25 Gy伽马射线辐照处理10，随后将其放入养鱼用水中恢复。</li>
	<li>按照前述方法（第2.2节）处死一只荷瘤鱼。</li>
	<li>切除肿瘤组织并置于含有约5 ml滤膜灭菌的0.9x PBS（含5% FBS）的培养皿中，在溶液中用刀片将肿瘤切成小块。</li>
	<li>室温下操作，使用P1000移液器反复吹打以获得单细胞悬液。用滤膜灭菌的0.9x PBS（含5% FBS）将体积补至25 ml。</li>
	<li>通过40 μM细胞滤网过滤。</li>
	<li>在Eppendorf 5810R台式离心机中以1,500 rpm（453 rcf）离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞重悬于适量体积中，使其浓度接近目标浓度（假设100 mm3肿瘤约为107个细胞）。</li>
	<li>使用血细胞计数板精确计算细胞数量，并稀释细胞悬液，使最终注射体积约为5 μl。例如，若需注射50,000个细胞，则应将细胞悬液稀释至终浓度为10,000个细胞/μl。每隔几分钟轻弹装有细胞悬液的离心管，防止细胞聚集。</li>
	<li>用100%乙醇和0.9x PBS将26s规格（斜面尖端）701 N 10 μl Hamilton注射器冲洗2-3次。吸取5 μl细胞悬液至注射器中。</li>
	<li>用0.17 mg/ml三卡因麻醉经辐照的受体鱼，并将鱼侧置于湿润的Kimwipe纸巾上（图4A）。</li>
	<li>一手固定鱼体，另一手持针头，使斜面朝上，以约45°角插入鱼体侧腹、腹腔上方区域，位置大约位于后脑边界与背鳍前缘之间的中点处。轻轻推动注射器推杆（图4B）。</li>
	<li>将鱼放回新鲜养鱼用水中使其恢复，并每日观察肿瘤是否成功植入（图4C）。若植入成功，可继续观察肿瘤生长及疾病进展。</li>
</ol>

<ol><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li>
<li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li>
<li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li>
<li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+of+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

miniCoopR 方法能够在斑马鱼黑色素细胞中表达目的基因。该方法利用了斑马鱼mitfa基因具有细胞自主性这一特性。因此，通过 miniCoopR 载体挽救的黑色素细胞必定含有该微型基因以及与其物理连接的任何目的基因。被挽救的黑色素细胞清晰可见，并可在单细胞胚胎时期注射后获得的个体中观察到。通过选择特定程度的嵌合状态，可对超过该阈值的个体进行肿瘤发生或其他表型特征的评分。miniCoopR 方法的一个主要优势在于，无需为每个测试的目的基因建立稳定的转基因品系，即可快速识别并评分具有足够嵌合程度的个体。所节省的时间、人力和成本与待检测目的基因的数量成正比。
如先前报道5，基于miniCoopR的方法使我们能够筛选人类黑色素瘤中染色体1上反复扩增区域内的众多候选癌基因。其他染色体区段也可采用类似方法进行筛选。此外，该方法可用于在黑色素细胞中表达任意基因，并可监测这些细胞的任何特征。更广泛地说，将目的基因与拯救型微型基因耦合的原理可应用于其他组织类型。对于此类应用，需要有组织特异性的遗传突变体以及相应的细胞自主发挥作用的拯救基因。在斑马鱼及其他...

<table><tbody><tr><td>Gateway 重组试剂</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miniCoopR</td><td></td><td></td><td>参考文献&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Mitfa 抗体</td><td></td><td></td><td>参考文献&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>FITC 标记的山羊抗兔 IgG 抗体</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;casper&lt;/em&gt; 斑马鱼</td><td></td><td></td><td>参考文献&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>701N 10 &amp;mu;l 注射器</td><td>Hamilton/Fisher</td><td>14-824</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;M 滤膜</td><td>BD Falcon/Fisher</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr></tbody></table>

使用斑马鱼原位肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰基因

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

人类癌症的基因组学研究已提供了大量关于肿瘤中发生改变的基因的信息1,2,3这些研究面临的一个挑战在于，许多基因发生了改变，难以区分哪些基因改变是驱动肿瘤发生的，哪些是在转化过程中偶然出现的。为了做出这一区分，有必要采用一种能够定量测量基因改变对肿瘤起始以及其他促进肿瘤持续存在和扩散过程的影响的检测方法。本文介绍了一种利用同源性肿瘤模型在斑马鱼中快速筛选大量候选黑色素瘤修饰基因的方法。4 涵盖黑色素瘤起始与维持所需的各个步骤。该实验中的关键试剂是 miniCoopR 载体，其结合了一个野生型拷贝的 mitfa 黑色素细胞特化因子的Gateway重组盒，候选黑色素瘤基因可重组进入该盒5miniCoopR 载体具有 mitfa 包含野生型启动子、开放阅读框和3'-非翻译区的拯救型微型基因 mitfa 基因。它使我们能够利用候选黑色素瘤调控因子的全长开放阅读框构建表达载体。随后可将这些单个克隆注射到单细胞中 Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)斑马鱼胚胎。miniCoopR 载体通过 Tol2介导的转基因技术6 并挽救黑素细胞。由于它们在物理上与 mitfa 通过拯救微型基因，候选基因在被拯救的黑素细胞中表达，其中部分细胞将发生转化并发展为肿瘤。可利用无黑色素瘤生存曲线、侵袭实验、抗体染色及移植实验来评估候选基因对黑色素瘤启动及黑色素瘤细胞特性的影响。

将含有黑色素瘤癌基因 SETDB15 或 EGFP 的 miniCoopR 载体（均受 mitfa 启动子调控）显微注射到单细胞 Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf) 斑马鱼胚胎中。筛选出黑色素细胞恢复的胚胎并使其发育成熟。选取2月龄时黑色素细胞恢复面积大于4 mm2的个体。每周对动物进行黑色素瘤筛查。成年鱼的肿瘤发生率曲线显示，与 EGFP 对照组相比，SETDB1 癌基因显著加速了黑色素瘤的发生（图1）。选取肿瘤位于后脑后边界与背鳍前边界之间的个体（图2A）进行后续实验。在黑色素瘤发生两周后，将动物用4%多聚甲醛固定，切片并进行苏木精-伊红染色，以评估黑色素瘤向深层组织的侵袭情况。SETDB1 表达的黑色素瘤比 EGFP 对照组黑色素瘤具有更强的局部侵袭性（图2C）。为检测候选基因的表达，从野...

介绍了一种利用斑马鱼原位肿瘤模型快速筛选黑色素瘤调控因子的方法。该方法利用miniCoopR载体，可在黑色素细胞中表达候选黑色素瘤基因。文中描述了获取无黑色素瘤生存曲线的方法、侵袭实验、鳞片黑色素细胞的抗体染色方案以及黑色素瘤移植实验。

人类癌症的基因组学研究已提供了大量关于肿瘤中发生改变的基因的信息1,2,3。这些研究带来的一项挑战是……

以下实验的总体目标是利用斑马鱼自体肿瘤模型筛选黑色素瘤的修饰基因。该目标通过构建转基因动物实现，使其中的黑素细胞表达目标基因，并使鱼类易患黑色素瘤。随后通过评分黑色素瘤的发生时间，评估目标基因是否影响肿瘤的启动过程。然后进行肿瘤侵袭和细胞特异性检测，以确定目的基因对黑色素瘤及癌前黑色素细胞的其他影响。最后，将黑色素瘤细胞移植，以检测目的基因对已形成肿瘤中黑色素瘤起始细胞频率的影响。实验结果揭示了候选基因对黑色素细胞和黑色素瘤多种特性的影响，包括发生、侵袭及移植能力。与现有的种系转基因等方法相比，该技术在筛选候选癌症基因方面的主要优势在于节省了时间、人力和成本，并通过检测提高了通量。在嵌合转基因动物中可观察到肿瘤发生的多个方面。演示本实验操作的是我实验室的研究生 Sherania Agar。首先通过 PCR 扩增目的基因的全长开放阅读框，并将其重组至 pDONR221 载体中，以构建 Gateway 中间入门克隆。然后利用多基因位点 Gateway 技术，将感兴趣的黑色素细胞特异性 mifa 启动子基因和多聚腺苷酸化信号重组到 mini Cooper 载体中，使目的基因受 mifa 启动子的调控。将每个克隆 25 皮克（pg）以及 25 皮克的 TOL2 转座酶 mRNA 共同注射到单细胞转基因三重纯合斑马鱼胚胎中。mifa BRAF V600E 突变动物表现为黑色素细胞缺乏，并易于发生转化及黑色素瘤形成。除了目标基因外，mini Cooper 载体还包含一个可挽救的 MVA mini 基因，因此成功注射的动物将发育出被挽救的黑色素细胞，这些细胞表达目标基因。将显微注射后的胚胎在受精后24小时（HPF）置于28.5摄氏度条件下培养。在受精后72小时，于白色背景下使用解剖显微镜在透射光下剔除所有死亡的胚胎。筛选出黑色素细胞得到恢复的转基因个体。当动物发育至受精后四天时，将其转移至斑马鱼设施 nursery 中的三升培养缸内。在两个月龄时，挑选出至少有一个黑色素细胞修复区域大于四平方毫米的个体。每周对选中的个体进行一次肿瘤出现情况的筛查。将荷瘤动物隔离用于研究。以周龄为横坐标，黑色素瘤-free生存率为纵坐标，绘制黑色素瘤-free生存曲线。比较表达目的基因的黑素细胞动物与表达EGFP和黑素细胞的对照动物。使用对数秩检验来确定两条曲线是否存在统计学差异。进行肿瘤侵袭实验时，首先选择那些在后脑后缘与背鳍前缘之间区域背侧发育出肿瘤的斑马鱼个体。黑色素瘤发生两周后，在将鱼固定并包埋于石蜡中后，使用三卡因（trica）对鱼实施安乐死。通过病灶部位制作5微米厚的横切面切片，每隔50微米切一片，贯穿整个病灶，以便确定侵袭最深的位置。使用血红素和伊红对切片进行染色。通过检测肿瘤细胞是否超出致密胶原层、侵入背侧肌肉组织或进一步侵入脊柱，来评估肿瘤的侵袭情况。对两组样本进行统计学分

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对黑色素瘤修饰符一个斑马鱼原地肿瘤模型的筛选

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