Name: 简单和高效的睾丸细胞悬液的制备技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: 学习一种简单高效的啮齿动物睾丸细胞悬液制备技术，无需酶处理，仅需15分钟即可完成机械解离和过滤。该方法能保持细胞活力和大分子完整性，适用于流式细胞术分析和基因表达研究。

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本工作部分由 CSIC（I+D 项目 C022）和 PEDECIBA 资助。作者谨向蒙得维的亚巴斯德研究所细胞生物学单元的 Mariela Bollati 和 Valentina Porro 致以诚挚感谢，感谢她们在 MoFlo 细胞分选仪使用方面提供的大力支持；同时感谢 Merial-Montevideo 慷慨提供本项目所用的全部豚鼠样本。图 1 经 BioMed Central 许可转载；图 2、图 3 和表 1 经瑞士巴塞尔 S. Karger AG 许可转载；图 4 和图 5 经 John Wiley &amp; Sons, Inc（版权归属 Wiley-Blackwell，2011 年）许可转载或改编。

1. 细胞悬液的制备
<ol>
 <li>根据专业委员会（如IACUC或同等机构，在乌拉圭为国家动物实验委员会[CNEA]）的建议处死待用标本。在本实验中，采用戊巴比妥过量注射的方式。</li>
 <li>按照标准批准的操作程序解剖睾丸，并将其置于含有10 ml冰冷DMEM（添加10%胎牛血清）的96 mm玻璃培养皿中，冰上保存。</li>
 <li>去除白膜，将去被膜的睾丸切成每边2–3 mm的方形小块。</li>
 <li>随后将组织块放入Medimachine（一种自动机械研磨器）中进行处理，该仪器通过一次性处理单元内的不锈钢筛网和金属转子实现组织解离。操作时，将1 ml冷的含血清DMEM和4–5块组织放入50 μm的一次性处理单元中，开启解离仪，按照制造商的简单说明处理50秒。</li>
 <li>使用3–5 ml无针头注射器从解离单元中回收所得的细胞悬液。</li>
 <li>用预先用0.5 ml含血清DMEM浸润的50 μm尼龙滤网过滤细胞悬液。</li>
 <li>再用浸润过的25 μm尼龙滤网进行二次过滤，随后置于冰上保存。</li>
 <li>在Neubauer计数板中进行细胞计数，并用含血清DMEM调整细胞浓度至1–2 × 107 个细胞/ml。通常每克睾丸组织可获得至少4 × 107 个细胞。</li>
 <li>最后，加入NDA（2-萘酚-6,8-二磺酸二钾盐），使其终浓度为0.2%，以防止细胞聚集。</li>
 <li>可选步骤：按照制造商说明书，使用 commercially available 动物细胞活力检测试剂盒检测睾丸细胞悬液的细胞活力。</li>
</ol>
2. 流式细胞术分析
我们使用配备有Coherent氩离子激光器（调谐至488 nm发射）的BD FACSVantage流式细胞仪，对用高浓度碘化丙啶（PI）染色的细胞进行分析。（关于PI在应激条件下进入未固定细胞的问题，已在其他文献中讨论过9,10）。
<ol>
 <li>进行碘化丙啶（PI）染色时，将荧光染料以终浓度50 μg/ml加入细胞悬液中，于0 °C避光孵育10分钟。</li>
 <li>激光功率设定为100 mW，使用575/26带通滤光片收集FL2通道中的PI发射荧光。</li>
 <li>我们采用70 μm喷嘴进行流式细胞术检测。分选精母细胞群体时，分选模式设为Normal-R或Normal-C，包络设置为3个分选液滴。使用制冷装置将样品管和收集管保持在3 - 4 °C。调节样品压差，使细胞分析速率为每秒500至1,500个。</li>
 <li>使用CellQuest软件（BD）分析以下参数：前向散射光（FSC-H）；侧向散射光（SSC-H）；总发射荧光或脉冲面积（FL2-A）；以及荧光发射持续时间或脉冲宽度（FL2-W）。</li>
</ol>
或者，我们使用活体染料Hoechst 33342，使其终浓度为5 μg/ml，在37 °C避光孵育10分钟。细胞分析采用配备紫外激发波长激光器（功率25 mW）和70 μm喷嘴的MoFlo流式细胞仪（DakoCytomation）进行。数据处理使用Summit v4.3软件（DakoCytomation）完成。

<ol><li>Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeistrich%2C+ML+%22Methods+of+Cell+Biology%22">Methods of Cell Biology</a>. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).</li>
<li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation%2C+physical+characterization%2C+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li>
<li>Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602(2011).</li>
<li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li>
<li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li>
<li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+but+not+dead%3F+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li>
<li>Spanò, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li>
</ol>

本文所述的优化方法能够以快速且可重复的方式制备啮齿类动物睾丸组织的细胞悬液，避免使用酶和去垢剂处理，同时保持良好的细胞完整性和细胞类型比例。该方法操作简便，耗时短（15 分钟内完成睾丸解剖、组织切割及处理），操作步骤少，且无需酶解处理，是其主要优势。这些特点有助于较好地保存短寿命大分子，当需要获取原始细胞群体中具有代表性的化合物样本时，这一点尤为关键。
关于使用 PI 或 Hoechst 33342，我们在对睾丸细胞悬液进行流式细胞分析时，观察到使用其中任一染料所获得的结果图谱之间无明显差异。染料的选择将主要取决于使用者的偏好、可获得性以及后续实验计划。一方面，PI 成本较低，且应用广泛，因其无需使用配备紫外激光器的流式细胞仪或分选仪。另一方面，尽管我们已成功将经 PI 染色的细胞用于后续的分选及差异基因表达研究（图4），但在需要保持细胞完全活力的应用中，例如生殖细胞培养和/或移植4，Hoechst 33342 或其他低细胞毒性的活细胞染料可能是更优选择。
我们已能够分选...

<table><tbody><tr><td>Medimachine 系统</td><td>BD</td><td>340587</td><td></td></tr><tr><td>Medicon 单元（50 &amp;mu;m）</td><td>BD</td><td>340591</td><td></td></tr><tr><td>Filcon 单元（50 &amp;mu;m）</td><td>BD</td><td>340603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>430-2100</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAA</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>NDA</td><td>Chemos BmbH</td><td>277081</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>储存液浓度 5 mg/ml；使用时终浓度为 5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>287075</td><td>储存液浓度 1 mg/ml；使用时终浓度为 50 &amp;mu;g/ml</td></tr></tbody></table>

制备睾丸细胞悬液的简易高效技术

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

哺乳动物的睾丸是极为复杂的器官，包含超过30种不同的细胞类型，包括体细胞性腺细胞以及处于不同发育阶段的生殖系细胞。这种异质性对研究哺乳动物精子发生的基础构成了重要障碍，因为在进行大多数分子分析时，需要获得特定精子发育阶段的纯化或富集的细胞群体1。
 为了进行差异基因表达研究，已采用多种策略来获得富集或纯化的睾丸细胞群体，例如Staput2,3、离心淘析1和流式细胞术（FC）4,5。
大多数富集或纯化方法要求细胞处于悬浮状态。理想情况下，细胞悬液应能代表原始组织，具有较高比例的活细胞，较少的多核细胞（多核细胞的形成通常是由于生精上皮的合胞体特性6,7），且无细胞团块1。已有研究表明，仅通过机械法制备的睾丸细胞悬液比经胰蛋白酶处理的更易形成团块1。另一方面，使用RNase和/或解离酶（如胰蛋白酶和胶原酶）进行酶消化处理会导致特定大分子的降解，这对于某些后续应用是不利的。理想的操作过程应尽可能短，并尽量减少操作步骤，以良好地保存目标大分子（如mRNA）。目前从实体组织制备细胞悬液的常规方案通常耗时较长，高度依赖操作者技术，且可能选择性地损伤某些细胞类型1,8。
本文所述方案结合了高度可重复且极为快速的机械解离优势，无需酶处理，即可获得高质量的细胞悬液，适用于流式细胞术分析与分选4，以及后续的基因表达研究9。

此处所示为采用本方案制备的大鼠睾丸组织单细胞悬液的良好解离示例 图1. 
与酶处理方法6,8以及先前描述的机械解离方法2相比，本文所介绍的方法速度更快、操作步骤更少、易于重复（不依赖操作者），且产生的细胞碎片极少（尤其是与其他机械方法相比），多核细胞也极少（多核细胞的形成曾被报道是组织过度操作所致1,2）。此外，与酶处理方法不同，该方法避免了RNA酶、胰蛋白酶和胶原酶的使用，从而防止大分子降解。
另一方面，尽管先前的报道表明，仅通过机械方法制备的睾丸细胞悬液比经胰蛋白酶处理的细胞悬液更容易发生聚集1，但采用本方法所获得的细胞悬液中几乎未见细胞聚集现象，如图1所示。在这方面，我们发现添加NDA在防止细胞聚集以及避免后续流式分析过程中喷嘴堵塞方面非常有效。图1还显示出细胞碎片极少，这一点在图2所示的流式细胞术直...

本文介绍了一种新型的啮齿类动物睾丸细胞悬液机械制备方案，该方法无需使用酶和去污剂。该技术操作简便、快速、可重复性强，所获得的细胞悬液质量良好，适用于流式分选和RNA提取。

哺乳动物的睾丸是极为复杂的器官，包含超过30种不同的细胞类型，包括体细胞性腺细胞以及生殖系发育各阶段的细胞……

本视频将介绍一种非常简单且高效的方案，可在仅15分钟内从小鼠、大鼠和豚鼠等啮齿类动物中获得待测组织的单细胞悬液。该方法采用一种机械装置对包膜组织进行分散解离，经滤过和染色后，细胞悬液即可用于流式分析。细胞分析或分选细胞群体的均一性是研究雄性生殖细胞分化过程中生化与分子事件的前提。因此，睾丸组织具有超过30种不同类型的细胞，其异质性成为研究哺乳动物精子发生分子基础的主要难题之一。为此，已采用多种方法以富集或纯化睾丸细胞群体，包括聚乙烯吡咯烷酮（PU）法和离心沉降法。任何细胞分离方法的第一步都是制备细胞悬液。然而，现有的方案通常耗时较长，并可能导致短寿命分子（如RNA）的损失，这对于后续的表达分析是不利的。本文所介绍方案的主要优势在于，它消除了动物安乐死后至精子发生阶段特异性分子研究之间的多个步骤，同时仍能确保细胞悬液具有良好的质量和优异的细胞类型代表性。演示该实验操作的是AL实验室的研究员Ana Rodriguez博士，以及负责流式细胞分析的Federico San Lopez。该实验需要一套小型设备，即meach系统，及其配套的medicon和fcon附件。然而，fcon附件完全可以由相同孔径的尼龙膜替代。唯一需要的其他材料和试剂包括玻璃涂布棒、两个培养皿、剪刀和镊子、一个三到五毫升的注射器、肠腔、添加了10%胎牛血清和NDA的DMM培养基。如果计划进行涉及RNA操作的后续实验，则所有材料和溶液都应相应处理以执行该方案。将解剖得到的睾丸置于一个96毫米的玻璃培养皿中，内含10毫升添加了补剂的冰冻DMM溶液。取出TAL弗吉尼亚，将去头睾丸切成每边两到三毫米的方形小块。取四到五个这样的组织块，放入一次性分离用Medicon装置中，加入一毫升添加了D的培养基，然后在Meta Machine系统中处理50秒。每个Medicon装置内含一个固定的不锈钢筛网，上面约有一百个六边形孔，每个孔周围分布着六片微型刀片。将组织置于medicon腔室内的金属转子中，通过转子带动组织经过锐化的孔洞并穿过金属筛网进行分散，同时筛网下方的微型泵提供液体并冲洗出组织碎片。使用3至5毫升无针头注射器从medicon中收集细胞悬液。随后，用0.5毫升培养基浸润50微米的Falcon或同等规格的四层尼龙筛网，将细胞悬液通过该筛网过滤。重复该步骤，但使用25微米尼龙滤网或相应的Falcon单位，并将其置于冰上。取一份ALI的细胞悬液，在血细胞计数板中进行计数，并用培养基将细胞浓度调整至每毫升1×10⁷至2×10⁷个细胞。最后，加入NDA至终浓度为0.2%，以防止细胞聚集，并避免在后续流式分析过程中发生管道堵塞。如需评估细胞活力，可在流式细胞术分析前按照动物细胞活/死染色试剂盒生产商的说明加入荧光染料进行检测。荧光染料的选择将取决于可用的激光器。在本演示中，将展示多种结合DNA的染料的应用。尽管碘

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本文介绍了一种利用不连续的牛血清白蛋白密度梯度，结合常规实验室设备，从成年小鼠睾丸中富集粗线期精母细胞、圆形精子细胞和伸长中的精子细胞的实验方案。...

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本文描述了四种利用新生小鼠睾丸原代细胞生成睾丸类器官的方法，即细胞外基质（ECM）依赖性和非依赖性的二维（2D）及三维（3D）培养环境。这些技术具有多种研究应用价值，尤其适用于体外研究睾丸的发育过程和生理功能。...

基于细胞外基质与无细胞外基质的小鼠睾丸类器官生成方法

本文介绍一种简单高效的方法，用于从成年小鼠睾丸中分离存活的减数分裂期及减数分裂后生殖细胞。通过使用低细胞毒性、紫光激发的DNA结合染料结合荧光激活细胞分选技术，可获得高度富集的生精细胞群体，适用于多种下游应用。...

使用紫光激发的细胞通透性DNA结合染料分离小鼠生精细胞

学习一种简单高效的啮齿动物睾丸细胞悬液制备技术，无需酶处理，仅需15分钟即可完成机械解离和过滤。该方法能保持细胞活力和大分子完整性，适用于流式细胞术分析和基因表达研究。

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