Name: 在小鼠的心房和心室肌细胞的分离及钾离子通道的录音 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 学习从小鼠分离心房和心室心肌细胞并进行全细胞膜片钳记录的方法。该方案利用胶原酶灌注和机械解离技术获取活细胞，用于研究钾离子通道功能及心律失常机制。

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本工作由德国研究基金会（DFG）、弗里茨·蒂森基金会和夏里特/马普学会资助。

1. 动物麻醉与器官采集
<ol>
 <li>通过腹腔内（i.p.）注射 Ketamine（200 mg/kg 体重）和 Xylazine（20 mg/kg 体重）使小鼠麻醉。</li>
 <li>为防止血液凝固和血栓形成，进行腹腔内注射 250 IU 肝素（Heparin）以实现抗凝。</li>
 <li>等待小鼠进入深度麻醉状态，该状态以无反射为特征。可通过轻触角膜检测角膜反射，或通过夹尾检测逃避反射，以确认无反射状态。</li>
 <li>将小鼠转移至手术台，并以仰卧位固定。</li>
 <li>在剑突下方切开皮肤和腹壁，行双侧开胸术（clamshell thoracotomy）：沿肋弓向两侧延伸切口，随后在腋中线处剪断肋骨，将胸廓向上翻转。</li>
 <li>打开心包，定位大血管。轻压心脏尾侧以更清晰地暴露主动脉。使用镊子夹住主动脉。</li>
 <li>将心脏置于剪刀的凹槽内，一次性切断所有连接血管。注意保留足够长度的升主动脉，以便进行 Langendorff 插管。</li>
 <li>立即将离体心脏转移至盛有冰浴且预先充氧的溶液 1 的培养皿中（溶液配方见 表 1）。</li>
</ol>
2. 心脏准备与朗格多夫灌流
<ol>
 <li>用1.8F钢制插管插入股动脉，注意避免空气栓塞。</li>
 <li>用外科缝线将主动脉固定在插管上，并用1 ml溶液1冲洗冠状动脉。</li>
 <li>将插管连接至Langendorff装置。</li>
 <li>确保从开胸至完成Langendorff插管的时间不超过120秒，以避免心肌发生长时间的缺血/再灌注损伤。</li>
 <li>以4 ml/min流速用10 ml无Ca2+的溶液2灌注心脏。</li>
 <li>以4 ml/min流速用胶原酶溶液3灌注心脏8分钟。</li>
</ol>
3. 心脏心腔的显微外科分离
<ol>
 <li>将心脏转移至含有低 Ca2+ 溶液 4 的预热 100-mm 培养皿中。</li>
 <li>用剪刀小心去除主动脉及其他非心脏组织，并弃去。</li>
 <li>分离心房与心室，分别对每个心腔进行后续操作。保持细胞浸没在溶液 4 中。使用小体积溶液（少于 5 ml）。</li>
</ol>
4. 心肌细胞的进一步解离
<ol>
 <li>心房心肌细胞：
 <ol>
 <li>将心房组织转移至单独的预热100 mm培养皿中，用精细镊子轻轻撕扯以分离组织，从而获得单个心房心肌细胞。确保组织几乎完全解离。</li>
 <li>使用带有经火焰抛光并扩大的塑料吸头的1 ml移液器，将细胞悬浮于1 ml溶液5中，孵育5分钟。</li>
 <li>使用细胞滤网（200 μm孔径）去除细胞碎片，分离细胞。</li>
 <li>向细胞悬液中加入5 ml溶液5，室温下以16 × g离心2分钟。</li>
 <li>以下步骤在细胞培养罩内操作。弃去上清液，将沉淀重悬于5 ml溶液6中。</li>
 <li>在15 ml离心管中静置沉降10分钟后，室温下以16 × g离心1分钟。弃去上清液。根据细胞数量，将细胞重悬于1–5 ml溶液6中。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>心室心肌细胞：
 <ol>
 <li>在5 ml溶液4中，用精细镊子解剖感兴趣的左心室区域。</li>
 <li>通过轻柔吹打使细胞悬浮，直至大部分细胞分离。将过滤后（200 μm孔径）的细胞悬液转移至50 ml离心管中，并加至25 ml体积。</li>
 <li>室温下以16 × g离心2分钟。</li>
 <li>以下步骤在细胞培养罩内操作。弃去上清液，将沉淀重悬于25 ml溶液6中，静置沉降10分钟。</li>
 <li>计数细胞后弃去上清液，向细胞沉淀中加入25–50 ml溶液6。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. 用于细胞电生理学、生物化学或免疫荧光研究的心肌细胞制备
<ol>
 <li>电生理学研究时，将心肌细胞置于50 ml离心管中的溶液6中，并防止沉降。</li>
 <li>用于生化研究， 例如 钙成像，将心肌细胞接种于层粘连蛋白包被的细胞培养皿中（层粘连蛋白终浓度为20 μg/ml，溶于PBS）。</li>
 <li>进行免疫荧光染色时，准备一个细胞培养皿，内含经玻璃盖玻片铺板并涂覆层粘连蛋白溶液的培养板（层粘连蛋白在PBS中的终浓度为50 μg/ml）。
 <ol>
 <li>铺板心肌细胞前去除溶液。使用显微镜观察并控制细胞密度。</li>
 <li>让心肌细胞在37 °C、2 % CO条件下于盖玻片上贴壁1小时2，移除溶液后立即开始标准染色程序。</li>
 <li>用固定剂孵育， 例如 4% PFA（PBS，pH 7.5）中室温固定10分钟，随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
 <li>用含10%血清、0.3% Triton、0.2% BSA的PBS溶液在室温下孵育心肌细胞30分钟，以实现细胞通透并抑制非特异性抗体结合。</li>
 <li>在37 °C下与一抗孵育1小时，并按前述方法洗涤。</li>
 <li>室温下与二抗孵育1小时。使用DAPI和荧光素偶联的鬼笔环肽（Alexa Fluor 488，Invitrogen）对细胞核和α-肌动蛋白进行复染。</li>
 <li>洗涤后，将玻璃盖玻片小心转移至经硅烷处理的载玻片上，并将细胞封埋于荧光封片剂中。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
6. 细胞电生理学
<ol>
 <li>在室温下对 freshly isolated 的心房和心室心肌细胞进行全细胞膜片钳记录。</li>
 <li>将形态健康的心肌细胞转移至灌流 chamber，其中加入已知体积的细胞外灌流液（117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH）。2PO4，4 mM NaHCO₃3，1.7 mM MgCl2，3 mM CoCl2，10 mM HEPES、10 mM 葡萄糖和 0.02 mM 河豚毒素（TTX），（pH 7.4）。使用 NaOH 调节 pH 值。</li>
 <li>使用合适的膜片钳设备（即 IX71 倒置显微镜、Multiclamp 700B 放大器、Digidata 1440A 采集系统及配备 pClamp10.3 软件（Molecular Devices）的计算机。</li>
 <li>使用充满含有130 mM KCl、2 mM MgCl的细胞内溶液时，膜片钳电极的阻值应为3-5 MΩ2，11 mM HEPES，11 mM EGTA，5 mM Na2ATP，0.4 mM Na2GTP，5 mM Na2CP 和 4.9 mM CaCl2 （pH 7.2）。使用 KOH 调节 pH 值。</li>
 <li>在−70 mV的钳制电位下，先给予20毫秒的−40 mV预脉冲，随后以10 mV为增量，从−60 mV至+50 mV进行4.5秒的电压阶跃，以诱发外向K⁺电流。</li>
 <li>确保漏电流始终 &lt;100 pA</li>
 <li>为分离不同的 K+ 电流，使用特异性抑制剂，例如 4-氨基吡啶（4-AP；ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA）、Heteropodatoxin 2（HpTx2；Alomone）或四乙基铵（TEA；Sigma）。储备液应以细胞外灌流液配制，并在“基线”记录后通过微尖管直接施加至细胞最近的周围区域。施加药物后应给予 2–3 分钟平衡时间，再进行“药物”记录。</li>
 <li>将单个细胞的电流幅值归一化为细胞大小（全细胞膜电容）进行分析。使用 pClamp10.3 软件（Molecular Devices）或类似软件离线分析数据。</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+all+voltage-gated+potassium+channels+use+MiRPs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs?</a> Circ. Res. 88, 981-983 (2001).</li>
<li>Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRP1+forms+IKr+potassium+channels+with+HERG+and+is+associated+with+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia.</a> Cell. 97, 175-187 (1999).</li>
<li>Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+voltage-gated+K%2B+channel+subunits+in+adult+rat+heart.+Relation+to+functional+K%2B+channels%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels?</a> Circ. Res. 77, 361-369 (1995).</li>
<li>Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+atrial+fibrillation+on+the+risk+of+death%3A+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study.</a> Circulation. 98, 946-952 (1998).</li>
<li>Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+the+calcium-independent%2C+depolarization-activated+K%2B+currents+in+rat+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).</li>
<li>Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atrial+ion+channel+and+transporter+subunit+gene-expression+remodeling+associated+with+valvular+heart+disease+and+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 471-481 (2005).</li>
<li>Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+transient+outward+K%2B+current+diversity+in+mouse+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).</li>
<li>Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNE3+mutation+V17M+identified+in+a+patient+with+lone+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation.</a> Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).</li>
<li>Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+KCNQ1+current+by+atrial+fibrillation-associated+KCNE4+%28145E%2FD%29+gene+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med.+J.+%28Engl.%29%22%5BJournal%5D)">Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism.</a> Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).</li>
<li>McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MinK-related+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The MinK-related peptides.</a> Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).</li>
<li>Pongs, O., Schwarz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancillary+subunits+associated+with+voltage-dependent+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels.</a> Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).</li>
<li>Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+of+function+in+IKs+secondary+to+a+mutation+in+KCNE5+associated+with+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation.</a> Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).</li>
<li>Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+97T+polymorphism+in+KCNE5+to+risk+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation.</a> Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).</li>
<li>Roepke, T. K., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetics+and+cardiac+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetics and cardiac ion channels.</a> Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).</li>
<li>Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+kcne2+impairs+ventricular+repolarization+via+disruption+of+I%28K%2Cslow1%29+and+I%28to%2Cf%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f).</a> FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).</li>
<li>Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+polymorphism+associated+with+antibiotic-induced+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).</li>
<li>Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+in+KCNE1-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation in KCNE1-null mice.</a> Circ. Res. 97, 62-69 (2005).</li>
<li>Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+KCNE2+gain-of-function+mutation+in+patients+with+familial+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation.</a> Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).</li>
<li>Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BThe+association+of+single+nucleotide+polymorphism+of+slow+delayed+rectifier+K%2B+channel+genes+with+atrial+fibrillation+in+Han+nationality+Chinese%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Xin.+Xue.+Guan.+Bing.+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">[The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese].</a> Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).</li>
<li>Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((minK-related+peptide+1+associates+with+Kv4.2+and+modulates+its+gating+function%3A+potential+role+as+beta+subunit+of+cardiac+transient+outward+channel%3F+Circ%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ.</a> Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

随着用于研究心脏功能及与基因敲除相关心脏病理学的转基因小鼠品系的不断发展，人们对采用专门方法来研究特定基因敲除效应的兴趣也在日益增加 体外在我们的实验室中，我们研究一组Kv通道辅助亚单位在心脏复极化过程中的作用。 KCNE 基因包含一个由5个基因组成的家族（KCNE1-5在人心室和心房复极化过程中发挥重要作用 11, 15. KCNEs 是单次跨膜结构域的Kv通道辅助亚单位，其自身无法介导任何钾离子电流，但可与Kv通道α亚单位形成复合物，显著调节后者在门控、电导、药理学特性及细胞内转运等功能特性。突变及常见多态性在 KCNE2 例如与遗传性和获得性长QT综合征（LQTS）相关 1, 16.
20世纪90年代，圣路易斯华盛顿大学的Nerbonne博士团队率先开展了不同Kv通道α亚基的分离与电生理学表征研究，并阐明了这些亚基在大鼠及小鼠心室和心房复极化过程中的作用。 3, 5, 7然而，关于 Kv 通道辅助亚基在啮齿类动物心肌心房和...

<table><tbody><tr><td>河豚毒素</td><td>Alomone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-氨基吡啶</td><td>ICN Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异孔毒素 2</td><td>Alomone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四乙基铵</td><td>Sigma Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II 型</td><td>Worthington</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠心房与心室心肌细胞的分离及kv通道记录

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE 基因编码一组小型的 Kv 通道辅助亚单位，这些辅助亚单位可与 Kv 通道 α 亚单位形成异源多聚体复合物，从而调节其功能特性。在患有心律失常（如长 QT 综合征和/或心房颤动）的患者中已发现 KCNE 基因的突变。然而，导致这些疾病的精确分子病理生理机制仍不明确。在以往的研究中，这些基因致病突变的电生理特性主要在异源表达系统中进行研究，我们无法确定所报道的效应是否可直接转化为原代心肌细胞中的真实情况。因此，在我们的实验室中采用了一种不同的方法。我们通过细胞电生理技术直接研究 KCNE 基因敲除小鼠分离的心肌细胞中 KCNE 基因缺失的影响——这是一种独特的技术，本文在《可视化实验杂志》（Journal of Visualized Experiments）中对此进行描述。通过主动脉插管，将基因工程改造的 KCNE 小鼠心脏迅速摘除并安装到 Langendorff 装置上。使用 EGTA 结合心肌组织中的游离 Ca2+，随后通过逆行灌注含有胶原酶的特制低 Ca2+ 缓冲液，实现心肌细胞的分离。然后可通过显微外科技术分离心房、游离右心室壁和左心室。钙离子随后通过多步洗涤程序逐步重新加入到分离的心肌细胞中。在分离后的最初 6 小时内，立即对形态健康且无自发性收缩的心房和心室心肌细胞进行膜片钳技术或其他生物化学分析的电生理学检测。

从基因工程小鼠中分离成年小鼠心肌细胞以研究特定目的基因的功能 体外 已成为深入理解心脏病理生理学的有力工具。目前，全球仅有少数但逐渐增多的基础科学研究实验室正在使用该方法。然而，成年小鼠心室心肌细胞的分离过程较为复杂，需由经验丰富的人员彻底且反复地操作。 图1 显示 freshly isolated 的典型心房和心室心肌细胞。对于心室心肌细胞，我们建议仅使用杆状、有横纹、外观健康且无自发性收缩的心室肌细胞。与心室肌细胞相比，心房肌细胞更短且更细。成年小鼠心房心肌细胞缺乏心室心肌细胞所具有的典型横纹和杆状形态。从完整小鼠心脏中分离得到的心室心肌细胞产量为 5x105 - 1×106对于心房心肌细胞，其数量显著较少。通常我们预期从一只小鼠心脏中可分离得到约5,000至25,000个心房细胞。分离后，心肌细胞可进行不同处理 体外 包括电生理记录在内的技术（图1建议在分离后6小时内使用分离的心肌细胞。 图1 显示通过全细胞膜片钳技术，由不同去极化阶跃诱发的 心房和心...

Kv 通道功能障碍与心律失常相关。为了研究导致此类心律失常的分子机制，我们采用一种系统性方案，从 Kv 通道辅助亚基基因敲除小鼠中分离心房和心室心肌细胞。分离后的心肌细胞可立即用于细胞电生理学研究、生物化学或免疫荧光（IF）检测。

小鼠心房与心室心肌细胞的分离及Kv通道记录

KCNE 基因编码一组小型的 Kv 通道辅助亚单位，这些亚单位与 Kv 通道 α 亚单位形成异源多聚体复合物，从而对其功能进行修饰……

本实验的总体目标是从基因工程小鼠中分离出存活的心房和心室心肌细胞，用于全细胞膜片钳记录及其他实验。首先，需对麻醉动物迅速而仔细地摘除心脏。第二步是将摘除并插管的心脏连接至LOR装置。接下来，用胶原酶溶液逆行灌注心脏，以消化结缔组织。最后一步是用精细镊子轻轻撕开组织，使其解离，并用经火焰抛光并扩大的塑料移液管头将细胞悬浮。随后，细胞逐步用富含钙的溶液重新悬浮。最终，采用全细胞膜片钳技术来展示电压门控钾离子通道电流的差异。该方法的主要优势在于，您将获得大量具有优良特性的HL和心室心肌细胞，可用于后续实验。通常，刚接触该方法的科研人员会遇到困难，因为该操作需要大量练习才能精确完成并获得理想结果。我在注射麻醉剂和250 IU肝素后，通过轻捏小鼠尾巴以检查其逃避反射，确保小鼠已进入深度麻醉状态。接下来，将小鼠以仰卧位转移至手术台。然后在剑突下方的皮肤和腹壁做一切口。以进行蛤壳式开胸术。沿肋弓向两侧延长切口，随后于腋中线处切断肋骨，并将肋骨向上翻起。接着打开心包，找到大血管。轻轻按压卵圆心以更好地暴露主动脉。然后用镊子夹住主动脉。小心将心脏提起，在心脏下方放置剪刀，通过一次剪切分离所有相连的血管。确保保留足够长度的升主动脉，以便进行Lor插管。接下来立即将取出的心脏转移至一个装有冰预冷溶液一的培养皿中。在此操作步骤中，使用1.8法式钢制插管针插入主动脉，并注意避免发生空气栓塞。接下来，用手术缝线将主动脉固定在套管上。随后，用一毫升溶液一冲洗冠状动脉。将套管连接至朗格多夫装置，以避免心肌发生长时间的缺血再灌注损伤。确保在120秒内完成从开胸到Lendorf插管的所有操作步骤。随后，用无钙溶液预先灌注Lendorf系统中的加热线圈，然后以每分钟4毫升的速度向心脏灌注10毫升该溶液。随后，用胶原酶溶液灌注心脏，以每分钟4毫升的速度灌注3次，每次8分钟。现在将心脏转移至预热的含有低钙溶液的100毫米培养皿中。4。用剪刀小心去除主动脉及其他非心脏组织。随后分离心房与心室，并将心房和心室组织浸没于少量溶液中。第四步：为分离心房心肌细胞，将心房转移至另一已预热的 100 毫米培养皿中。用精细镊子轻轻撕开组织，使组织充分解离。接着，使用带有扩大的火焰抛光塑料吸头的1毫升移液器，将细胞悬浮于1毫升溶液中。心房细胞用4毫升，溶液用量为5毫升。室性细胞置于溶液四中孵育五分钟。随后使用孔径为200微米的细胞滤器去除细胞碎片。将细胞悬液在室温下，于细胞培养罩内以16 × g离心，心房细胞离心一分钟，室性细胞离心两分钟。离心后弃去上清液，将沉淀物重悬于五毫升溶液中。心房细胞加入5毫升，心室细胞加入约20至25毫升。对于心室细胞，轻轻振荡试管以重悬细胞沉淀，再次在室温下以16 × g离心1分钟。第二次离心后，再次弃去上清液，并将沉淀重悬于5毫升溶液中。心房细胞用溶液六中的5毫升，心室细胞用约20至25毫升。然后让细胞沉降10分钟。在细胞培养操作台中，移除上清液，随后对细胞进行计数。进行电生理学研究时，向细胞中加入25至50毫升用于电生理研究的溶液六。将心肌细胞置于50毫升离心管中的溶液六中，并抑制其沉降。用于免疫荧光染色。准备一个细胞培养皿，其中含有经层粘连蛋白溶液包被的玻璃盖玻片，层粘连蛋白终浓度为50微克/毫升。将细胞培养皿在含 laminin 的 PBS 中于 37 摄氏度孵育两小时。随后，去除 laminin 溶液。在显微镜下接种心肌细胞前，先接种细胞并控制细胞密度。将心肌细胞在37摄氏度、2% CO2条件下孵育一小时，使其贴附于盖玻片上。一小时后，移除溶液，并立即开始标准染色程序。随后用心肌细胞固定剂孵育细胞。例如，在 pH 7.5 的 PBS 中使用 4% PFA，室温下处理 10 分钟。随后用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟，以通透细胞并抑制非特异性抗体结合。将心肌细胞在含 10% 血清、0.3% Triton、0.2% BSA 的 PBS 中孵育，室温下持续 30 分钟。随后，在37摄氏度下用一抗孵育一小时，并按前述方法进行洗涤。接着在室温下用二抗孵育一小时，以对细胞核和α-肌动蛋白进行复染。在室温下将二抗与DPI以及荧光染料偶联的鬼笔环肽孵育一小时。洗涤转移后，将玻璃盖玻片小心转移至经生理盐水处理的显微镜载玻片上。然后将细胞包埋于荧光封片剂中，用于全细胞膜片钳记录。将形态健康的心肌细胞转移至灌流室中，灌流室内加入特定体积的细胞外浴液。使用合适的膜片钳设备和充满细胞内溶液后电阻为三到五兆欧姆的膜片钳电极。在进行标准膜片钳记录时，待细胞形成封接并建立吉欧姆封接后，采用标准方案通过施加4.5秒、从负60毫伏到正50毫伏、以10毫伏为增量的电压阶跃来诱发外向钾电流，从而测量钾电流。确保漏电流始终小于100皮安。为了区分不同的钾电流，可使用特异性抑制剂，例如四氨基吡啶、异博定、苯妥英或四乙基铵。储备液应使用细胞外灌流液配制，并通过微尖电极直接施加到细胞附近尽可能接近的位置。在完成基线记录后。药物作用后，应给予两到三分钟的平衡时间，然后再开始记录。最后，使用 P clamp 10.3 软件或类似软件对数据进行离线分析。该图显示了一个示例性的心室心肌细胞，该细胞经 DPI 和 LOR 4 88 Phin 染色。以下是全细胞膜片钳记录的示例性电流轨迹。该图显示了一个用 DPI 和荧光素标记的白屈菜碱染色的典型心房心肌细胞。以下是全细胞膜片钳记录的典型轨迹。一旦掌握，如果操作得当，该技术可在大约一个半小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何分离基因工程小鼠的心房和心室心肌细胞。

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生物学

在小鼠的心房和心室肌细胞的分离及钾离子通道的录音

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人房颤肌细胞的分离以同时测量Ca2+瞬变和膜电流

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本方案采用组织块消化法从成年小鼠心脏中分离单个心房心肌细胞。该方法可用于分离右心房或左心房心肌细胞，进而用于膜片钳实验中对心房心肌细胞电生理特性的表征研究。...

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成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

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分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

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对Langendorff法的改良以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室心肌细胞

学习从小鼠分离心房和心室心肌细胞并进行全细胞膜片钳记录的方法。该方案利用胶原酶灌注和机械解离技术获取活细胞，用于研究钾离子通道功能及心律失常机制。

小鼠心房与心室心肌细胞的分离及Kv通道记录

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