脑植入的微型器件及周围组织的完整的组织学特性研究
February 11th, 2013
在这里，我们提出了一个组织学方法进行拍摄，标签，光清理和完整的脑组织界面成像在啮齿类动物的脑组织周围长期植入的微型器件。对于理解各种穿透脑植入物在其周围组织的影响，结果，从包括该方法的技术是有用的。
该程序的目的是对啮齿动物脑组织中长期植入的微型装置周围的完整脑组织界面进行成像。这是通过首先利用快速细胞硅胶弹性体和两组分牙科丙烯酸覆盖开颅手术并在大脑植入装置周围形成颅骨帽来实现的。在用固定剂和死后组织处理灌注动物后，通过烧掉牙科丙烯酸并切开快速细胞，将装置的大脑植入部分与头帽分离。
接下来，取出大脑并用 viome 切片，以捕获组织切片中的植入物。最后一步是通过洗涤标记来准备用于荧光成像的组织，然后在光学透明化溶液中清除组织切片。最终，共聚焦显微镜用于显示穿透性脑植入物在亚细胞尺度上在周围组织中产生的完整生物反应。
与现有方法（如解释、设备）相比，该技术的主要优点是该技术避免破坏植入设备周围和粘附的组织，因此可以完整地检查接口组织。该方法依赖于先进的免疫组织化学和显微镜技术，并产生共聚焦显微镜数据，详细描述了脑植入装置周围的区域。这种方法可以帮助回答神经假体领域的关键问题，例如局部细胞死亡、神经胶质瘢痕形成和血管重组在多大程度上真正影响脑植入微电极装置的寿命。
尽管这种方法可以提供对大脑植入微电极阵列的慢性神经接口的见解。该方法涉及的技术也可以应用于神经科学研究的其他领域，包括植入插管或光纤在通风橱中，通过小心地去除丙烯酸颅骨帽周围的皮肤和其他组织来开始手术，同时使用镊子和小剪刀，同时戴上热不敏感手套。使用士兵熨斗在凹痕丙烯酸中产生一个窗口，并露出下面的快速密封区域。
该设备应清晰可见，并包裹在透明的快速密封中。接下来，在手术显微镜下，用一把弯曲的微型剪刀切入硅弹性体。然后用镊子和微型剪刀去除小块快速密封，直到设备进入大脑的位置。
继续沿开颅手术表面切割，以将附着在多晶硅和颅骨上的设备组件与植入大脑的组件分开。切开裸露的设备组件时要小心。避免在固定组织中推动或拖动植入物。
然后小心地去除头帽周围的骨头，然后用生的 shes。使用刮刀将装有植入装置的大脑与颅骨分离。现在将大脑放入装满 HBHS 的玻璃培养皿中。
使用脑阻滞剂和剃须刀片切开大脑，并创建一个与植入装置的角度紧密匹配的平面。之后，将两把剃须刀片按过脑组织，露出将安装在 Vibram 上的平面。接下来，在 Vibram 平台下放一些冰块。
然后在纸巾上短暂擦干纸巾表面。之后，调整样品的方向，使最宽的尺寸平行于振动音刀片的运动方向，以帮助避免刀片可能将组织撞倒，立即用强力胶将平面粘在载物台上。胶水后，将冷却的 PBS 凝固到组织周围的振动皿中。
现在，使用最大振动速率和缓慢的刀片进位速率（刀片与水平角度成 10 度角）切割 250 至 500 微米的组织切片。然后用刷子和勺子小心收集切片，并将 HBHS 储存在 4 摄氏度的 24 孔板中，同时收集切片，记录每个切片被转移到 24 孔板时的厚度和位置。一旦 Insitu 设备可见，收集约 500 微米厚的组织切片。
为了在单个组织切片中捕获装置以收集较薄的组织切片，可以仔细收集 100 微米切片以靠近装置。此时，可以使用设备内部收集厚度小于 500 微米的切片。通过在 HBHS 中洗涤切片 3 次，每次洗涤 5 分钟来开始组织处理。
然后将它们在硼氢化钠中孵育 15 分钟。使用小画笔慢慢翻转切片的每一侧，并避免接触植入的设备周围的任何区域。不锈钢或特氟龙涂层的微型勺子也可以与小画笔一起使用。
现在，在室温下用洗涤液洗涤切片 3 次，每次洗涤 5 分钟。将它们在室温下在洗涤液中封闭 2 小时，同时翻转切片。1 小时后，2 小时后，在 4 摄氏度下将切片在一抗中孵育约 48 小时。
接下来，用洗涤液进行 6 次快速洗涤，每次 3 分钟。然后在洗涤液中进行 6 次 1 小时的洗涤。之后，将它们在 4 摄氏度下在二抗中孵育约 48 小时。
同样，进行 6 次 3 分钟的快速洗涤，然后在洗涤液中洗涤 6 次，每次 1 小时。随后，去除洗涤液并加入基于甘油的 U2 水垢透明溶液。用箔纸盖住板子，并在 4 摄氏度下储存。
让厚切片在 4 摄氏度下清理大约一周或非常厚的组织切片两到三周。清除后，使用透明溶液作为封固剂，将组织切片安装在载玻片上。用透明指甲油密封所有载玻片，并使用更长的工作距离显微镜物镜将它们存放在避光 4 摄氏度的环境中。
使用激光扫描共聚焦显微镜或双光子显微镜开始成像。我们将使用 XS L SM 7 10 Carl 习 send 软件和计算机控制的 XY 平移台演示植入物周围的 3D 全景图像，以校正透明溶液的折射率。在本演示中，我们在 Leica Zen 显微镜软件中为 U2 透明化解决方案输入折射率值 1.4。
此设置会巧妙地调整 Z 步长间隔，以解决设备附近组织中的折射率不匹配。使用低激光功率、约 0.5% 至 5% 和大 Z 步长，粗略评估每个荧光通道在 zdi 维度中适当的 Z 轴窗口和数据收集设置。然后使用 Zen 全景软件将物镜设置在最终全景图的 XY 中心，并确定 x 轴和 y 轴所需的收集位置数量。
要覆盖您感兴趣的区域，请通过快速检查堆栈的第一帧和最后一帧来重新评估并完成 Z 轴集合窗口。接下来，手动设置检测器灵敏度和激光功率，使其随着深度的增加而适当增加。其目的通常是保持大致相同的图像强度，而不管组织切片的成像深度如何，并且还避免高背景噪声。
如有必要，收集每个荧光图像数据系列以避免信号重叠，按顺序运行激光线。更改软件设置以收集数据或透射率数据，并使用更长、穿透力更强的激光（例如 6 33 纳米）来捕获这些通道。然后确定适当的激光功率并检测反射率和透射率收集的灵敏度，并在植入的设备周围重复相同的收集系列。
最后，导出数据以供以后处理、定量和分析。通过载玻片的任一侧成像可以让您评估设备周围的界面，如图所示，其中沿着 MEA 硅背衬的小胶质细胞从一侧可见，而沿着电极部位的小胶质细胞和痕迹在另一侧可见。一旦可以使用 XY 平移台对封片的组织进行成像，就可以以所需的分辨率生成整个组织切片的荧光标记概览。
在这里，用钩状物 3、3、3 4 2 染色的细胞核和用 3 2 9 标记的单核细胞小胶质细胞。抗 IBA 一在不同的通道上同时成像。还收集了透射光和反射率，显示了 4 周植入物相对于钩子和 IVA one 数据的位置，所有通道的叠加，但透射率显示在此处。
可以在高放大倍率下收集植入的微器件周围形态保存的组织界面的详细检查，以分析局部组织反应，反射率和透射率允许定位设备，而荧光抗体或化学标记允许沿完整组织界面对组织成分进行详细成像。在尝试此程序时，重要的是要记住要花时间通过头帽小心地分离植入的装置，并计划此步骤需要 30 分钟以上。看完这个视频，你应该对如何收集和处理包含植入设备的脑切片有很好的了解。
您还应该能够标记和收集描述这些设备周围神经生物学的组织学数据。
概述
本文介绍了一种用于成像啮齿动物脑组织中慢性植入微装置周围完整脑组织界面的组织学方法。该技术允许在保持周围组织的情况下，检查对穿透性脑植入物的生物反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 组织学
- 显微镜学
背景
- 了解脑植入物与周围组织之间的相互作用对神经修复技术至关重要。
- 现有方法通常会破坏植入物周围的组织。
- 本研究介绍了一种能够维持组织完整性以便更好分析的技术。
- 采用了先进的免疫组织化学和显微镜技术。
研究目的
- 开发一种用于成像植入装置周围脑组织界面的方法。
- 评估组织对慢性植入物的生物反应。
- 提供有关影响脑植入装置寿命因素的见解。
使用的方法
- 用硅橡胶和牙科丙烯酸覆盖开颅术。
- 用固定剂灌流动物并在死后处理组织。
- 使用共聚焦显微镜可视化组织反应。
- 采用先进的免疫组织化学技术进行标记。
主要结果
- 该方法允许完整检查植入物周围的接口组织。
- 共聚焦显微镜揭示了亚细胞水平的详细生物反应。
- 获得了关于局部细胞死亡、胶质疤痕形成和血管重组的见解。
- 该技术可以适用于其他神经科学研究应用。
结论
- 这种组织学方法对于研究脑植入装置是有效的。
- 它保持了周围组织的完整性，从而能够进行详细分析。
- 研究结果有助于理解神经修复技术中的慢性神经接口。
常见问题
Executive Industry Relevance
Preserving the native tissue architecture around chronically implanted neural interfaces enables accurate assessment of biological responses that directly impact device longevity and functional performance. This capability supports mechanistic de-risking in neuroprosthetics development by providing subcellular resolution data on glial scarring, neuronal loss, and vascular reorganization without tissue disruption artifacts. Such insights inform early-stage target validation and predictive confidence in implant design iterations, reducing late-stage failure risk in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tissue-implant interfaces to validate hypotheses about chronic inflammatory responses and foreign body reactions.
- Operational Value: Provides reproducible histological readouts for assessing candidate biomaterials and surface modifications in rodent models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative multiplexed immunofluorescence data on microglia activation, neuronal density, and vascular markers surrounding implants.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging workflows for comparative analysis across device geometries or coating conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains spatial relationships between implant sites and tissue responses, enabling correlation of histological endpoints with functional electrophysiology outcomes.
- Operational Value: Supports longitudinal studies by allowing serial sectioning from the same implanted cohort without explant-induced variability.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into discovery biology workflows by providing intact tissue readouts that bridge in vitro biocompatibility screening and in vivo functional validation, informing go/no-go decisions prior to GLP toxicology studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of material-tissue interactions through preserved subcellular architecture for detailed morphometric analysis.
- Screening: Enables assay readiness via standardized thick-section preparation compatible with high-content immunofluorescence screening of implant candidates.
- Analytics: Delivers multiplexed quantitative readouts (e.g., IBA1+ microglia coverage, NeuN+ neuronal density, CD31+ vascular density) to compare implant conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase histological responses to preclinical continuity by preserving tissue for correlative functional assessments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable histology platform for evaluating diverse neural interfaces (MEAs, cannulas, fiber optics) across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tissue response characterization by avoiding explant-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized fixation, sectioning, clearing, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of non-viable implant designs before costly chronic studies.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of neuroprosthetic candidates based on quantitative histological risk scores.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, immunohistochemistry, and optical clearing techniques.
- Dependent on access to vibratory microtomes, confocal microscopes, and clearing solution handling infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between surgery, histology, and imaging teams for consistent tissue orientation and sectioning.
- Adaptation considerations include optimizing clearing times and antibody penetration for different tissue thicknesses and implant materials.
- Practical limitations include extended clearing durations (1-3 weeks) and potential autofluorescence from clearing solutions requiring spectral unmixing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:12
Brain Removal with In situ Devices
5:17
Tissue Processing and Clearing
7:05
Panorama Imaging of Full Tissue and Device Interface
9:26
Results: Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue
10:51
Conclusion
