制备睾丸细胞悬液的简易高效技术

本视频将介绍一种非常简单且高效的方案，可在仅15分钟内从小鼠、大鼠和豚鼠等啮齿类动物中获得待测组织的单细胞悬液。该方法采用一种机械装置对包膜组织进行分散解离，经滤过和染色后，细胞悬液即可用于流式分析。

细胞分析或分选细胞群体的均一性是研究雄性生殖细胞分化过程中生化与分子事件的前提。因此，睾丸组织具有超过30种不同类型的细胞，其异质性成为研究哺乳动物精子发生分子基础的主要难题之一。为此，已采用多种方法以富集或纯化睾丸细胞群体，包括聚乙烯吡咯烷酮（PU）法和离心沉降法。

任何细胞分离方法的第一步都是制备细胞悬液。然而，现有的方案通常耗时较长，并可能导致短寿命分子（如RNA）的损失，这对于后续的表达分析是不利的。本文所介绍方案的主要优势在于，它消除了动物安乐死后至精子发生阶段特异性分子研究之间的多个步骤，同时仍能确保细胞悬液具有良好的质量和优异的细胞类型代表性。

演示该实验操作的是AL实验室的研究员Ana Rodriguez博士，以及负责流式细胞分析的Federico San Lopez。该实验需要一套小型设备，即meach系统，及其配套的medicon和fcon附件。然而，fcon附件完全可以由相同孔径的尼龙膜替代。

唯一需要的其他材料和试剂包括玻璃涂布棒、两个培养皿、剪刀和镊子、一个三到五毫升的注射器、肠腔、添加了10%胎牛血清和NDA的DMM培养基。如果计划进行涉及RNA操作的后续实验，则所有材料和溶液都应相应处理以执行该方案。将解剖得到的睾丸置于一个96毫米的玻璃培养皿中，内含10毫升添加了补剂的冰冻DMM溶液。

取出TAL弗吉尼亚，将去头睾丸切成每边两到三毫米的方形小块。取四到五个这样的组织块，放入一次性分离用Medicon装置中，加入一毫升添加了D的培养基，然后在Meta Machine系统中处理50秒。每个Medicon装置内含一个固定的不锈钢筛网，上面约有一百个六边形孔，每个孔周围分布着六片微型刀片。

将组织置于medicon腔室内的金属转子中，通过转子带动组织经过锐化的孔洞并穿过金属筛网进行分散，同时筛网下方的微型泵提供液体并冲洗出组织碎片。使用3至5毫升无针头注射器从medicon中收集细胞悬液。随后，用0.5毫升培养基浸润50微米的Falcon或同等规格的四层尼龙筛网，将细胞悬液通过该筛网过滤。

重复该步骤，但使用25微米尼龙滤网或相应的Falcon单位，并将其置于冰上。取一份ALI的细胞悬液，在血细胞计数板中进行计数，并用培养基将细胞浓度调整至每毫升1×10⁷至2×10⁷个细胞。最后，加入NDA至终浓度为0.2%，以防止细胞聚集，并避免在后续流式分析过程中发生管道堵塞。如需评估细胞活力，可在流式细胞术分析前按照动物细胞活/死染色试剂盒生产商的说明加入荧光染料进行检测。

荧光染料的选择将取决于可用的激光器。在本演示中，将展示多种结合DNA的染料的应用。尽管碘化丙啶在低浓度下通常用于固定细胞或死细胞染色，但我们发现，当其在高浓度下使用时，可穿透采用本方法制备的悬浮液中的未固定睾丸细胞。

这可能是由于所涉及的机械应力所致，这种应力结合半上皮组织的感觉特性，可能在轻微操作下即导致细胞间连接桥的断裂。进行碘化丙啶染色时，在样本分析前10分钟，向细胞悬液中加入终浓度为每毫升50微克的碘化丙啶溶液，并在0摄氏度避光孵育。用于分析碘化丙啶染色的细胞。为进一步分选，我们使用配备有调谐至488纳米发射波长的相干氩离子激光器的FACS Vantage流式细胞仪。激光功率设置为100毫瓦，碘化丙啶发射的荧光通过FL2检测器收集，使用575/26带通滤光片。

使用70微米喷嘴进行流式细胞术检测，并使用Squa软件分析以下参数：前向散射、侧向散射、总发射荧光（脉冲面积）以及荧光发射持续时间（脉冲宽度）。结果以克为单位呈现，表示在每个荧光强度水平下的事件数量，同时以二维图显示侧向散射与荧光脉冲面积的关系，以及荧光脉冲面积与其宽度的关系。

使用荧光脉冲面积与脉冲宽度的 DO 图，通过 fax vantage 设定的正常 R 或正常 C 模式对单细胞单核细胞群体进行分选，并以三个已分选液滴作为包络，从而在分析中排除双联体。将样品流速调节至每秒 500 到 1500 个细胞进行分析。使用制冷装置将样品管和收集管保持在 3 至 4 摄氏度。

或者，也可使用其他荧光染料对悬液中的细胞进行染色。例如，可使用活体染料Hoechst 33342，终浓度为每毫升5微克，在37摄氏度避光孵育至少10分钟，用于Hirsch实验。

3、3、3、4、2 染色样本。细胞分析采用配备紫外激发波长激光（25 毫瓦）和 70 微米喷嘴的 MO 流式细胞仪进行。使用 Summit 4.3 软件或类似软件分析与之前相同的参数，当在相差光学显微镜下分析细胞悬液时，可观察到切割质量良好的悬液。

本方案的主要优势首先在于使用多种机械制备睾丸细胞悬液，整个过程仅需15分钟，包括睾丸切开、组织切割、机械处理和过滤等步骤，这一时间约为其他常规方案所需时间的八分之一。本方案耗时短，且操作步骤极少，因此能够良好地保存短寿命大分子，这对于获取原始细胞群体中化合物的代表性样本至关重要。由于该方法涉及的操作极少，因此在本表格中易于重复。

以七次独立实验中成年大鼠睾丸细胞群体的相对百分比为例，展示了通过流式细胞术分析的结果，用以说明该方法的可重复性。与目前制备睾丸细胞悬液常用的大多数颗粒不同，本文所述方法不涉及酶的作用。尽管在RNA中滴加胶原酶是通常包含的酶处理步骤，有助于组织分离，但这些酶可能会影响目标大分子的保存。

无需酶处理不仅有利于RNA和蛋白质的保存，还能降低实验成本。尽管此前有报道称，机械法制备的细胞悬液比经胰蛋白酶处理的更容易发生聚集，但我们发现，本方案在无酶作用的条件下仍可获得分散良好的细胞悬液。添加NDA已被证实能有效防止细胞聚集。

当样本接受流式细胞分析时，也可观察到悬浮液具有良好的质量，表现为所见的细胞碎片极少。根据已发表的信息，无论是通过完全机械法还是在胰蛋白酶存在下制备细胞悬液，约有13%的圆形精子表现为多核现象。然而，许多机器制备的悬液中多核现象极为稀少，最可能的原因是减少了组织缠结；据指出，多核细胞的产生主要源于组织操作过程中的机械损伤。

本图显示了由多种机器制备的大鼠睾丸细胞悬液示例。可以看出，细胞质保存良好，不同啮齿类动物经多种机器制备的睾丸悬液中，C二C和C四C细胞群体的相对百分比与完整睾丸组织中的情况相似。

这支持了本文所述方法不会选择性损伤特定细胞类型的假设。令人惊讶的是，与传统的滴滤制备方法相比，许多机器制备的悬液中细胞类型的代表性得以更好地保留。如图所示，经本方法处理的睾丸细胞悬液所获得的细胞图谱与此前报道的结果并无显著差异。

事实上，获得的直方图和点图显示了根据DNA含量呈现的三个特征性的四倍体（4C）到单倍体（1C）的睾丸细胞群体，以及明显凝聚的单倍体精子细胞亚群。这些图谱无论是使用Hoechst染料还是碘化丙啶染色的悬浮液均可观察到，并且在成年和幼年样本中均能观察到。基于DNA含量选择的睾丸细胞群体，以及具有相同DNA含量但染色质凝聚程度不同的亚群（如细线期精母细胞和粗线期精母细胞），其有丝分裂细胞的分选已成功实现，纯度超过98%。

正如我们在豚鼠睾丸组织悬液中所观察到的，在未进行RNA处理的情况下，分选后的细胞群体仍能获得高质量的RNA，从而可用于差异基因表达研究，即使是对经碘化丙啶染色的细胞群体也是如此。需要指出的是，与其他染料不同，碘化丙啶可同时染色DNA和双链RNA；然而，在该豚鼠睾丸组织悬液分析图中，使用碘化丙啶与活力周期橙（vibrant cycle orange）平行获得的相似图谱表明，RNA染色对流式细胞术直方图模式并无显著影响。

本列表总结了该百分比方案的主要优势。本文所述的优化方法可在仅15分钟内完成适用于流式细胞分析的啮齿类动物睾丸细胞悬液的制备，包括睾丸解剖、组织切割及通过ME机器系统进行处理。该方法耗时短、重复性高，且细胞悬液中各细胞类型的比值稳定，相较于目前其他更为繁琐且耗时的自行制备技术，是一种良好的替代方案。

此外，由于该方法操作步骤极少，且避免了酶和去污剂的使用，因此非常适合用于基因表达研究等精细的下游应用。