果蝇（Drosophila melanogaster）中枢神经系统中单个细胞的标记

本实验的总体目标是对早期17期果蝇胚胎中枢神经系统中的单个神经元进行标记。首先收集卵并使其发育至合适阶段来实现该目标。实验的第二步是手动对卵进行氯化处理并排列整齐。

经过这种解剖操作后，对胚胎进行固定和切片，可使神经索暴露并便于观察。最后一步是通过离子电泳法施加亲脂性染料DiI，以标记单个细胞。最终，可在已知GFP表达模式背景下，或在突变体背景下，实现单个神经元形态的可视化观察（如需要）。

与现有的单细胞标记方法（如markum）相比，该技术的主要优势在于其可在胚胎中发挥作用，并能够有目的地可视化特定细胞。该方法的直观演示极为重要，因为许多操作步骤十分精细，难以掌握。让健康的果蝇在琼脂平板上产卵。

在 25 摄氏度下每 1.5 小时更换一次培养板，并保留胚胎。将胚胎留在培养板上，在 25 或 18 摄氏度下孵育，直至达到所需的发育阶段。准备就绪后，将胚胎转移至载有双面胶带的载玻片上。

转移胚胎时应避免带入任何琼脂，以免影响其在胶带上的黏附。将胚胎置于胶带上，静置干燥5至10分钟。

用庚烷胶将一块24毫米×60毫米的盖玻片进行包被。在载玻片中央滴加少量胶液，然后用一块18毫米见方的盖玻片将其铺展成极薄的薄膜。待胚胎干燥后，用针轻轻触碰它们。

卵壳将裂开，胚胎会粘附在针上。立即将脱氯的胚胎转移至琼脂块上，以防其干燥。将胚胎腹面朝上，每10个排成一行。

用解剖刀切除琼脂块上多余的琼脂。然后用涂有庚烷胶的盖玻片轻轻接触胚胎，使其腹面朝下粘附在盖玻片上。

在盖玻片周围贴上一圈胶带，并将其固定在显微镜载玻片上，保持胚胎位于盖玻片上方。在每个胚胎后端背侧滴加足量的PBS覆盖胚胎。

用玻璃针刺穿卵黄膜，沿背中线撕开膜，并将胚胎从膜中拖出。现在将胚胎重新定位到庚烷胶基质的另一位置，腹面朝下。用玻璃针轻轻穿刺体壁，并沿背中线撕开，对胚胎进行剖开处理。

用针将体壁向下压，使其贴附在载玻片上。在肠道的前端和后端撕开，并将肠道提起移除。由于多个胚胎将放置在同一张载玻片上，因此最好精确保持其方向一致，或绘制出它们的方向示意图。

随后，可将胚胎在含7.4%甲醛的PBS中轻微固定10至15分钟，再用PBS洗涤四次，操作时需格外小心，避免胚胎接触液面表面。表面张力会使其在10倍物镜下被破坏。将视野中心对准已制备好的胚胎，提高放大倍数，并在微分干涉差（DIC）光学或荧光下定位目标细胞。

如果靶细胞表达GFP，请确保显微镜的视场光阑仅打开至视野边缘，不要超过窄视野照明范围。光束将有助于定位微移液管，随后切换回10倍物镜，并将直流放大器的浴电极置于远离胚胎及微移液管路径的溶液中。将装有氯化锂溶液的注射微移液管安装到持针器上，并连接至显微操作仪。

使用课程控制将微量移液器置于物镜下方，并远高于胚胎的位置。如果微量移液器的角度过陡，其尖端将无法对焦；如果角度过浅，则杆部会触碰到浴槽壁。请将尖端居中于视野中。

现在降低微量移液器，并交替调焦，直至移液器进入 PBS 溶液中，且距离胚胎不过高。接着切换至高倍物镜，将移液器置于视野中央。当杆部清晰对焦后，沿 X 轴方向移动微移液器，使其尖端位于视野中心。

微量移液器吸头应位于胚胎液面之上。切换至荧光照明并观察吸头，检查是否有染料泄漏至眼睛。

调节直流电流，防止染料结晶在尖端积聚。现在将微移液管沿Z轴方向缓慢下降，靠近胚胎。随着胚胎逐渐对焦，逐步调整焦距。

切换至精细控制。将待注射的细胞聚焦于视野中央，然后重新对焦至微移液管尖端。此后，使用显微镜的载物台控制来移动胚胎相对于微移液管的位置可能会更加方便。

将微量移液器尖端与细胞接触，并在其表面形成凹陷。施加几秒的数纳安去极化电流。细胞上将形成微小的染料结晶，以确认细胞已被标记。

短暂打开快门，用荧光照射视野。如果细胞体显示出标记迹象，则继续施加电流数秒。随后关闭电流，并使用载物台控制迅速将胚胎从微移液管移开。

若未观察到D眼的标记，则可能是微移液管堵塞，需要更换。如果移液管尖端在到达细胞的过程中钩住根部其他组织并使其染色，可尝试将微移液管稍微回撤，重新接近目标细胞；若仍无法解决，再根据需要更换微移液管。继续在同一胚胎或其他位于同一载玻片上的胚胎中对其他细胞进行标记。

将吸头移至视野边缘并重复该操作。吸除注射 chamber 中大部分溶液，然后加入 7.4% 甲醛 PBS 固定胚胎 10 分钟，随后用 PBS 洗涤四次。

现在可按照上述方案对样品进行光转化，或用于共聚焦显微镜观察。在微分干涉差（DIC）光学条件下，一个充满染料的迟发性中间神经元被完美地光转化。标记细胞在未标记周围组织中的空间位置关系清晰可辨。

例如，在该制备样本中，可同时观察到细胞体在皮层中的位置以及纤维投射在神经微柱中的路径。染料滴加量稍大，导致多个邻近细胞同时被标记，从而难以将单个投射与特定的细胞体相对应。

还需注意，在荧光显微镜下，未进行光转化时背景分辨率明显较低。在此制备过程中，也可对相邻节段中的多个细胞进行注射，一种针对快速运动神经元中假染的抗体。尽管细胞体清晰可见，但该制备显示出长时间光转化可能带来的副作用。

与使用共聚焦光学对单个细胞进行标记相比，标记较深的细胞往往会出现过度染色并开始肿胀的现象。在携带GFP报告基因构建体的胚胎中进行染料示踪标记，可以提供D填充细胞在特定GFP阳性神经元或胶质细胞群体中的空间位置信息及其细胞身份。观看本视频后，您应能够充分理解如何在胚胎中枢神经系统中进行单个神经元的标记制备与操作步骤。

但在尝试此操作时，请务必注意，每一步骤都具有挑战性，因此可能需要重复数次，才能使整个操作流程顺利进行。