利用Gal4在斑马鱼中进行基因捕获

本实验的总体目标是利用携带 GAL4 和 VP16 作为主要基因捕获报告基因的载体，通过基因断裂型转座子技术产生突变鱼。该目标首先通过将基因捕获载体与 T2 转座酶共同注射到斑马鱼胚胎中来实现。注射后的胚胎在受精后三天进行 GFP 荧光筛选，并选择约 30% 荧光最强的胚胎用于建立 F₀ 群体。

接下来，将 F₀ 代鱼与 U-A-S-M-R-F-P 测试品系杂交，以筛选基因捕获事件的种系传递。最后一步是将 F₁ 代鱼进行远交，以建立 F₂ 代，并产生胚胎用于通过反向 PCR 和 5' 末端快速扩增cDNA末端（RACE）对基因捕获事件进行分子表征。最终，大约每筛选 10 条 F₀ 代鱼中就有 1 条能够产生携带基因捕获的后代。

基因断裂型转座子被设计为在整合到蛋白质编码基因的起始位置时不会产生突变。我们的GBT载体使用G4P16作为主要的基因捕获报告基因。这一修饰提高了对低水平表达基因的检测灵敏度，并使我们能够将基因捕获突变体作为G4驱动子，用于其他转基因在特定组织中的特异性表达，而无需担心过表达带来的表型干扰。

我们认为本方法的主要瓶颈在于实现F零代鱼生殖系中足够高的基因捕获整合率。在本演示中，我们将介绍几个关键步骤：DNA制备、显微注射以及F零代筛选。GBTB1基因捕获载体使用GAL4-VP16作为主要的基因捕获报告基因。

使用两端带有最小化矮型转座子进行基因捕获整合。基因捕获事件通过受14个GAL4 UAS调控的EGFP报告基因直接检测。整个基因捕获盒两侧由直接排列的loxP位点包围。

通过表达Cree酶，可使基因捕获事件发生逆转，从而建立特定基因捕获插入位点与所观察表型之间因果关系的证据。此外，U-A-S-E-G-F-P表达盒两侧带有直接重复的FRT位点。注射flip酶的mRNA将导致U-A-S-E-G-F-P表达盒被切除，使基因捕获突变不再带有EGFP荧光标记，从而可在转基因品系中使用；这些品系在显微注射前可通过GFP荧光标记特定组织或发育事件。

准备DNA的转座子以及转座生成的mRNA。制备GBTB单基因捕获载体DNA。使用标准的小量提取试剂盒并按照制造商的说明书进行操作，在制备DNA时必须包含PB洗涤步骤。

否则，质粒提取的DNA将被RNA污染，导致转座子mRNA降解。用无RNA的水将DNA稀释至10纳克/微升。为制备T7启动子双链mRNA，首先使用XboI对pT3TS T2进行线性化处理。接着，使用M Message Machine T3体外转录试剂盒对线性化DNA进行转录，仅作一处修改。

在DNA处理步骤后加入0.5 µL的RNase抑制剂（rib lock RNase inhibitor），然后使用标准试剂盒纯化mRNA，并通过琼脂糖凝胶电泳评估体外转录mRNA的质量。将mRNA用无RNase的水稀释至40 ng/µL，并在显微注射前分装为2 µL的等分试样，于-80 °C保存。通过将8 µL稀释后的转座子DNA加入2 µL的转座子mRNA等分试样中，制备注射混合液。

使用标准的显微注射技术，将三纳升的DNA-RNA混合物注射到单细胞期斑马鱼胚胎的卵黄中，注射位置应位于卵黄与胚盘交界处。注射后，取五微升剩余的注射液在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，作为质量控制，以确认转录的mRNA未发生降解。注射后约六至八小时，剔除未受精和死亡的胚胎，并将存活胚胎以每100毫米培养皿60至80枚的密度进行分装。在受精后一天、两天和三天时，在配备荧光装置的体视显微镜或正置显微镜下观察，清除异常和死亡的胚胎。

筛选胚胎并移除任何异常的胚胎。对剩余无明显缺陷的胚胎进行筛选。对于GFP荧光，选择荧光最强的F零代胚胎，并采用本实验室标准的斑马鱼培育流程进行培养。

通常将GBT注射到具有野生型或豹纹色素模式的品系中。预计在选择培育的注射胚胎中，有20%至30%能够存活至成年。GBTB单基因捕获载体的整合可通过两种不同的机制导致EGFP表达。

第一种是真正的基因捕获事件。载体插入到一个基因中，形成由该内源基因转录本的5'端与GAL4-VP16融合的融合转录本，并翻译成包含该蛋白C末端、由插入的突变基因以及GAL4-VP16组成的融合蛋白。该融合蛋白可结合14×UAS并激活EGFP的转录。

第二种较不理想的情况是增强子捕获。位于EGFP前方的最小启动子受到整合位点附近增强子的调控，导致在没有GAL4、VP16的情况下也产生EGFP。为了区分这两类事件，构建了一条携带晶状体特异性γ-晶状体蛋白GFP标记的14 X-U-A-S-M-R-F-P转基因品系。

通过将GBT显微注射的鱼与纯合U-A-S-M-R-F-P鱼杂交，并筛选GFP与RFP的共表达来验证基因捕获事件，只有当GAL4-VP16被表达并反式激活U-A-S-M-R-F-P时，才会启动F零代鱼的筛选程序。具体操作为：将单条F零代鱼与纯合U-A-S-M-R-F-P鱼杂交。由于GBT注射鱼具有野生型或豹纹色素模式，而纯合U-A-S-M-R-F-P品系处于brass背景中，因此F零代鱼可轻易与U-A-S-M-R-F-P鱼区分，从而无需记录待筛选F零代鱼的性别，也避免了因记录或判断每条鱼性别时可能出现的错误。次日。

将黄铜制的U-A-S-M-R-F-P鱼放回鱼缸。在零日当天下午，将产下胚胎的F零代鱼移至各自的静态养殖缸中，同时收集胚胎用于筛选，并将收集的胚胎转移至新的培养皿中。在受精后一天和受精后三天对胚胎进行GFP和RFP荧光筛选。

挑出同时对 GFP 和 RFP 均呈阳性的胚胎，并根据 GFP-RFP 表达模式进行分选。如果在同一批胚胎中观察到多种表达模式，则分别培养以建立 F1 代。需要注意的是，对 GFP 阳性但对 RFP 阴性的 3D PF 胚胎不进行挑取，因为它们代表的是增强子捕获事件。

将产生G-F-P-R-F-P阳性后代的F零代鱼再次杂交，以获得第二批阳性后代。对F1代鱼进行筛选，建立F2家系，以记录基因捕获（gene trap）的表达模式，并冷冻保存胚胎批次用于基因捕获位点的分子鉴定。首先在次日将单个F1代鱼与纯合的U-A-S-M-R-F-P鱼杂交。将产生胚胎的F1代鱼移入单独的静水养殖箱中，同时收集胚胎用于受精后一天的筛选。

RFP 标记可能尚未显现，因此在受精后三天筛选 GFP 荧光，并挑出 GFP 阳性的胚胎；在受精后五天再次筛选 GFP 和 RFP 荧光，挑出双阳性胚胎。随后拍摄同时表达 GFP 和 RFP 的胚胎图像。将 20 个 G-F-P-R-F-P 阳性和 20 个 G-F-P-R-F-P 阴性胚胎分批冷冻，用于通过反向 PCR 和 5' 端快速扩增cDNA末端（5' RACE）鉴定插入突变基因。将剩余的 G-F-P-R-F-P 阳性胚胎继续培养，以在成功注射的情况下建立 F2 代。

至少80%注射了基因捕获DNA与两种转座酶mRNA混合物的胚胎会表现出一定程度的GFP荧光。GFP表达水平较低表明注射未成功，或由于RNA污染导致转座酶RNA降解。在选择荧光最强的GFP阳性胚胎建立F₀群体时，大约每筛选10条F₀鱼中就有1条能够产生基因捕获后代，基因捕获事件即从这些F₀鱼的后代中获得。

大多数除了传递单个基因捕获事件外，还带有多个不表达的转座整合。由于整个基因捕获盒被直接重复的P位点所包围，因此本图中以蓝色框表示突变基因外显子的任何基因捕获突变，均可通过表达CRE重组酶而逆转。这些图像显示了在NSF TP六基因捕获系中，神经系统内GFP与RFP的共表达；向NSF TP六胚胎注射Cree RNA后，导致G游戏副本和RFP表达的丧失。

请注意，晶状体中GFP表达未出现预期的降低。此处概述的大多数步骤同样适用于其他基因捕获筛选，以及使用TOL2和其他转座子进行的常规转基因实验。按照此处所述的基因捕获程序，每周建立20至30个F₀代杂交组合，预计每周可获得一个基因捕获事件。

然而，该操作可轻松进行放大。