生产二硫键稳定的跨膜肽复合物的结构研究

该方案产生共价稳定的跨膜肽复合物，用于结构研究，旨在了解膜蛋白如何通过其脂质包埋结构域相互相互作用。首先，在大肠杆菌中表达包含目标跨膜序列的 hist 标记融合蛋白。然后使用镍亲和基质，使用 guine 和去污剂从包涵体组分中提取蛋白质。

通过在含有氧化剂的溶液中洗涤色谱柱，浓缩 hist 标记的融合蛋白和二硫化物，将其交联成直径形式。接下来，在 Tri Fluor 乙酸中洗脱交联融合蛋白，并用溴化氰处理以释放融合伴侣，继续通过反相 HPLC 从消化混合物中分离交联肽产物。最终，通过 SDS 页面和质谱分析验证产品的特性和纯度。

这种技术的主要优点是，使用溶液或固态 NMR 等技术产生纯社会测量复合物用于结构研究。即使已知两个跨膜结构域相互作用，在实验条件下，肽的溶解度和复合物的形成也经常不一致。从定义明确的共价稳定复合物开始，可以显著拓宽可以测试高质量数据收集的实验条件范围。

通常，刚接触这种方法的人会努力处理这些极度疏水的蛋白质片段。该方案和随附手稿中提供的建议旨在为预测和纯化过程中的一些最常见挑战提供一些简单的解决方案。上颚，表达牛肚肽融合的 1 升细菌培养物，并重悬于 50 毫升裂解缓冲液中。

然后以最大输出量进行 3 个超声处理循环，持续 1 分钟，并在冰上冷却 5 分钟。以 20， 000 G 离心 15 分钟，倾析不溶性包合体材料，并放置上清液。如果需要提高 IB 组分的纯度，可以重复超声处理和离心步骤。

保留沉淀和上清液材料的样品用于 SDS 页面分析以确认行程。TM 融合定位到包涵体现在使用每升培养物 25 至 50 毫升将包涵体沉淀溶解在坚合溶液中。加工混合物在室温下轻轻混合数小时，偶尔晒太阳。

接下来，以 75， 000 至 100， 000 倍 G 离心 1 小时，以清除包涵体裂解物。在室温下，在 50 ml 锥形管中通过 0.2 微米膜过滤上苏子。将澄清的包涵体裂解物与已平衡为坚溶液的镍亲和树脂混合，以批量结合。

在室温下轻轻混合悬浮液过夜。将包涵体裂解物镍树脂悬浮液加载到具有多孔床支撑的空重力流柱中，直到整个体积流过。收集并搁置可能仍含有未结合融合蛋白的流过。

然后用重力清洗镍树脂。用含有 5 毫摩尔束巯基乙醇的 5 床体积的尿素溶液进行流动。对于第三次洗涤，在没有离子束巯基乙醇的情况下进行第二次洗涤。

使用补充有硫酸铜和氧化谷胱甘肽的尿素溶液。然后关闭色谱柱出口，在室温下孵育 30 分钟，以最大限度地形成二硫键。用 10 床体积的水洗去氧化性尿素溶液。

然后应用真空管线干燥柱床并关闭色谱柱出口。现在在化学安全罩中，加入 1.5 床体积的纯 TFA，用小刮刀搅拌镍树脂，以确保均匀暴露在酸中，然后孵育 5 分钟。收集酸洗脱液，必要时用压缩空气管轻轻加压，以推出所有液体。

用另外 1.5 床体积的纯 TFA 重复酸稀释步骤为了测量蛋白质产量，在三氟乙醇中稀释 TFA EIT，并测量 280 纳米处对 A-T-F-A-T-E 的吸光度。逐滴将酸 elu 稀释至 80% 最终 TFA 浓度。轻轻混合时加入水。

如果沉淀形式，请重新加入少量 TFA，直到溶液澄清。然后用水重新调整至 80%。保留 5 μL 预酶解样品用于 SDS 页面分析，并立即在液氮中冷冻。

接下来，称量溴化氰晶体，使每毫升样品约为 0.2 克。注意安全地称量有毒化学品。将溴化氰添加到安全罩中的样品中，轻轻混合直至完全溶解。

现在，在惰性气体密封中冲洗反应容器，并在室温下避光孵育 3 至 4 小时。保留 5 μL 后消化样品用于 SDS 页面分析，立即将其冷冻在液氮中，并将其与预消化样品一起冻干。然后将消化反应转移到再生纤维素透析盒中，从而显著增加体积。

化学蛇蝎罩中用 4 升水对样品进行过夜透析。第二天早上，从透析盒中取出含悬浮蛋白沉淀的透析反应溶液，并将悬浮液转移到 50 mL 锥形管中。然后将样品冷冻并冻干数天以去除水分和任何痕量的氰、溴化物和 TFA，将多达 100 毫克的冻干消化产物溶解到 3 毫升的纯甲酸混合物中，直到溶液完全澄清。

使用 5 mL 样品定量环，将样品加载到溶剂 A 流中的制备级 zoax SB 300 C3 色谱柱上。然后在溶剂 B 的梯度中洗脱酶解产物，体积至少为 5 倍。通过 SDS 页面和 MALDI TOF 质谱分析HPLC馏分，以鉴定感兴趣的物种并确认其预期的质量冻干。

含有交联肽产物的 HPLC 馏分。如果产品干燥成薄膜而不是粉末，则可以将其重新溶解在冷冻在液体中的少量 HFIP 中并冻干。同样，结果将是一个蓬松的白色圆锥体，很容易倾斜并称重编码免疫受体跨膜信号分子的跨膜和标记区域的 A DNA 序列。

使用 Hindi 3 和 BAM H 1 限制性位点将 DAP 12 克隆到 PMM 肽载体中。所得细菌表达构建体产生具有独特内部蛋氨酸和胱氨酸残基的 His 标记的旅行融合蛋白，用于溴化氰切割和氧化交联。牛肚融合的表达水平取决于附着肽的氨基酸序列。

该制剂从 1 升培养物和 4 mL 镍基质中产生了大约 120 毫克的纯完整融合蛋白。细胞裂解后，融合蛋白定位于包涵体沉淀。大约 70% 的镍纯化牛肚 DAP 12 TM 熔融物与 DME 形式发生二硫键交联。

尽管 DAP 12 TM 肽产物在 CYANOGEN 溴化物总消化物样品中不易鉴定，但对还原消化物样品中完整融合条带和脱离片段条带的比较表明，在这种典型的消化产物分离中，融合物的消化完成度约为 60%。在使用反相 HPLC 的制备级 C3 色谱柱上，溶剂 B 的两级梯度中提到了结合产物，在非还原和还原条件下，主要 HPLC 馏分的 SDS 页面分析中可识别 diss 硫化物交联肽产物。Maldi tof 质谱分析证实了峰 4 中 deme 肽与 6729.2 道尔顿的主要产物的同一性。

不要忘记，使用溴化氰有机溶剂和浓酸可能非常危险。执行这些程序时应佩戴适当的防护装备，切勿在经批准的化学安全罩外处理溴化氰。该技术为跨膜肽复合物的三种不同溶液 n mr 结构提供了关键研究材料，展示了多亚基免疫受体如何通过淋巴细胞膜内的蛋白质相互作用组装。

我们相信该技术的应用将证明对其他膜蛋白系统同样有价值。