用于结构研究的二硫键稳定跨膜肽复合物的制备

本方案可制备共价稳定的跨膜肽复合物，用于结构研究，旨在阐明膜蛋白如何通过其嵌入脂质的结构域相互作用。首先，在大肠杆菌（e coli）中表达含有目标跨膜序列的组氨酸标签融合蛋白。然后，使用镍亲和层析柱，结合胍和去污剂，从包涵体组分中提取该蛋白。

浓缩组蛋白标签融合蛋白，并通过在含有氧化剂的溶液中洗涤层析柱，将其二硫键交联为对称形式。接着，用三氟乙酸洗脱交联的融合蛋白，并用氰基溴处理以释放融合伴侣，然后通过反相高效液相色谱法从消化混合物中分离出交联的肽段产物。最终，通过SDS-PAGE和质谱分析验证产物的身份与纯度。

该技术的主要优势在于能够生成纯净的社会计量复合物，用于溶液或固态核磁共振等技术的结构研究。即使已知两个跨膜结构域会发生相互作用，在实验条件下多肽的溶解性与复合物的形成往往难以兼顾。从一个结构明确且共价稳定的复合物开始，可显著拓宽可用于高质量数据采集的实验条件范围。

通常，初次接触该方法的研究人员会难以处理这些极度疏水的蛋白质片段。本方案及随附文稿中提供的建议旨在为预测与纯化过程中一些最常见的难题提供简单可行的解决方案。取一升表达三肽融合蛋白的细菌培养物，重悬于 50 毫升裂解缓冲液中。

然后以最大输出功率进行三次超声处理，每次一分钟，并在冰上冷却五分钟。通过在 20,000 G 离心 15 分钟收集不溶性包涵体材料，倾去上清液并保留。如果需要提高包涵体组分的纯度，可重复超声和离心步骤。

保留沉淀和上清液样品，用于 SDS-PAGE 分析，以确认三联实验。TM 融合蛋白定位于包涵体，现用每升培养物 25 至 50 毫升的胍溶液溶解包涵体沉淀。在室温下轻轻处理混合物数小时，期间偶尔进行超声处理。

接下来，在75,000至100,000 ×g条件下离心一小时，以澄清包涵体裂解液。在室温下，将上清液通过0.2微米滤膜过滤至50毫升锥形管中。将澄清后的包涵体裂解液与已平衡至豚鼠溶液中的镍亲和树脂混合，进行批次结合。

在室温下轻轻混合悬浮液过夜。将包含体裂解物与镍树脂悬浮液加入装有孔状床支撑的空重力流柱中，直至全部体积流过。收集并保留流出液，其中可能仍含有未结合的融合蛋白。

然后通过重力作用洗涤镍树脂。用五倍柱体积的含有5毫摩尔β-巯基乙醇的尿素溶液过柱。第三次洗涤时，使用不含β-巯基乙醇的尿素溶液进行第二次洗涤。

使用添加了硫酸铜和氧化型谷胱甘肽的尿素溶液。然后关闭柱出口，在室温下孵育30分钟，以促进二硫键最大程度形成。用10倍柱体积的水洗去氧化性尿素溶液。

然后连接真空装置以干燥柱床，并关闭柱子出口。现在在化学安全通风橱中，加入1.5倍柱体积的纯三氟乙酸（TFA），用小刮勺搅拌镍树脂，确保树脂均匀接触酸液，孵育5分钟。如有需要，可轻轻施加压缩空气压力，推动液体完全流出，收集酸性洗脱液。

用另外1.5个柱体积的纯三氟乙酸重复酸稀释步骤。为测定蛋白质得率，将三氟乙酸洗脱液用三氟乙醇稀释，并在280纳米处测定其相对于三氟乙酸-三氟乙醇（A-T-F-A-T-E）的吸光度。在轻柔搅拌的同时，逐滴加入水，将酸性洗脱液稀释至终浓度为80%的三氟乙酸。

如果出现沉淀，加入少量三氟乙酸（TFA）直至溶液澄清。然后用水重新调节至80%。保留5微升预消化样品用于SDS-PAGE分析，并立即在液氮中冷冻。

接下来，按每毫升样品约 0.2 克的量称取氰化溴晶体。注意安全操作，避免接触有毒化学品。在通风橱中将氰化溴加入样品，并轻轻混匀，直至完全溶解。

现在用惰性气体密封反应容器并冲洗，随后在避光条件下于室温孵育三至四小时。保留五微升消化后样品用于SDS-PAGE分析，立即在液氮中冷冻，并与消化前样品一同进行冻干。然后将消化反应液转移至再生纤维素透析盒中，以便显著增加体积。

将样品在化学通风橱中对四升水透析过夜。次日早晨，从透析盒中取出含有悬浮蛋白质沉淀的透析后反应液，并将该悬浮液转移至50毫升锥形管中。随后将样品冷冻并冻干数天，以去除水分及残留的氰化物、溴化物和三氟乙酸。将最多100毫克冻干后的消化产物溶解于3毫升纯甲酸中，搅拌至溶液完全澄清。

使用5毫升进样环，在溶剂A的流动条件下，将样品上样至制备级Zoax SB 300 C3色谱柱。随后，在至少五个柱体积范围内，采用溶剂B进行梯度洗脱，分离消化产物。通过SDS-PAGE和MALDI-TOF质谱分析HPLC各馏分，以鉴定目标组分并确认其预期分子量，随后进行冻干处理。

含有交联肽产物的HPLC组分。如果产物干燥后形成薄膜而非粉末，可将其重新溶解于少量液氮冷冻的HFIP中，然后进行冻干。再次获得的产物将呈蓬松的白色锥形物，易于倾出并称重。一段DNA序列，编码免疫受体跨膜信号分子的跨膜区和Flag标签区域。

DAP12 使用 HindIII 和 BamHI 限制性酶切位点克隆至 PMM 肽载体中。所获得的细菌表达载体可表达一种带有组氨酸标签的三肽融合蛋白，该蛋白具有独特的内部甲硫氨酸和半胱氨酸残基，可用于氰化溴切割以及氧化交联。三肽融合蛋白的表达水平因所连接肽段的氨基酸序列不同而有所差异。

该制备过程从一升培养物和四毫升镍柱介质中获得了约120毫克纯度较高的完整融合蛋白。细胞裂解后，融合蛋白主要存在于包涵体沉淀中。约70%的经镍柱纯化的三肽DAP12跨膜融合蛋白通过二硫键交联形成DME形式。

尽管在总氰基溴消化样品中难以直接识别 DAP 12 TM 肽产物，但通过比较还原消化样品中完整融合片段与三联片段条带，表明在此典型的消化产物分离中，融合蛋白的消化程度约为 60%。在制备规模的反相高效液相色谱 C3 柱上，结合的产物在溶剂 B 的两阶段梯度中被洗脱。二硫键交联的肽段产物可在非还原和还原条件下的 SDS-PAGE 分析中，从主要 HPLC 组分中被识别。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析证实，第四峰中的去封闭肽（deme peptide）主要产物分子量为 6729.2 道尔顿。

请注意，使用溴化氰、有机溶剂和浓酸具有极高的危险性。在进行这些操作时应穿戴适当的防护装备，且溴化氰绝不可在经批准的化学安全通风橱外操作。该技术已为三种不同的跨膜肽复合物溶液核磁共振结构研究提供了关键材料，揭示了多亚基免疫受体如何通过淋巴细胞膜内的蛋白质相互作用进行组装。

我们认为，该技术的应用对于其他膜蛋白系统也将具有同等重要的价值。