从环境中采集、分离与富集天然存在的趋磁细菌

本实验的总体目标是从淡水环境中分离出趋磁细菌。首先从河流或湖泊边缘采集水体沉积物样品，以完成样品收集。第二步是利用条形磁铁从环境样品中分离出所含的趋磁细菌。

接下来，使用玻璃毛细管环道和磁铁对趋磁细菌进行富集。最后，利用光学显微镜对趋磁细菌进行表征。最终，通过透射电子显微镜观察细菌的大小和形态，以及其含磁铁矿的磁小体区域。

该方法有助于我们理解环境微生物学中的关键问题，例如磁小体在地球上的演化过程，以及趋磁细菌如何合成纳米级磁性颗粒。今天演示该实验步骤的是Zachary a Stryker。Zachary是我实验室的博士研究生。

他与我的兄弟和我在俄亥俄州立大学一起工作。在选择淡水环境以采集趋磁细菌（MTB）时，通常最好从具有松软泥质沉积层的池塘或流速缓慢的溪流开始。在本演示中，我们于俄亥俄州哥伦布市俄亥俄州立大学校园内的奥兰德唐吉河（Oland Tangy River）边缘采集了一份样本。

选择一处水深在10至100厘米之间的地点，使用一个透明带螺旋盖的容器，取最上层的沉积物并装入容器中，剩余空间用上覆水填充。将容器带回实验室后，在水中盖上盖子，随后稍微松开盖子但仍使其覆盖容器，以减少蒸发，并将容器置于黑暗环境中静置数小时至数天，使沉积物和细小颗粒充分沉降。为富集趋磁细菌（MTB）制备泳道时，首先使用金刚石笔或锉刀切除一支5.75英寸长的玻璃巴斯德移液管的顶部，保留足够空间以容纳一到两毫升的水。

接下来，使用酒精灯和燃烧器密封尖端灭菌器。准备若干根带有棉花塞的长金属针。在准备分离MTB时，将磁铁放置于塑料容器的两侧，位置大约在沉积物-水界面以上1厘米处，容器两侧的磁铁分别为南极和北极。

注意不要扰动沉淀物。等待30分钟至数小时，使细菌游向磁铁。随后，使用注射器从样品容器中靠近沉淀物与水界面处吸取液体。

将滤器连接至注射器，并将金属针头连接至滤器，确保毛细管中无气泡。用针头将过滤后的样品水加入含有无菌棉花和金属针头的高压灭菌毛细管装置中。通过推动棉花进入毛细管，使其距离密封端0.5至1厘米，从而封闭毛细管装置。

使用无菌移液管将趋磁细菌从容器中靠近磁铁南极聚集的位置取出，并将含有趋磁细菌的水样加入跑道式装置的开口端。待跑道式装置充满样品液后，将其侧向平放在水平表面上，并将条形磁铁的南极置于跑道式装置密封端附近。静置5至30分钟，使趋磁细菌穿过棉塞迁移。

使用钻石刀在棉塞附近轻轻划出一道小划痕，然后折断跑道路末端。用带细针的1毫升注射器从跑道路末端吸取富含MTB的液体。为通过光学显微镜观察MTB，将一滴富集后的样品置于盖玻片上。

将盖玻片放置在位于载玻片上的O形环上，此装置称为悬滴。O形环的直径应略小于盖玻片。

接下来，将载玻片置于光学显微镜载物台上，聚焦于液滴的一侧边缘。然后，为将趋磁细菌（MTB）吸引至液滴的一侧，将条形磁铁的南极在数分钟内靠近该侧，此时大量MTB应聚集于液滴边缘。若需通过透射电子显微镜（TEM）观察MTB，可将一块经Formvar稳定处理并碳镀覆的200目铜网放置于富集后的菌液液滴上，静置10分钟使样品沉降。

将样品在水滴中清洗30秒后，将其置于一滴2%醋酸铀酰溶液中染色30秒至5分钟，然后用滤纸彻底干燥，并在200千伏条件下使用透射电子显微镜分析样品。图中所示为从环境沉积物样品中富集得到的一株趋磁细菌的透射电子显微镜图像。细胞的螺旋形态和磁小体链结构清晰可见，同时还可见一条鞭毛。

一旦从环境中收集到趋磁细菌，若操作得当，磁分离技术大约需要三小时。在此步骤之后，可进行其他方法，如16S核糖体RNA分析，从而回答更多问题，例如新发现的趋磁细菌与其他微生物之间的系统发育关系是什么。