Name: 斑马鱼幼虫的前脑的电生理记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 学习在完整斑马鱼幼虫前脑进行细胞外场电位记录的方法，用于监测癫痫样活动。该技术适用于基因修饰或药物诱导的癫痫模型研究，为神经科学和电生理学研究提供可靠工具。

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作者感谢Peter Castro和Matthew Dinday在实验室建立斑马鱼模型方面的早期工作。本研究由美国国立卫生研究院EUREKA基金（#R01NS079214-01）资助。

1. 卵的产生与收集
<ol>
	<li>斑马鱼的饲养遵循先前描述的标准操作流程8。简言之，将成年斑马鱼放入带有隔离板的繁殖缸中。次日早晨光照开启后，移除繁殖缸中的隔离板，让鱼自由交配约20至60分钟。</li>
	<li>用滤网收集繁殖缸中的卵，并用卵水冲洗。随后将卵转移至含有卵水的培养皿中，使用移液管去除未受精的卵和碎片。</li>
	<li>将含有收集卵的培养皿置于孵育箱中（28–32 °C）。卵受精后约两天（dpf）孵化，此时用移液管去除卵膜及其他碎片。</li>
	<li>在所需的受精后天数（3至8 dpf），取出含有自由游动幼鱼的培养皿，置于室温下的实验台面上。</li>
</ol>
2. 微电极的拉制与制备
<ol>
	<li>使用微量移液器拉制仪，将一根外径为1.2 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成两根微电极针，并将其放置在150 mm的培养皿或空的移液器盒中，架在橡皮泥制成的斜坡上保存。微电极针可预先拉制。可根据所用放大器头级的类型，选用不同外径的玻璃毛细管。</li>
	<li>使用带有Nalgene滤器（4 mm）和Microfil推杆（Warner Precision Instruments）的1 ml注射器，从微电极后端装入细胞外记录液（2 M NaCl）。轻轻摇动或轻敲注射器，使液体团块向针尖移动，直至残留气泡极少或完全消失。</li>
</ol>
3. 琼脂固定
<ol>
	<li>配制新鲜的1.2%低熔点琼脂溶液于养鱼用水中，并将琼脂溶液置于约37 °C的水浴中保温。</li>
	<li>准备带有记录腔室的盖玻片，放入冰箱冷冻5–10分钟。记录腔室应与电生理装置上使用的腔室一致。我们使用Warner Instruments公司生产的低剖面开放式钻石浴成像腔室（型号RC-26GLP）。</li>
	<li>使用巴斯德吸管或移液器，将一条幼年斑马鱼转移至洁净培养皿中的少量养鱼用水液滴中。向该液滴中加入含有麻醉剂（0.02%三卡因）和麻痹剂（1 mg/ml α-银环蛇毒素）的溶液液滴。</li>
	<li>观察斑马鱼运动是否停止（5至10分钟）。</li>
	<li>从冰箱中取出盖玻片/记录腔室，将其放置在体视显微镜的载物台上。使用移液器将数毫升1.2%低熔点琼脂糖溶液与含有斑马鱼的液滴混合，并将混合液转移至盖玻片/记录腔室中。</li>
	<li>在体视显微镜下使用移液器吸头或细钝针调整幼鱼位置，使其背侧朝向琼脂糖凝胶表面。静置使琼脂糖凝固（5–10分钟），然后使用扁平刮铲将凝胶块转移至电生理记录装置上的记录腔室中。</li>
</ol>
3. 细胞外场电位记录
<ol>
	<li>向记录室中加入 2–5 ml 斑马鱼记录液。如需更换药物，以约 1 ml/min 的流速用记录液灌注记录室。记录液无需供氧。</li>
	<li>将微电极（尖端直径约 1 μm，阻抗 2–7 MΩ）插入安装在三维显微操作器上的放大器头级。检查显微操作器是否处于合适位置，以确保具有足够的移动和调节范围。将微电极尖端移至显微镜视野平面，先将其置于远离载物台的高位，再通过粗调将其下降至斑马鱼头部略前方且稍高于头部的位置。</li>
	<li>将放大器置于“电流钳”模式，对电极进行调零。</li>
	<li>使用粗调缓慢降低电极尖端，使其刚好接触斑马鱼体表，位置位于前脑略前方。</li>
	<li>通过微调逐步推进电极尖端，直至刺穿斑马鱼皮肤。待其稳定后，再将电极向前推进数微米，进入前脑区域。</li>
	<li>使用 Axoscope 软件在电流钳模式下记录电活动。数据采集采样率为 10 kHz。</li>
</ol>

<ol><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressing+zebrafish+for+behavioral+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stressing zebrafish for behavioral genetics.</a> Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49(2011).</li>
<li>Rinkwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+an+integrative+system+for+neurogenomics+and+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences.</a> Progress in Neurobiology. 93 (2), 231(2011).</li>
<li>Penberthy, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for human disease.</a> Frontiers in Bioscience. 7, d1439(2002).</li>
<li>Letamendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+automated+high-throughput+system+for+zebrafish+in+vivo+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings.</a> PLoS One. 7, e36690(2012).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216(2000).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line.</a> Development. 123, 1(1996).</li>
<li>Suster, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Molecular Biology. 561, 41(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior%2C+neural+activity+and+c-fos+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131 (3), 759(2005).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48 (6), 1151(2007).</li>
<li>Williams, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+radiotelemetry+to+evaluate+electrographic+seizures+in+rats+with+kainate-induced+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39(2006).</li>
<li>Marsh, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interictal+EEG+spikes+identify+the+region+of+electrographic+seizure+onset+in+some%2C+but+not+all%2C+pediatric+epilepsy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients.</a> Epilepsia. 51 (4), 592(2010).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+application+of+modularly+assembled+zinc-finger+nucleases+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish.</a> Development. 138 (20), 4555(2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍的细胞外记录方法能够对脑部活动进行高灵敏度和快速的分析。这些记录类似于临床上常用的脑电图（EEG）监测，可用于评估是否存在异常的电活动放电即，癫痫啮齿类动物模型中的癫痫发作）11 和患者12细胞外记录可与药理学干预相结合，如此处所示。此类记录还可用于评估基因修饰斑马鱼中潜在的癫痫表型。对于通过ENU诱变筛选鉴定出的许多基因突变，通常可获得相应的突变型斑马鱼（参见Zebrafish International Resource Center, <a href="http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php" target="_blank">http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php</a>或通过新兴的 Tol2 转基因方法7 和锌指核酸酶13 技术。如本研究所示，使用吗啉代寡核苷酸进行快速基因敲降，随后在最早3天受精后（dpf）即开展电生理监测，为评估致癫痫基因缺陷提供了一种额外的方法。记录电极可轻松放置于斑马鱼的任何脑区结构，包括视顶盖或小脑，必要时亦...

<table><tbody><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Fisher-Scientific</td><td>BP1360-100</td><td>在胚胎培养液中溶解至1.2%</td></tr><tr><td>记录介质</td><td>Fisher-Scientific</td><td>BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500</td><td>1 mM NaCl，2.9 mM KCl，10 mM HEPES，1.2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，10 mM葡萄糖，2.1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;用 1 N NaOH 将 pH 调至约 7.3</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Argent 实验室</td><td>MS-222</td><td>0.02%</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-bungarotoxin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2133</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>毛细玻璃管</td><td>Warner Instruments</td><td>G120TF-3</td><td>拉至电阻为 2-7 MΩ&amp;#937;</td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>Warner Instruments</td><td>PC-505B</td><td>我们使用Warner放大器，设置为电流钳模式；增益设为2 mV/pA，贝塞尔滤波器设为2K。可根据制造商说明使用其他类似型号。</td></tr><tr><td>滤波器/放大器</td><td>赛格纳斯科技</td><td>FLA-01</td><td>我们使用 Cygnus 前置放大器；增益设定为 10-20；截止频率设定为 1-2K；启用陷波滤波器。可根据制造商说明书选用性能相当的其他型号。</td></tr><tr><td>Axon A/D 板与 Axoscope 软件</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Digidata 1320A；Axoscope 8.2</td><td>使用Axoscope以无间隙采集模式收集数据，采样频率为10 KHz。可根据制造商说明使用其他类似型号的设备和软件。</td></tr><tr><td>卵水</td><td>Instant Ocean</td><td></td><td>3 克 Instant Ocean 海盐，2 毫升 0.1% 亚甲蓝溶于 10 毫升去离子水中</td></tr></tbody></table>

幼年斑马鱼前脑电生理记录

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

癫痫影响着美国近300万人以及全球多达5000万人。癫痫被定义为自发性、无诱因的惊厥发作，可能由脑部损伤或基因突变引起。在动物模型中研究惊厥的努力主要采用在啮齿类动物中诱导脑损伤（如致惊厥药物、电刺激或脑外伤）或进行遗传操作（如反义寡核苷酸敲低、同源重组或转基因技术）。斑马鱼作为一种脊椎动物模型系统1-3，可为基于啮齿类的癫痫研究提供有价值的替代方案。斑马鱼被广泛用于脊椎动物遗传学或发育研究，其基因与哺乳动物具有高度相似性，并且表达了约85%已知人类单基因癫痫突变的同源基因。由于体型较小（体长4–6 mm），斑马鱼幼体在早期发育阶段可维持在低至100 μl的液体体积中，并可排列于多孔板内。试剂可直接加入胚胎发育所处的溶液中，从而简化药物给药过程，并实现测试化合物的快速体内筛选4。合成寡核苷酸（吗啉代寡核苷酸）、诱变、锌指核酸酶以及转基因技术均可用于在斑马鱼中快速生成基因敲低或突变5-7。这些特性使得斑马鱼在研究癫痫等神经系统疾病时，相较于啮齿类动物具有前所未有的统计功效分析优势。由于癫痫研究的“金标准”是监测和分析起源于中枢脑结构的异常电活动（即惊厥），本文介绍了一种高效记录斑马鱼幼体脑活动的方法。该方法是对传统细胞外记录技术的改进，可在完整斑马鱼幼体中实现稳定、长期的脑活动监测。文中展示了通过浴式施加致惊厥药物诱导的急性惊厥记录，以及在基因修饰鱼中记录到的自发性惊厥实例。

在图1中展示了在琼脂包埋的斑马鱼幼鱼前脑中记录到的类似癫痫样放电的脑电图实例。这些样本中的高幅多峰簇状放电由浴槽施加致惊厥药物诱发：图A中为40 mM的匹鲁卡品（pilocarpine，6 dpf），图B中为1 mM的苦味毒（picrotoxin，8 dpf）。在这些记录过程中，固定并包埋于琼脂中的斑马鱼被持续监测长达90分钟。鱼类在该记录条件下可保持存活长达24小时。药物被加入灌流液中，通常在30至45分钟内扩散进入琼脂，从而诱发斑马鱼幼体前脑的电活动。该方法可使用相对少量的药物溶液（2–5 ml），因为幼鱼无需持续灌流，必要时可在静态浴槽配置中进行记录。图C显示了一只在3 dpf时的转基因斑马鱼出现的自发簇状放电；记录在斑马鱼记录液中进行。在1–2细胞期注射吗啉寡核苷酸（morpholino oligonucleotide）以敲低结节性硬化复合物（Tuberous Sclerosis Complex, tsc1a）基因的表达，该基因与一种伴有癫痫和自闭症的小儿癫痫类型相关。此外，也可从视顶盖获取细胞外记录。相关示例参见Baraban et al. (2005)9</sup...

本文介绍了一种记录幼年斑马鱼前脑细胞外场电位的简单方法。该方法可提供癫痫样活动的稳定体内读数。该技术可用于携带癫痫相关基因的转基因斑马鱼幼鱼，或通过给予致惊厥药物诱发癫痫的模型。

癫痫影响着美国近300万人以及全球多达5000万人。该疾病定义为自发性、无诱因的……

本实验的总体目标是从完整的幼年斑马鱼前脑获取细胞外场电位记录。首先将幼年斑马鱼固定在琼脂糖凝胶块中以实现 immobilization，随后在直视下将记录用微电极置入前脑。最后一步是记录前脑的电活动。最终，这些结果可用于监测完整斑马鱼幼鱼中异常的脑电图癫痫样放电活动。当我最初试图证明可以在斑马鱼幼鱼中诱发癫痫发作时，便提出了该方法的想法。斑马鱼的饲养遵循此前已描述的标准操作流程。简而言之。将成年斑马鱼放入带有隔离板的繁殖缸中进行配对。次日早晨房间灯光开启后，移除隔离板，让斑马鱼有20至60分钟不受干扰的交配时间。随后从繁殖缸中收集卵子，用移液管将其转移至含有卵水的培养皿中，并清除碎片，然后将卵子放入培养箱中。大约两天后，卵子将孵化。孵化后，用移液管去除卵壳及其它碎片，然后将幼虫放回培养箱，直至达到所需的发育时间点。准备时，使用微量移液器拉针仪将外径为1.2毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成针尖。将制好的针尖置于盛有橡皮泥垫的150毫米培养皿中保存。现在进行填充，用2摩尔的氯化钠溶液装填微电极。使用带有4毫米注射器滤膜和连接丝的1升注射器，轻敲针尖附近的液滴，直至残留气泡极少或完全消失。配制新鲜的1.2%低熔点琼脂（LMP agar）卵水溶液，并将其置于37摄氏度水浴中保持熔融状态。接下来，准备一个带有适当记录腔室的盖玻片，并将其放入冰箱中冷冻5到10分钟。本示例使用一个低剖面开放式钻石浴成像腔室，置于洁净的培养皿中，用移液管吸取一滴卵水，将一条斑马鱼幼鱼放入其中。接着，加入一滴含有麻醉剂和麻痹剂的溶液，混合后作用5到10分钟。观察斑马鱼是否失去运动。然后从冷冻机中取出盖玻片和记录室。将记录室放置在体视显微镜的载物台上。使用移液管向鱼所在的水中加入数毫升琼脂糖，并用微量移液器吸头或细钝针混合均匀。调整幼鱼位置，使其背侧朝上，暴露于琼脂糖的静止表面。待琼脂糖凝固后，用扁平刮铲将带有幼鱼的琼脂糖块转移至设置在电生理装置上的记录室中。在记录装置上，向记录室中加入 2 至 5 毫升斑马鱼记录液。如需更换药物，以每分钟约 1 毫升的速度向记录室灌注记录溶液，无需供氧。接着，将微电极插入安装在三维微操纵器上的放大器探头中。加载完成后，检查显微操作器是否具有良好的移动和调节范围。然后将微电极尖端移至显微镜视野平面，使其位于载物台上方较高位置，并使用粗调装置将其缓慢下降至斑马鱼头部上方略靠前的位置。微电极就位后，将放大器置于电流钳模式，并在视野中对电极进行调零。使用粗调装置降低电极尖端，使其刚好接触到斑马鱼前脑前方的表面。然后通过微调装置逐步推进电极尖端，直至刺穿斑马鱼的皮肤。一旦刺入皮肤，让微量移液器缓慢稳定，再将电极向前脑内推进数微米。现在使用 aScope 软件记录电活动。在电流钳模式下，以 10 千赫兹的采样率采集数据。鱼类在记录期间可保持活性长达 24 小时，可用于施加

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神经科学

斑马鱼幼虫的前脑的电生理记录

该方案描述了在成年斑马鱼中进行电生理学实验的操作步骤。该方法可用于测量神经活动。 体内.

成年斑马鱼电生理学：一种体内测量神经元胞外电活动的方法

本视频展示了通过将微吸管置于瘫痪斑马鱼幼虫的侧线神经节附近并形成松密封接来记录传入神经元电信号的方法。在此过程中，细胞外溶液可维持神经元的活性。...

在固定斑马鱼幼体中监测传入神经元的电信号

在本视频中，我们将演示如何在保留复杂神经环路的全脑标本中记录已鉴定单个神经元的电活动。我们使用转基因鱼，其中促性腺激素释放激素（GnRH）神经元通过荧光蛋白进行基因标记，以便在完整脑标本中识别这些神经元。...

在转基因鱼类完整大脑中记录特定神经元的电活动

本文描述了如何对成年斑马鱼进行固定、插管，并用于在完整动物体内开展在体电生理实验，以记录和调控神经活动。...

在完整成年斑马鱼脑中的电生理记录

本文描述了对斑马鱼胚胎和幼鱼脊髓神经元进行电生理记录的方法。该制备方法可维持神经元 原位 并且通常涉及最少的解剖操作。这些方法可用于对多种脊髓神经元进行电生理学研究，从早期幼体阶段开始即可记录其初始的电兴奋性。...

斑马鱼脊髓感觉和运动神经元电生理记录的 in situ 脊髓制备

本文介绍了一种斑马鱼癫痫模型的建立与表征方案，该模型源于对DEPDC5基因的瞬时抑制。...

癫痫斑马鱼模型中的行为与生理学分析

本文介绍了一种简化幼年斑马鱼光诱发视网膜电图（ERG）反应测量的实验方案。一种新型的圆锥形海绵尖电极有助于更简便地开展幼年斑马鱼视觉发育的视网膜电图研究，获得可靠的结果，同时降低实验成本。...

使用新型锥形海绵尖电极记录幼年斑马鱼的视网膜电图

本文介绍一种对斑马鱼胚胎大脑进行活体成像的方法，可观察至幼虫期和稚鱼期。该方法借鉴电生理学技术，属于微创操作，能够获取成熟神经元的细胞及亚细胞结构细节，并可与光遗传学及神经药理学研究相结合，用于表征脑功能及药物干预效果。...

通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼虫和幼鱼全脑组织的活体成像

本文介绍了一种实验方案 体内...

体内全脑成像斑马鱼幼鱼使用三维荧光显微镜

本文介绍了一种在成年斑马鱼前脑背侧进行双光子钙成像的实验方案。...

行为成年斑马鱼前脑活动的双光子钙成像

本文介绍了一种详细的实验方案，利用共聚焦显微镜检测表达GCaMP钙指示剂的转基因斑马鱼脑区中神经活动的方法。...

体内 共聚焦荧光成像技术用于观察部分固定幼年斑马鱼在感觉刺激下诱导的神经活动

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