Name: 生产二硫键稳定的跨膜肽复合物的结构研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: 学习利用大肠杆菌表达和镍亲和层析技术生产二硫键稳定的跨膜肽复合物，用于膜蛋白相互作用的结构生物学研究。该方法通过氧化交联和反相高效液相色谱纯化，为核磁共振分析提供高质量样品。

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本研究工作由澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC项目资助1011352号，资助M.E.C.和M.J.C.；独立研究机构基础设施支持计划[IRIISS]资助，资助WEHI）以及维多利亚州政府（VESKI创新研究员项目资助M.E.C.；维多利亚州政府运营基础设施支持资助WEHI）提供资金支持。M.E.C. 是澳大利亚研究理事会的伊丽莎白二世女王研究员。E.F.X.B. 感谢墨尔本大学诺玛·希尔达·施斯特奖学金项目的支持。

1. 克隆与载体构建
使用 HindIII 和 BamHI 限制性酶切位点，将目标序列克隆至 pMM-肽载体中（该载体可应要求提供）（见图1）。双链DNA插入片段应按以下顺序包含：HindIII 位点；一个用于 CNBr 切割的单甲硫氨酸密码子；大肠杆菌（E. coli）密码子优化的肽编码序列；终止密码子；BamHI 位点。肽序列中的其他所有甲硫氨酸均应去除，并应避免出现 asp-pro 二肽序列，因其在酸性条件下也会被切割。
应根据二硫键交联在最终复合物中的预期位置，在每条肽序列中引入一个独特的半胱氨酸残基，其余所有半胱氨酸均应突变为丝氨酸。质粒携带卡那霉素抗性盒用于筛选。
2. trpLE-肽融合蛋白的表达
<ol>
 <li>配制 M9/Kan 最小培养基并进行无菌过滤（0.1 mM CaCl2、2 mM MgSO4、3 g/L KH2PO4、7.5 g/L Na2HPO4·2H2O、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl、4 g/L 葡萄糖、50 mg/L 硫酸卡那霉素）。添加“善存全效复合维生素（Centrum Complete A to Zinc）”以提供B族维生素和微量元素：将1片药片溶于40 ml H2O中，搅拌30分钟，离心去除不溶物，对橙色上清液进行无菌过滤。将储备液避光保存于4 °C，最多可保存2周；使用时按4 ml/L加入M9培养基中。 
 注意： 如需进行同位素标记，可在M9培养基中加入15N标记的NH4Cl、13C标记的葡萄糖或其他稳定同位素标记前体。</li>
 <li>用新近转化的BL21(DE3)菌株大肠杆菌（E. coli）接种100 ml M9/Kan培养基作为起始培养物，于37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。</li>
 <li>次日早晨，检测起始培养物的OD600值，应达到2或以上。将100 ml起始培养物稀释至总体积为1 L的含Centrum补充剂的M9培养基中，分装至两个2 L带挡板的锥形瓶（每瓶500 ml），于37 °C、140 rpm振荡培养，直至OD600达到0.6。</li>
 <li>将摇床温度设为18 °C，继续振荡培养1小时，使菌液充分冷却后再进行诱导。</li>
 <li>取诱导前样品用于SDS-PAGE分析（相当于OD600 = 1时的50 μl培养液），然后加入IPTG至终浓度0.1 mM，以诱导trpLE-肽融合蛋白的表达。在IPTG诱导下，于18 °C、140 rpm继续培养过夜（16–20小时）。</li>
</ol>
3. 包涵体的制备与镍柱结合
<ol>
 <li>在最低培养基中过夜表达培养物的最终 OD600 值具有可变性，应在 2.5 至 5.0 之间。取样用于 SDS-PAGE 分析（相当于 OD600 = 1 时培养物 50 μl），并通过离心收集细胞，5,000 × g 离心 20 分钟。</li>
 <li>将 1 L 培养物的细胞沉淀重悬于 50 ml 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，20 mM β-ME，0.2 M NaCl）中。细胞悬液可冷冻保存，以备后续处理。</li>
 <li>在冰上以最大输出功率超声处理 1 分钟，随后在冰上静置 5 分钟。我们使用 Misonix Sonicator 3000（最大输出功率 600 瓦），配备 ½ 英寸高强度可更换探头。重复超声/冷却过程共三个循环。</li>
 <li>通过离心收集不溶性包涵体（IB）材料，20,000 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。在致密的包涵体沉淀顶部可能可见一层松散、较薄的浅色细胞碎片；可通过轻轻振荡加水或缓冲液将其洗去。如需提高包涵体组分的纯度，可重复步骤 3.3 和 3.4。应取沉淀和上清样品进行 SDS-PAGE 分析，以确认 trpLE-TM 融合蛋白定位于包涵体中。</li>
 <li>用变性溶液（6 M 盐酸胍，50 mM Tris-HCl pH 8.0，200 mM NaCl，1% Triton X-100，5 mM β-ME）溶解包涵体沉淀，每升培养物使用 25–50 ml。此步骤需在振荡条件下持续数小时，并间歇进行轻微超声处理。</li>
 <li>将包涵体裂解液在 20 °C 下以 75,000–100,000 × g 离心 1 小时以澄清，倾出上清液并通过 0.2 μm 滤膜过滤。</li>
 <li>将澄清后的包涵体裂解液加入 50 ml 锥形管或可严密封闭的较大容器中，与已用水洗涤并用变性溶液平衡的镍亲和树脂混合。对于表达水平与本文所示 trpLE-DAP12TM 相似的融合蛋白（图 3，第 2 泳道），每升培养物使用 3–4 ml 沉降树脂。通过在室温下轻柔混合孵育过夜，实现批量结合。</li>
</ol>
4. 柱上氧化交联
<ol>
 <li>将IB裂解液/镍树脂悬浮液加入装有带孔支撑板的空重力柱中，持续加入直至全部体积流穿。收集并保留穿流液，其中可能仍含有未结合的融合蛋白。</li>
 <li>用含5 mM β-ME的尿素溶液（8 M尿素，50 mM Tris-HCl pH 8.0，200 mM NaCl）通过重力流洗涤镍树脂，洗涤体积为5个柱床体积。</li>
 <li>用5个柱体积的尿素溶液再次洗涤镍树脂 无 β-ME</li>
 <li>用含有20 μM CuSO₄的尿素溶液洗涤镍树脂，重复三次，每次使用5倍柱体积的溶液4 以及2 mM氧化型谷胱甘肽。完成此洗涤步骤后，关闭柱出口，在室温下孵育30分钟，以促进二硫键最大程度形成。</li>
</ol>
5. 三氟乙酸洗脱与定量
注意：三氟乙酸（TFA）接触皮肤可引起严重灼伤，其蒸气具有强烈刺激性。浓TFA只能在经批准的化学通风橱中使用，并需佩戴护目镜和非乳胶手套。请检查所用所有材料的化学兼容性；聚丙烯与本方案的所有步骤均兼容。
<ol>
 <li>用10个柱体积的水冲洗氧化性尿素溶液，并通过在柱出口连接真空管线来干燥柱床。</li>
 <li>关闭柱出口，加入1.5个柱体积的纯（99-100%）三氟乙酸（TFA）。用小刮勺轻轻搅拌镍树脂，确保树脂均匀接触酸液，孵育5分钟。打开柱出口，收集酸性洗脱液；如有需要，可用注射器或压缩空气管线轻轻加压，以彻底排出所有液体。</li>
 <li>再用1.5个柱体积的纯TFA重复一次酸性洗脱步骤。此步骤应迅速操作，以避免琼脂糖珠基质完全溶解。此时可根据Beer-Lambert方程及trpLE-肽序列的理论摩尔消光系数测定蛋白得率。取TFA洗脱液样品（1:20至1:50稀释）溶于三氟乙醇（TFE）中，在280 nm处测定吸光度，以相同稀释度的TFA/TFE作为空白对照。</li>
</ol>
6. CNBr 消化
注意：氰化溴（CNBr）具有极高毒性，仅可在经批准的化学通风橱中操作。必须佩戴个人防护装备，包括护目镜、实验服和非乳胶手套。氰化溴对湿气敏感，使用前应先恢复至室温。有关氰化溴污染溶液和材料的中和与处置方法，请咨询所在机构的安全管理部门。
<ol>
 <li>在轻轻搅拌的同时，逐滴加入水，将酸性洗脱液稀释至终浓度为80%的TFA。如果形成沉淀，则回加少量纯TFA（0.5至1 ml），直至溶液澄清，然后再次用水调节至80%。取5 μl消化前样品用于SDS-PAGE分析，并立即在液氮中冷冻后冻干。</li>
 <li>加入CNBr晶体至浓度约为0.2 g/ml，操作时需在密闭的预先称重的试管中或在化学通风橱内的天平上安全称量该有毒化学品。轻轻搅拌至完全溶解。用惰性气体（氮气或氩气流）冲洗并密封反应容器，在室温下避光孵育3–4小时。</li>
 <li>取5 μl消化后样品用于SDS-PAGE分析，并立即冷冻和冻干。将消化反应液转移至截留分子量为3.5 kDa或更低的再生纤维素透析盒或透析管中（醋酸纤维素会在浓酸中溶解），具体选择依据预期肽复合物的大小而定。在化学通风橱中用4 L水透析过夜，以降低TFA浓度并分解未反应的CNBr。透析盒或透析管中应预留足够空间，以容纳透析过程中体积显著增加（可达2至3倍）。</li>
 <li>将含有悬浮沉淀的透析后反应液从透析盒或透析管中取出（大部分蛋白质在TFA浓度降低后会沉淀），并将悬浮液转移至50 ml锥形管中。冷冻并冻干以去除水分及残留的CNBr/TFA。此步骤可能需要数天时间。 
 注意：透析后的消化反应液及透析用水仍应视为有毒物质，须采取适当防护措施进行操作和处置。</li>
 <li>可对诱导前和收获阶段的培养物样品、包涵体上清液和沉淀、TFA洗脱液以及CNBr消化产物进行SDS-PAGE分析。使用Invitrogen NuPAGE LDS样品缓冲液，加热至95 °C制备样品。TFA洗脱液和消化样品应分别在还原和非还原条件下制备，以便于产物鉴定及氧化交联情况的评估。</li>
 <li>使用MES-SDS电泳缓冲液，在12% NuPAGE Bis-Tris预制丙烯酰胺凝胶上分离样品，以获得最小消化产物的最佳分辨率。</li>
</ol>
7. 二硫键交联肽复合物的反相高效液相色谱纯化
<ol>
 <li>将最多100 mg冻干的消化产物溶解于2–3 ml纯甲酸中，并上样至制备级（21.2 × 150 mm）Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT色谱柱，流动相A通常为含0.1%三氟乙酸（TFA）的10–20%乙腈或5–10%异丙醇水溶液。</li>
 <li>使用流动相B（含0.1% TFA的乙腈或异丙醇）进行洗脱，梯度至少持续5个柱体积。有关针对不同肽序列选择最佳梯度条件的建议，请参见讨论部分。</li>
 <li>从每个HPLC组分中取50–100 μl样品用于SDS-PAGE分析，并立即冷冻和冻干。HPLC溶剂的去除速度较快，通常在1–2小时内即可完全去除。</li>
 <li>将冻干的HPLC样品加入Invitrogen NuPAGE LDS上样缓冲液中，在95 °C加热处理，不添加还原剂。冷却后将每份样品均分至两个微量离心管中，向其中一份加入100 mM DTT并短暂重新加热。</li>
 <li>如上所述，使用MES-SDS电泳缓冲液，在12% NuPAGE Bis-Tris预制聚丙烯酰胺凝胶上分离还原与非还原的HPLC样品。小分子疏水性肽通常不易被考马斯亮蓝染色，且其迁移分子量可能与预期不符。然而，通过比较还原与非还原样品，有助于识别交联肽产物并评估其纯度。</li>
 <li>采用基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法分析含有目标肽的候选组分（参见讨论部分），以鉴定目标分子并确认其预期质量。</li>
 <li>合并含有纯化交联TM肽复合物的HPLC组分，冷冻并冻干，称量最终产物的干重以计算产率。含有高浓度异丙醇的组分可能无法充分冻结。若肽组分干燥后形成薄膜而非蓬松的冻干粉末，应将其完全重新溶解于少量纯六氟异丙醇（HFIP）中，再次冷冻并冻干。经HFIP处理后的产物应呈白色小圆锥状，易于倾出并称重。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

trpLE-TM 融合蛋白的表达。 根据我们的经验，trpLE-TM 融合蛋白在 37 °C 的丰富培养基中表达水平较低，而此处描述的培养条件已证明对含有一个至四个跨膜结构域（TM）的不同序列均有效，纯化后完整融合蛋白的产量范围为 50 至 150 mg/L。编码三个或四个跨膜结构域的 GPCR 片段（分别为人 CCR5 的 TM1-TM3 和 TM4-TM7）或人信号肽酶催化核心片段（四个跨膜结构域；见参考文献15）的融合蛋白属于该表达水平范围内的较低端，而与本研究所用序列密切相关的 DAP12TM 变体则代表该范围的高端（未发表数据）。每种新序列的最佳 IPTG 浓度应通过实验确定。我们的标准浓度为 0.1 mM，更高浓度（高达 1 mM）通常会导致产量显著下降，原因包括表达水平降低以及收获时培养密度下降（例如参见参考文献7中的图 1A）。
本方案的若干变体。 本文所述方案用于制备二硫键交联的跨膜肽复合物，即 DAP12TM 同源二聚体8。此外...

本方案详细介绍了一种我们开发的用于制备二硫键稳定的跨膜（TM）肽复合物的方法，以用于溶液核磁共振（NMR）的结构研究。该方法利用了ΔtrpLE1413融合表达系统所提供的高效表达能力（见下文），并可借助先进的稳定同位素标记技术，生成具有明确组成的跨膜肽复合物，以适用于现代多维NMR实验。我们已应用这些技术解析了多个NMR结构，揭示了淋巴细胞活化免疫受体如何通过其跨膜结构域之间的相互作用，由多个膜蛋白亚基组装而成的重要新信息（近期综述见1）。这些技术不仅适用于溶液NMR，还可广泛应用于其他多种膜蛋白系统以及多种下游分析方法。尽管本文所举实例利用天然半胱氨酸残基构建模拟天然二硫键连接蛋白的复合物，但该设计同样适用于构建工程化二硫键，以稳定通常由较弱的非共价相互作用（如表皮生长因子受体（EGFR）家族蛋白的同源或异源二聚体跨膜复合物2-4，或异源二聚体αβ整合素复合物5,6）维系的复合物。
诸如来源于跨膜蛋白脂质双层跨膜区域的肽序列这类极度疏水的肽序列，对于生物化学和生物物理学研究而言极具挑战性。除了难以采用标准的蛋白质和多肽化学技术进行操作外，它们通常对细胞具有较强毒性，因此很难通过重组方式表达。我们7,8及其他研究者9-11已成功利用细菌表达系统，将这类难以处理的肽序列作为框内羧基末端融合蛋白，连接至源自大肠杆菌 trp 操纵子的改良版 ΔtrpLE1413 序列上12。该序列编码的约13 kDa的trpLE多肽可在T7启动子控制下高水平表达，并完全定位于包涵体中，从而规避了与毒性或不稳定性相关的问题。通过对该序列进行改造，包括在其氨基端添加9个组氨酸标签13，以及消除trpLE序列内部的甲硫氨酸和半胱氨酸残基14，使得trpLE-肽融合蛋白可通过金属离子亲和层析进行纯化，并利用溴化氰（CNBr）消化以释放目标肽段。我们已成功利用该系统表达了十余种不同的肽序列，均为包含多达四个跨膜结构域的膜蛋白片段（7,8及未发表结果；另见讨论部分）。
本方案的关键创新在于确定了一套条件，可在简化的工作流程中高效地对无固定结构且极难溶解的 trpLE-TM 融合蛋白进行二硫键交联。此外，我们还全面优化了多肽产物的高效表达、操作和纯化等多个环节，本文提出的相关建议同样适用于非二硫键交联（单体）跨膜多肽产物的制备。

<table><tbody><tr><td>溴化氰</td><td>ALDRICH</td><td>P.No- C91492,CAS-506-68-3</td><td>&lt;strong&gt;危险物质。危险品。&lt;/strong&gt; 吸入、皮肤接触或吞咽后有极高毒性。与酸接触会释放出剧毒气体。对水生生物有极高毒性，可能对水生环境造成长期不利影响。</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P.CODE-1000984387, CAS编号 76-05-1</td><td>&lt;strong&gt;危险物质。危险品。&lt;/strong&gt; 可引起严重灼伤。吸入有害。对水生生物有害，可能对水生环境造成长期不利影响。</td></tr><tr><td>2-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P.No M7154, CAS编号 60-24-2</td><td>&lt;strong&gt;危险物质。危险品&lt;/strong&gt;。吸入、皮肤接触或吞咽后有毒。对皮肤有刺激性。对眼睛有严重损伤风险。皮肤接触可能引起致敏反应。对水生生物有极高毒性，可能对水生环境造成长期不利影响。</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>产品编号 52512, CAS编号 920-66-1</td><td>&lt;strong&gt;危险物质。危险品&lt;/strong&gt;。吸入或吞咽有害。可引起灼伤。</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Merck KGaA</td><td>K41186564</td><td>易燃液体和蒸气。可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤。</td></tr><tr><td>尿素</td><td>UNIVAR, AJAX FINECHEM</td><td>产品编号 817, CAS编号 57-13-6</td><td>加热时分解为二氧化碳和氨；燃烧时释放少量氮氧化物。可引起皮肤和眼睛发红及刺激。</td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>Amresco</td><td>P.No-M110, CAS编号: 50-01-1</td><td>吞咽有害，可引起严重眼睛刺激，可引起皮肤刺激，急性经口毒性，皮肤刺激物，眼睛刺激物。</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>SIGMA</td><td>产品编号- T8532 CAS编号: 9002-93-1</td><td>TRITON X-100 是一种非离子型去污剂，活性成分为100%，常用于生化应用中溶解蛋白质。TRITON X-100 无抗菌特性，被认为是一种相对温和的非变性去污剂。</td></tr><tr><td>His-Select 镍亲和凝胶</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>目录编号- P6611</td><td>His-Select 镍亲和凝胶是一种固定化金属离子亲和层析（IMAC）产品。该凝胶为负载镍离子的珠状琼脂糖，具有专有的四齿配体结构，专为特异性结合含组氨酸的蛋白质而设计。</td></tr><tr><td>(-)氧化型谷胱甘肽</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>目录编号 150568</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misonix S-3000 超声破碎仪</td><td>QSONICA</td><td>S-3000（已停产）</td><td>最大输出功率600瓦。1/2英寸可更换探头尖端，适配1/2英寸高强度、高通量探头以及多种高强度、低通量探头。该公司目前可提供的最接近型号为Q500和Q700。</td></tr><tr><td>反相高效液相色谱（RP-HPLC）：BioLogic DuoFlow 色谱系统，软件版本 5.3</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>目录编号 760-0047，配置编号：AU500571，序列号：484BR3705</td><td>肽段在高水相流动相中结合到反相高效液相色谱柱上，并通过高有机相流动相从反相色谱柱中洗脱。在反相高效液相色谱中，肽段根据其疏水性进行分离。可通过运行有机溶剂的线性梯度实现肽段分离。</td></tr><tr><td>Prep HT C3 ZORBAX 300SB-分析型高效液相色谱柱，21.2 × 150 mm，5 &amp;mu;m 粒径</td><td>Agilent</td><td>产品编号：895150-909</td><td>反相高效液相色谱柱</td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris 凝胶</td><td>Life Technologies</td><td>NP0341BOX</td><td>用于蛋白质电泳的预制凝胶</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer G2 透析夹，3.5K 截留分子量</td><td>Thermo Scientific</td><td>产品编号：87724</td><td>样品透析</td></tr></tbody></table>

用于结构研究的二硫键稳定跨膜肽复合物的制备

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

膜蛋白中嵌入脂质的α-螺旋结构域之间的物理相互作用，在膜蛋白复合物的折叠与组装以及跨膜（TM）信号转导、细胞表面蛋白水平调控等动态过程中发挥着关键作用。要理解驱动特定序列发生关联的结构特征，需要对跨膜肽复合物进行复杂的生物物理与生化分析。然而，跨膜结构域极强的疏水性使其难以通过标准的多肽化学技术进行操作，制备适合研究的材料往往极具挑战性。确定多肽能够形成稳定的螺旋构象并自发形成复合物的条件，进一步增加了研究难度。本文介绍一种利用在E. coli中表达的材料制备同源或异源二聚体跨膜肽复合物的方法，从而能够以相对低廉的成本引入稳定同位素标记用于核磁共振（NMR）研究，或引入非天然氨基酸以满足其他应用需求。本方法的关键创新在于，跨膜复合物以共价结合（二硫键交联）的形式进行表达与纯化，当将其重建至去垢剂、脂质或其他模拟膜环境的材料中时，可形成稳定、化学计量明确且均一的结构。我们还提供了经过精心优化的表达与纯化操作流程，这些流程无论用于制备单一跨膜结构域还是交联复合物均同样适用，并为将这些方法拓展至新的跨膜序列提供了实用建议。

trpLE 融合蛋白的表达水平存在差异，且在很大程度上依赖于所连接肽段的氨基酸序列。图3展示了来自一例培养物的诱导前（泳道1）和收获时间点（泳道2）样品的SDS-PAGE分析结果，该培养物每升培养液使用4 ml镍柱树脂可获得约120 mg纯度高且完整的trpLE-DAP12TM融合蛋白。所有trpLE-DAP12TM融合蛋白均存在于包涵体沉淀中（泳道4），而不存在于上清液中（泳道3）。
约70%的镍纯化trpLE-DAP12TM融合蛋白通过二硫键交联形成二聚体（图3，第5和第6泳道：TFA洗脱液的非还原与还原样品）。这是trpLE-DAP12TM融合蛋白的典型结果，但交联效率会因设计的半胱氨酸位置不同而有所变化。DAP12TM肽段产物在总的CNBr消化样品中不易识别（第7和第8泳道），但通过比较还原性消化样品中完整融合蛋白与trpLE片段的条带（第8泳道），表明融合蛋白的消化程度约为60%。
图4展示了使用制备级C3柱（总...

跨膜蛋白结构域之间相互作用的生物物理与生化研究面临诸多技术挑战，首要挑战即获得合适的实验材料。本文介绍了一种用于制备和纯化二硫键稳定的跨膜肽复合物的实验方案，该复合物适用于溶液核磁共振（NMR）及其他分析技术的结构研究。

膜蛋白中嵌入脂质的α-螺旋结构域之间的物理相互作用，在膜蛋白的折叠与组装过程中起着关键作用。

本方案可制备共价稳定的跨膜肽复合物，用于结构研究，旨在阐明膜蛋白如何通过其嵌入脂质的结构域相互作用。首先，在大肠杆菌（e coli）中表达含有目标跨膜序列的组氨酸标签融合蛋白。然后，使用镍亲和层析柱，结合胍和去污剂，从包涵体组分中提取该蛋白。浓缩组蛋白标签融合蛋白，并通过在含有氧化剂的溶液中洗涤层析柱，将其二硫键交联为对称形式。接着，用三氟乙酸洗脱交联的融合蛋白，并用氰基溴处理以释放融合伴侣，然后通过反相高效液相色谱法从消化混合物中分离出交联的肽段产物。最终，通过SDS-PAGE和质谱分析验证产物的身份与纯度。该技术的主要优势在于能够生成纯净的社会计量复合物，用于溶液或固态核磁共振等技术的结构研究。即使已知两个跨膜结构域会发生相互作用，在实验条件下多肽的溶解性与复合物的形成往往难以兼顾。从一个结构明确且共价稳定的复合物开始，可显著拓宽可用于高质量数据采集的实验条件范围。通常，初次接触该方法的研究人员会难以处理这些极度疏水的蛋白质片段。本方案及随附文稿中提供的建议旨在为预测与纯化过程中一些最常见的难题提供简单可行的解决方案。取一升表达三肽融合蛋白的细菌培养物，重悬于 50 毫升裂解缓冲液中。然后以最大输出功率进行三次超声处理，每次一分钟，并在冰上冷却五分钟。通过在 20,000 G 离心 15 分钟收集不溶性包涵体材料，倾去上清液并保留。如果需要提高包涵体组分的纯度，可重复超声和离心步骤。保留沉淀和上清液样品，用于 SDS-PAGE 分析，以确认三联实验。TM 融合蛋白定位于包涵体，现用每升培养物 25 至 50 毫升的胍溶液溶解包涵体沉淀。在室温下轻轻处理混合物数小时，期间偶尔进行超声处理。接下来，在75,000至100,000 ×g条件下离心一小时，以澄清包涵体裂解液。在室温下，将上清液通过0.2微米滤膜过滤至50毫升锥形管中。将澄清后的包涵体裂解液与已平衡至豚鼠溶液中的镍亲和树脂混合，进行批次结合。在室温下轻轻混合悬浮液过夜。将包含体裂解物与镍树脂悬浮液加入装有孔状床支撑的空重力流柱中，直至全部体积流过。收集并保留流出液，其中可能仍含有未结合的融合蛋白。然后通过重力作用洗涤镍树脂。用五倍柱体积的含有5毫摩尔β-巯基乙醇的尿素溶液过柱。第三次洗涤时，使用不含β-巯基乙醇的尿素溶液进行第二次洗涤。使用添加了硫酸铜和氧化型谷胱甘肽的尿素溶液。然后关闭柱出口，在室温下孵育30分钟，以促进二硫键最大程度形成。用10倍柱体积的水洗去氧化性尿素溶液。然后连接真空装置以干燥柱床，并关闭柱子出口。现在在化学安全通风橱中，加入1.5倍柱体积的纯三氟乙酸（TFA），用小刮勺搅拌镍树脂，确保树脂均匀接触酸液，孵育5分钟。如有需要，可轻轻施加压缩空气压力，推动液体完全流出，收集酸性洗脱液。用另外1.5个柱体积的纯三氟乙酸重复酸稀释步骤。为测定蛋白质得率，将三氟乙酸洗脱液用三氟乙醇稀释，并在280纳米处测定其相对于三氟乙酸-三氟乙醇（A-T-F-A-T-E）的吸光度。在轻柔搅拌的同时，逐滴加入水，将酸性洗脱液稀释至终浓度为80%的三氟乙酸。如果出现沉淀，加入少量三氟乙酸（TFA）直至溶液澄清。然后用水重新调节至80%。保留5微升预消化样品用于SDS-PAGE分析，并立即在液氮中冷冻。接下来，按每毫升样品约 0.2 克的量称取氰化溴晶体。注意安全操作，避免接触有毒化学品。在通风橱中将氰化溴加入样品，并轻轻混匀，直至完全溶解。现在用惰性气体密封反应容器并冲洗，随后在避光条件下于室温孵育三至四小时。保留五微升消化后样品用于SDS-PAGE分析，立即在液氮中冷冻，并与消化前样品一同进行冻干。然后将消化反应液转移至再生纤维素透析盒中，以便显著增加体积。将样品在化学通风橱中对四升水透析过夜。次日早晨，从透析盒中取出含有悬浮蛋白质沉淀的透析后反应液，并将该悬浮液转移至50毫升锥形管中。随后将样品冷冻并冻干数天，以去除水分及残留的氰化物、溴化物和三氟乙酸。将最多100毫克冻干后的消化产物溶解于3毫升纯甲酸中，搅拌至溶液完全澄清。使用5毫升进样环，在溶剂A的流动条件下，将样品上样至制备级Zoax SB 300 C3色谱柱。随后，在至少五个柱体积范围内，采用溶剂B进行梯度洗脱，分离消化产物。通过SDS-PAGE和MALDI-TOF质谱分析HPLC各馏分，以鉴定目标组分并确认其预期分子量，随后进行冻干处理。含有交联肽产物的HPLC组分。如果产物干燥后形成薄膜而非粉末，可将其重新溶解于少量液氮冷冻的HFIP中，然后进行冻干。再次获得的产物将呈蓬松的白色锥形物，易于倾出并称重。一段DNA序列，编码免疫受体跨膜信号分子的跨膜区和Flag标签区域。DAP12 使用 HindIII 和 BamHI 限制性酶切位点克隆至 PMM 肽载体中。所获得的细菌表达载体可表达一种带有组氨酸标签的三肽融合蛋白，该蛋白具有独特的内部甲硫氨酸和半胱氨酸残基，可用于氰化溴切割以及氧化交联。三肽融合蛋白的表达水平因所连接肽段的氨基酸序列不同而有所差异。该制备过程从一升培养物和四毫升镍柱介质中获得了约120毫克纯度较高的完整融合蛋白。细胞裂解后，融合蛋白主要存在于包涵体沉淀中。约70%的经镍柱纯化的三肽DAP12跨膜融合蛋白通过二硫键交联形成DME形式。尽管在总氰基溴消化样品中难以直接识别 DAP 12 TM 肽产物，但通过比较还原消化样品中完整融合片段与三联片段条带，表明在此典型的消化产物分离中，融合蛋白的消化程度约为 60%。在制备规模的反相高效液相色谱 C3 柱上，结合的产物在溶剂 B 的两阶段梯度中被洗脱。二硫键交联的肽段产物可在非还原和还原条件下的 SDS-PAGE 分析中，从主要 HPLC 组分中被识别。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析证实，第四峰中的去封闭肽（deme peptide）主要产物分子量为 6729.2 道尔顿。请注意，使用溴化氰、有机溶剂和浓酸具有极高的危险性。在进行这些操作时应穿戴适当的防护装备，且溴化氰绝不可在经批准的化学安全通风橱外操作。该技术已为三种不同的跨膜肽复合物溶液核磁共振结构研究提供了关键材料，揭示了多亚基免疫受体如何通过淋巴细胞膜内的蛋白质相互作用进行组装。我们认为，该技术的应用对于其他膜蛋白系统也将具有同等重要的价值。

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Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

生产二硫键稳定的跨膜肽复合物的结构研究

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高通量定量表达筛选与纯化技术应用于在大肠杆菌（E. coli）中表达的重组二硫键富集型毒液蛋白

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多聚体-PAGE：一种用于捕获和解析生物样品中蛋白质复合物的方法

我们介绍一种利用光诱导的硫醇-烯/硫醇-炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽的实验方案。...

通过光诱导硫醇-烯/炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽

本文介绍了一种利用二溴马来酰亚胺对Qβ病毒样颗粒（VLP）上的二硫键进行荧光功能化的实验方法。我们描述了Qβ的表达与纯化过程、二溴马来酰亚胺功能化分子的合成，以及二溴马来酰亚胺与Qβ之间的偶联反应。所得到的黄色荧光偶联颗粒可作为细胞内的荧光探针使用。...

利用二溴马来酰亚胺-二硫键化学法制备偶联诱导荧光的聚乙二醇化病毒样颗粒

一种1,2-二硫杂环戊烷修饰肽的合成方案及其自组装形成的超分子结构的表征。...

1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与表征

富含半胱氨酸的多肽根据其二硫键连接方式折叠成不同的三维结构。当缓冲氧化无法产生所需的二硫键连接时，需要对单个二硫键异构体进行定向合成。本实验方案涉及含三个二硫键的多肽的选择性合成，并利用核磁共振（NMR）和串联质谱（MS/MS）对其进行结构分析。...

μ-芋螺毒素PIIIA异构体的合成及不同二硫键连接方式的结构测定

二硫键长期以来已知可稳定许多蛋白质的结构。分析由这些二硫键稳定的多聚体复合物的一种简单方法是通过非还原性SDS-PAGE分析。本文以人骨成骨肉瘤细胞系U-2...

结合非还原性SDS-PAGE分析与化学交联技术检测培养哺乳动物细胞中由二硫键稳定的多聚复合物

学习利用大肠杆菌表达和镍亲和层析技术生产二硫键稳定的跨膜肽复合物，用于膜蛋白相互作用的结构生物学研究。该方法通过氧化交联和反相高效液相色谱纯化，为核磁共振分析提供高质量样品。

用于结构研究的二硫键稳定跨膜肽复合物的制备

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