实验方法测试的影响，在怀孕期间对酒精诱导的细胞凋亡在C57BL / 6小鼠神经营养肽，ADNF-9

该程序的目的是评估营养肽在胎儿酒精暴露模型中的神经保护作用。这是通过首先与实验动物交配，然后用营养肽处理怀孕的雌性来实现的，作为第二步，解剖胎儿以分离胎儿大脑用于实验用途。接下来，将胎儿大脑包埋在明胶中进行切片，然后进行隧道染色以确定细胞死亡结果。

这表明产前酒精暴露会增加神经节隆起中隧道阳性细胞的数量。与对照组营养肽的给药相比，与对照酒精处理的动物相比，D 和 F 9 显着降低了酒精诱导的隧道阳性细胞的增加。因此，这种金属的视觉演示至关重要，因为胎儿大脑解剖和嵌入步骤很难学习，因为胎儿大脑非常小，无法解剖和处理切片第一品种 C 57 黑色六只小鼠，方法是将大约 20 克的 6 周龄雌性小鼠放入雄性家笼中，在取出后立即放置两个小时。

检查每只雌性是否有精子栓，以确认已发生交配。如果存在精子栓，则指定这个胚胎零日在 E 上 7 体重将怀孕女性分为四组。一个酒精流质饮食组作为唯一的营养来源提供免费。

2 Perfed 对照组 3 肽治疗组，应接受腹膜内注射 DNF 9 肽，同时酒精暴露。流质饮食。记录动物在 24 小时内从 30 毫升刻度螺旋盖管中消耗的流质饮食量，以确定每日酒精、流质饮食或配对流质饮食的量，这些量可以通过游离过量作为营养来源提供。

确保在通过二氧化碳安乐死牺牲怀孕的 Myer E 13 后，每天从 E 7 到 E 13 提供新鲜制备的流质饮食，然后进行宫颈脱位。将尸体仰卧放在解剖板上，用 70% 乙醇清洁腹部。使用无菌剪刀和镊子做腹部切口。

张开后，用镊子握住子宫，并使用第二把镊子缓慢而轻柔地将子宫内膜从子宫中撕开，而不会刺穿胚胎。小心地从子宫中取出胚胎，并将其转移到 Hank 的平衡分选溶液中 在湿冰上的 60 毫米 x 15 毫升细胞培养皿中，使用超细镊子将培养皿和冰容器放在立体显微镜的载物台上进行显微解剖。拉下头部顶部的胚胎皮肤，露出头骨。

一旦颅骨暴露并在立体显微镜下清晰可见，用镊子抓住脊髓和脑干水平的颅底，然后开始剥落颅骨。继续从头部的后部到前部一块一块地剥下头骨。一旦大脑完全暴露，就用镊子将其提取出来。

然后在 4% 石聚糖醛中解剖从原始或工厂球根到 Met Postfix 的基部，所有解剖的胎脑两到三天。如果对胎儿大脑进行蛋白质印迹或酶测定测试，也可以冷冻胎儿大脑。在蒸馏水中制备 10% 的 A 级明胶溶液后，将剥离的包埋模具中填充，然后等待明胶凝固。

将对照和产前治疗的胎儿大脑并排放在凝固的明胶上。这是为了保持对照组和实验组之间的条件一致。确保明胶不会太热，并在胎脑顶部加入液体明胶以制作完整的模具。

最终模具应类似于此图像，将准备好的明胶模具冷藏 15 分钟，该模具将胎儿大脑保持 15 分钟。接下来，撕下嵌入的模具塑料。最终模具应看起来像这样，然后将含有明胶的胎脑转移到 4% 的石聚醛中两天。

第三天，将含有固定胎脑的明胶块连接到 viome 阶段。然后使用设置为 25 至 50 微米厚度的 viome 对大脑进行冠状切片。将胎儿脑切片收集在 PBS 中，然后将胎儿脑切片安装在超级霜和载玻片上，在水中，让它们干燥 15 分钟。

15 分钟后。将载玻片放入 PBS 中，以便第二天测试隧道反应。首先，将玻片浸入 20 μg/mL 蛋白酶 K 和 PBS 的溶液中，在 37 摄氏度下浸泡 5 分钟。

然后在定轨摇床上用 PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。在室温下用 3% 过氧化氢的甲醇溶液孵育切片 10 分钟，不要摇晃。然后像以前一样清洗载玻片。

接下来，将切片在可渗透溶液中在冰上孵育 2 分钟。孵育后，在 PBS 中洗涤两次。和以前一样，使用实验室纸巾擦干切片周围的载玻片区域。

然后用拍打笔在幻灯片上的各部分周围画画。这可以防止染色溶液泄漏，从而允许使用少量。用根据制造商的说明制备的隧道反应混合物孵育每对一个切片。

将不含隧道试剂的载体溶液添加到阴性对照部分。然后将载玻片在 37 摄氏度下孵育 1 小时。孵育时间过后，像以前一样在轨道摇床上用 PBS 洗涤载玻片 3 次。

然后用实验室抹布擦干组织周围的区域。接下来，将切片与转化器 POD 溶液在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，不要摇晃。然后用 tris HCL 冲洗切片 3 次，每次 5 分钟。

将玻片转移到支架上，并将它们放入含有 0.05% DAB 和 0.003% 过氧化氢的 Coplin 染色缸中。用铝箔盖住罐子，并在孵育后将其放在冰上的轨道振荡器上 7 分钟，如果需要，像以前一样洗涤 PBS。载玻片可以储存在 PBS 中，然后再进行导弹反染色，如方案的文本部分所述。

下图显示了神经营养肽 A DNF 9 对神经营养肽对酒精诱导的细胞凋亡的影响，在神经节隆起处使用隧道测定，因为 E 13 期产前酒精暴露诱导细胞死亡增加，如 A LC 组与 PF 组相比的箭头所示。A D NF nine 给药与产前酒精暴露诱导隧道阳性细胞减少。统计分析表明，AD 和 F 9 给药可防止酒精诱导的隧道阳性细胞增加。

值显示为平均值加平均值减去平均值的标准误差。单个星号表示 P 值小于 0.052。星号表示 Newman Coles 事后检验的 P 值小于 0.01。

每组包含 N 为 4。所以在其发展之后，这种技术方式为研究人员和大脑发育领域提供了探索药物或化合物对小鼠大脑发育的影响。