简单和高效的睾丸细胞悬液的制备技术

在本视频中，将介绍一种非常简单有效的方案，只需 15 分钟即可从啮齿动物那里获得测试材料的细胞悬浮液。该方法已应用于小鼠、大鼠豚鼠的测试测试，并使用 meta 机器装置解聚包膜组织。过滤和染色后，细胞 inion 即可进行流动。

Cyto 分析或分选 细胞群的同质性是分析雄性 GA 分化过程中生化和分子事件的先决条件。因此，具有 30 多种不同细胞类型的睾丸异质性代表了有关哺乳动物精子发生分子基础研究的主要问题之一。因此，已经使用了各种方法来获得富集到纯化的睾丸细胞群，包括 PU 和离心图解。

任何细胞分离方法的第一步都是制备细胞悬液。然而，目前的方案通常很耗时，并且可能意味着 RNA 等短寿命分子的损失，这对于不可告人的表达分析来说是不可取的。这里介绍的方案的主要优点是消除了动物处死和精子阶段特异性分子研究之间的步骤，但同时确保了细胞悬浮液中的良好质量和出色的细胞类型代表性。

开发该方法的 AL 实验室研究员 Ana Rodriguez 博士和负责细胞术分析的 Federico San Lopez 流式细胞术将演示该程序。该程序需要一小块设备，即 meach 系统，及其 medicon 和 fcon 附件。然而，fcon 附件可以完美地替换为相同孔径的尼龙膜。

唯一需要的其他材料和试剂是玻璃涂抹物、两个培养皿、剪刀和镊子、一个 3 到 5 毫升的注射器 annoy 肠腔、补充有 10% 胎儿咳嗽血清和 NDA 的 DMM 培养基。如果计划涉及 RNA作的下游应用，则应对所有材料和溶液进行相应处理以执行方案。将解剖的睾丸放入 96 毫米玻璃杯中，每个数据显示冰含有 10 毫升称为 dm 的补充冰。

取出 TAL Virginia，将开盖的睾丸切成每边 2 到 3 毫米的方形块。将其中 4 到 5 块与补充 D 的 1 毫升代码一起放入一次性解隔离的 medicon 中，并在 meta 机器系统中处理 50 秒。每个医疗单元都包含一个固定的不锈钢屏幕，该屏幕具有大约 100 个六边形孔，周围环绕着 6 个微型刀片。

组织由制药室内的金属转子带到每个孔中，并通过穿过磨尖的孔和金属筛网进行解离析，同时筛网下方的微型泵供应液体并冲洗外壳。使用无针头的 3 至 5 毫米注射器从 medicon 中恢复细胞悬液的结果。随后，将 50 微米的 falcon 或相同的四尺寸尼龙网与半毫升培养基浸泡，并通过它过滤悬浮液。

重复该步骤，但使用 25 微米尼龙网或等效的 falcon 装置并置于冰上，取细胞悬液的 ALI 报价以在 noyer 室中计数，并将细胞浓度调整为培养基中每毫升 7 个细胞的 1 到 2 倍 10 至 7 个细胞。最后，添加 NDA 至终浓度为 0.2%，以避免细胞泵送，并避免在后续流式研究期间堵塞肌肉。如果要评估细胞活力，则可以按照制造商的说明通过动物细胞的活死活力试剂盒进行，在流式细胞术分析之前添加荧光染料。

荧光染料的选择将取决于可用的激光器。在本演示中，将展示将文件与 DNA 结合的不同染料的使用。尽管丙啶 yo 饮食是低浓度固定或死细胞的常用染料，但我们发现，当以高浓度使用时，ROM 会进入由此处介绍的方法制备的悬浮液中未固定的睾丸细胞。

这可能是由于隐含的机械应力，这与半上皮的感觉性质相结合，可能导致细胞间连接桥断裂，只需最少的作 对于碘化丙啶染色，在样品分析前 10 分钟，在终浓度为 50 微克/毫升的溶液中对细胞悬液进行染色，并在黑暗中孵育零摄氏度 用于分析 μ 丙啶染色细胞。为了进一步分类，我们使用 Fax Vantage 流式细胞仪，该流式细胞仪配备了调谐为 488 纳米发射的相干 targon 离子激光器。激光功率设置为 100 毫瓦，并使用 5 7 5 斜杠 26 带通滤光片在 FL 2 检测器中收集丙啶 I 发射的荧光。

使用 70 微米喷嘴进行流式细胞术测量，并使用 squa 软件分析以下参数。前向散射、侧向散射、总发射荧光或脉冲面积以及荧光发射的持续时间或脉冲宽度。结果以克表示，表示每个荧光水平的事件数，D 图显示侧向散射与荧光脉冲面积和荧光脉冲面积与其宽度的关系。

使用荧光脉冲面积与其宽度的 DO 图将双联体排除在分析之外，以便在正常 R 或正常 C 中设置分选模式的传真有利位置对 SM 单核细胞群进行排序，并使用三个分选的液滴作为包络。调整样品差异以每秒 500 至 1500 个的速率分析细胞。使用制冷装置将样品和收集管保持在 3 到 4 摄氏度。

或者，悬浮液中的细胞可以用其他荧光染料染色。例如，活性染料。HER 3 3 3 4 2 的最终浓度为每毫升 5 微克，并在 37 度避光孵育至少 10 分钟，以治疗 Hirsch。

3、3、3、4、2 染色样品。通过配备 25 毫瓦紫外激发波长激光器和 70 微米喷嘴的 MO 流式细胞仪进行细胞分析。使用 Summit 4.3 软件或类似软件分析之前指示的相同参数，当在面部对比光学切割质量悬浮液下分析细胞悬液时，观察到悬浮液。

该方案的主要优点是首先，使用许多机器制备睾丸细胞悬液，并且仅获得 15 分钟，包括测试 C 剖腹产、组织切割、疼痛、机器处理和过滤，这个时间跨度约为其他方案通常所需时间的八分之一。该方案的简洁性以及涉及的最小处理将解释短寿命大分子的良好保存，这在需要原始细胞群中存在的具有代表性的化合物样品时至关重要。由于甲烷涉及最少的处理，因此在此表中很容易重现。

成年大鼠进行并通过流式细胞术分析的七项独立实验的不同睾丸细胞群的相对百分比作为示例，以显示该方法的可重复性。与目前大多数用于制备睾丸细胞悬液的颗粒不同，这里介绍的方法不涉及酶作用。尽管胶原酶滴落在 RNA（通常包含的酶）中会导致组织分离不足，但它们会影响目标大分子的保存。

缺乏酶处理不仅有利于 RNA 和蛋白质的保存，而且使方案更便宜。尽管之前已经报道过机械制备的细胞悬液比胰蛋白酶化的细胞悬液更容易结块，但我们发现该方案在没有酶促作用的情况下导致充分解析的细胞悬液。NDA 的纳入已被证明对防止细胞聚集非常有帮助。

当对样品进行细胞分析时，根据观察到的最小细胞碎片来判断，也证明了悬浮液的良好质量。根据已发表的信息，当细胞悬液完全通过机械方法制备或在胰蛋白酶存在下时，大约 13% 的圆形精子被发现为多核精子。然而，许多机器制备的悬浮液使多核细胞变得非常稀缺，很可能是由于减少了缠结，因为已经说过多核细胞主要是由于组织作而产生的。

在这张图片中观察到一个来自大鼠睾丸的多机器制备细胞悬液的实例。可以看出。细胞质保存完好，在许多机器制备的睾丸悬液中，C、两个 C 和四个 C 细胞群的相对百分比，用于不同的啮齿动物重新组装完整 PE 的

这支持了此处描述的方法不会选择性地破坏任何特定细胞类型的假设。令人惊讶的是，许多机器制备的悬浮液中的细胞类型表示比经典的滴注制备方法要好得多。可以看出，为 meine 加工的睾丸细胞悬液获得的细胞图形与先前报道的细胞图形并没有实质性地推迟。

事实上，获得的直方图和点图显示了基于 DNA 含量的三个特征 4 C 到 C 和 C 睾丸细胞群以及明显的 subha 群体，它代表了高度浓缩的单倍体精子。分别在 Her 持续或碘化丙啶染色悬浮液中观察到这些特征，这代表成年标本和幼年标本。已成功实现对 sper 有丝分裂细胞的分选，纯度超过 98%，无论是对于基于 DNA 含量的选定睾丸群，还是对于 DNA 含量相同但染色质浓缩水平不同的亚群，例如睡眠齿和齿状肌细胞。

正如我们在豚鼠测试悬浮液中观察到的那样，由于该方案不包括 RNA 处理分选的群体，因此具有良好的 RNA 质量，并且即使对于碘化丙啶染色的群体也允许进行差异基因表达研究。从这个意义上说，值得提醒的是，与其他染料、碘化丙啶染色剂、DNA 以及双链 RNA 不同，然而，在豚鼠睾丸悬液分析的图表中，使用碘化丙啶与充满活力的循环橙平行获得的相似曲线。这是一种重要的 DNA 特异性染料表明 RNA 染色不会显着影响细胞术直方图模式。

此列表总结了 percented 协议的主要优点。此处描述的优化方法可以在短短 15 分钟内加快制备合适的睾丸细胞悬液，用于对啮齿动物的不同精子阶段进行细胞分析，包括睾丸解剖、组织切割和通过 ME 机器系统进行处理。细胞悬液的简洁性、更高的重现性、质量和细胞类型比例使其成为目前使用的其他更繁琐且耗时的自制备技术的良好替代品。

此外，由于该方法涉及的作非常少，并且避免了酶和去污剂，因此它是精细下游应用（如基因表达研究）的理想选择。