使用斑马鱼原位肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰基因

以下实验的总体目标是利用斑马鱼自体肿瘤模型筛选黑色素瘤的修饰基因。该目标通过构建转基因动物实现，使其中的黑素细胞表达目标基因，并使鱼类易患黑色素瘤。随后通过评分黑色素瘤的发生时间，评估目标基因是否影响肿瘤的启动过程。

然后进行肿瘤侵袭和细胞特异性检测，以确定目的基因对黑色素瘤及癌前黑色素细胞的其他影响。最后，将黑色素瘤细胞移植，以检测目的基因对已形成肿瘤中黑色素瘤起始细胞频率的影响。实验结果揭示了候选基因对黑色素细胞和黑色素瘤多种特性的影响，包括发生、侵袭及移植能力。

与现有的种系转基因等方法相比，该技术在筛选候选癌症基因方面的主要优势在于节省了时间、人力和成本，并通过检测提高了通量。在嵌合转基因动物中可观察到肿瘤发生的多个方面。演示本实验操作的是我实验室的研究生 Sherania Agar。首先通过 PCR 扩增目的基因的全长开放阅读框，并将其重组至 pDONR221 载体中，以构建 Gateway 中间入门克隆。

然后利用多基因位点 Gateway 技术，将感兴趣的黑色素细胞特异性 mifa 启动子基因和多聚腺苷酸化信号重组到 mini Cooper 载体中，使目的基因受 mifa 启动子的调控。将每个克隆 25 皮克（pg）以及 25 皮克的 TOL2 转座酶 mRNA 共同注射到单细胞转基因三重纯合斑马鱼胚胎中。mifa BRAF V600E 突变动物表现为黑色素细胞缺乏，并易于发生转化及黑色素瘤形成。

除了目标基因外，mini Cooper 载体还包含一个可挽救的 MVA mini 基因，因此成功注射的动物将发育出被挽救的黑色素细胞，这些细胞表达目标基因。

将显微注射后的胚胎在受精后24小时（HPF）置于28.5摄氏度条件下培养。在受精后72小时，于白色背景下使用解剖显微镜在透射光下剔除所有死亡的胚胎。筛选出黑色素细胞得到恢复的转基因个体。

当动物发育至受精后四天时，将其转移至斑马鱼设施 nursery 中的三升培养缸内。在两个月龄时，挑选出至少有一个黑色素细胞修复区域大于四平方毫米的个体。每周对选中的个体进行一次肿瘤出现情况的筛查。

将荷瘤动物隔离用于研究。以周龄为横坐标，黑色素瘤-free生存率为纵坐标，绘制黑色素瘤-free生存曲线。比较表达目的基因的黑素细胞动物与表达EGFP和黑素细胞的对照动物。

使用对数秩检验来确定两条曲线是否存在统计学差异。进行肿瘤侵袭实验时，首先选择那些在后脑后缘与背鳍前缘之间区域背侧发育出肿瘤的斑马鱼个体。

黑色素瘤发生两周后，在将鱼固定并包埋于石蜡中后，使用三卡因（trica）对鱼实施安乐死。通过病灶部位制作5微米厚的横切面切片，每隔50微米切一片，贯穿整个病灶，以便确定侵袭最深的位置。

使用血红素和伊红对切片进行染色。通过检测肿瘤细胞是否超出致密胶原层、侵入背侧肌肉组织或进一步侵入脊柱，来评估肿瘤的侵袭情况。对两组样本进行统计学分析以确定差异，并进行免疫染色。

在解剖显微镜下，使用含0.17毫克/毫升三卡因的溶液对鱼类进行麻醉，并用散射光照亮。使用尖端锋利的细镊子拔除背鳞，注意不要损伤含有黑色素细胞的鳞片半侧。

用镊子将鳞片直接放入1毫升固定液中，在室温下旋转孵育，时间不少于两小时。将鱼转移至养鱼用水中，观察鱼的状态，确认其成功恢复以漂白有色素的黑色素细胞。首先用PBST在室温下清洗固定后的鳞片，每次5分钟，重复两次。

接着，加入一毫升新配制的漂白液，并用封口膜或瓶盖密封，以防止气体积聚导致管子爆裂。继续漂白至色素完全消失。然后在室温下用PBST洗涤四次，每次五分钟。

在封闭液中孵育至少30分钟，然后加入约400微升一抗与封闭液的混合液，于室温下避光孵育过夜。次日，在室温下用PBS洗涤鳞片三次，每次30分钟；随后在室温下加入二抗孵育2小时至过夜。完成dpi孵育后，取一滴封片剂滴于载玻片上，将鳞片置于其上，使鳞片的凹面朝下紧贴载玻片，再盖上盖玻片。

使用透明指甲油封闭边缘，并在荧光显微镜下观察载玻片。移植前一日，对2至3月龄的Casper鱼进行25戈瑞的γ射线照射作为受体。将鱼置于养鱼用水中恢复。

使用三卡麻醉荷瘤鱼，切断肿瘤并将其放入含有约五毫升滤膜灭菌的0.9 XPBS（含5% FBS）的培养皿中，在室温下于溶液中用刀片将肿瘤切碎，使用P1000移液器反复吹打以获得单细胞悬液。将体积补至25毫升。通过40微米细胞筛过滤溶液，并在台式离心机中以453 RCF离心10分钟。

将沉淀重悬于0.9% PBS 5% FBS中，调整至所需浓度。使用血细胞计数板计算准确的细胞数量，并稀释细胞悬液，使最终注射体积约为5 µL。例如，若需注射50,000个细胞，则细胞悬液应稀释至终浓度为10,000个细胞/µL。

每隔几分钟轻弹一次含有细胞悬液的离心管，以防止细胞与100%乙醇和0.9倍磷酸盐缓冲液（XPBS）发生结块。在将五微升细胞悬液装入26号斜面尖端的701型及10微升Hamilton注射器之前，需用其吸取液体冲洗两到三次。将经照射处理的受体鱼在三卡因（trica）中麻醉后，将其侧放在湿润的Kim擦拭纸上。

用一只手固定鱼体，将针头斜面向上，以45度角插入鱼体侧腹、腹腔上方的位置，位置大约在后脑边界与背鳍前缘之间的中点处。轻轻下压针栓。

将鱼放入新鲜的鱼水中使其恢复，并每天观察鱼的肿瘤移植情况。如果移植成功，还可观察到肿瘤的持续生长和疾病进展。此处所示为，在MFA启动子调控下，向单细胞期BRAF FP 53 MIFA斑马鱼胚胎中注射含有黑色素瘤癌基因组合DB1或EGFP的mini Cooper载体。

成年鱼的肿瘤发生曲线显示，与EGFP对照组相比，SET DB1显著加速了黑色素瘤的发生。如图所示，苏木精和伊红染色表明，表达SET DB1的黑色素瘤比EGFP对照组黑色素瘤更具局部侵袭性。该图显示了经漂白或未漂白的斑马鱼背部鳞片，这些鳞片使用识别核定位Mifa转录因子的抗体进行染色，以评估肿瘤的移植能力。黑色素瘤细胞来源于一只注射了miniCoopR-EGFP的BRAF V600E；p53 Mifa斑马鱼，将50,000个细胞皮下注射到前一天经25 Gy照射的Casper突变体受体鱼中，如图所示，在两周龄时可观察到肿瘤生长。

来源于色素供体的细胞很容易被识别。因此，在该技术建立后，为癌症生物学领域的研究人员利用斑马鱼研究与黑色素瘤相关的遗传改变的功能后果铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用斑马鱼自体肿瘤模型，通过检测肿瘤发生、侵袭、基因表达和移植能力的差异，筛选黑色素瘤的修饰因子。