Name: 标记的单细胞在中枢神经系统果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 了解在果蝇胚胎中枢神经系统中标记单神经元的技术方法。该方法利用亲脂性染料和显微注射技术，结合共聚焦显微镜实现神经元形态的可视化分析，为神经发育生物学研究提供重要工具。

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本工作获得了德国研究基金会（DFG）对 G.M.T. 的资助。

我们在实验室中使用了两种略有不同的单神经元标记方法。这些差异主要涉及胚胎收集、去卵膜、去卵黄以及胚胎剖片步骤。图1概述了这两种方法的共同步骤与差异步骤。
1. 胚胎解剖用微针和染料注射用微量移液管的制备
<ol>
 <li>用于胚胎解剖的玻璃针由玻璃毛细管（直径1 mm，壁厚0.1 mm）使用Sutter拉针仪（Science Instruments）或类似设备拉制而成。或者，也可使用安装在针持中、经电解 sharpened 的0.15 mm钨丝进行解剖。（电解 sharpened 的操作说明见文献9）。</li>
 <li>染料注射用微吸管由带内丝的薄壁玻璃毛细管（Science Products；GB 100 TF 8P）使用Sutter拉针仪（Science Instruments）或类似设备拉制而成。微吸管尖端需锋利，且杆部应具有平缓、均匀的锥形，以利于穿过胚胎组织。理想的微吸管类型为Sutter仪器公司《微吸管食谱手册》第20页所述的“高阻抗微电极，尖而长”型（<a href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf" target="_blank">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a>）。通常在注射前立即拉制微吸管，以确保其尖端保持锋利和洁净。</li>
</ol>
2. 胚胎的收集、固定与解剖
<ol>
 <li>胚胎收集。我们已成功在发育阶段12至17的胚胎中使用此处所述的神经元注射方法3。胚胎在第17阶段逐渐形成角质层，解剖难度随之增加。有两种替代方法可用于获得特定发育阶段的胚胎。
 <ol class="ualpha">
 <li>让果蝇在涂有酵母糊的苹果汁-琼脂平板上过夜产卵。根据次日计划的注射时间调整产卵温度。次日收集所有卵，并依据形态学标准3挑选所需发育阶段的胚胎。</li>
 <li>如上所述让果蝇在琼脂平板上产卵，但在25 °C条件下每1.5小时更换一次新鲜琼脂平板。将每块平板孵育特定时间，直至胚胎达到所需的发育阶段。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>
 <ol class="ualpha">
 <li>化学去壳。使用金属刮刀将胚胎从琼脂上刮下，并转移至含有约10 ml Drosophila Ringer液或磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液的玻璃容器（例如培养皿或凹玻片）中。加入几滴浓漂白剂，在旋转平台上振荡数分钟，直至卵壳从胚胎上脱落。用多次更换的Ringer液/PBS溶液清洗胚胎，直至无残留漂白剂气味。在清洗过程中，确保胚胎不接触液面，否则胚胎将漂浮，不利于后续操作时的浸没。或者，也可采用文献4所述的篮式法进行化学去壳。</li>
 <li>机械去壳（见图2，步骤1-4）。将胚胎从琼脂平板转移至覆盖双面胶带的载玻片上。避免将琼脂随胚胎一同转移，以免影响其与胶带的粘附。让胚胎干燥5至10分钟，直至卵壳略微变脆。（等待期间，可将后续去卵黄时所需的盖玻片用胶水涂覆——见下文2.3B）。用针轻轻触碰每个胚胎，卵壳将裂开，胚胎会粘附在针上。立即将胚胎转移至琼脂块上以防止干燥，并将约10个胚胎排成一行，腹面朝上排列。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
去卵黄膜和切片可通过2.3A和2.3B中所述的任一方法手工完成。
<ol start="3">
 <li>
 <ol class="ualpha">
 <li>将适当发育阶段的单个去壳胚胎从盛有林格氏液的培养皿中转移至预先制备的载玻片硅胶坝上的数滴林格氏液中。（通过在载玻片上涂抹一层薄薄的硅胶密封剂制成一个3 cm见方的坝，然后在坝中央加入一滴0.01%多聚赖氨酸溶液，室温静置24小时使其固化。）使用玻璃巴斯德吸管转移胚胎，确保转移过程中胚胎始终浸没在林格氏液下。 
 用一对精细镊子固定胚胎的后端，同时用一对精细虹膜剪在距胚胎前端约四分之一处轻轻挤压胚胎，但不要完全剪断。目的是仅裂开卵黄膜，同时尽量减少对胚胎本身的损伤。保持镊子位置不变，使用钨针将胚胎从裂开的膜中轻轻推出，并使其腹面朝下贴附于载玻片上。胚胎应能粘附在多聚赖氨酸涂层上。 
 用 sharpened 钨针对胚胎进行剖开处理。先轻轻刺破，然后沿背中线撕开体壁。使用钨针将体壁向下压，使其贴附于载玻片表面。为避免损伤体壁，操作时可将肠道置于体壁与钨针之间作为缓冲。随后用钨针在肠道的前、后端将其撕开并移除。如有需要，可将更多胚胎转移至同一载玻片上，依次进行去卵黄膜和剖开处理，注意避免损伤已固定在载玻片上的其他胚胎。</li>
 <li>在24 × 60 mm盖玻片上涂布庚烷胶（见表1）：将少量胶液滴于盖玻片中央，用18 × 18 mm盖玻片将其均匀铺展成极薄的薄膜。将该盖玻片放置于载玻片上，并在其边缘用单面胶带制作一个框架。切除固定10个胚胎排的琼脂块周围多余的琼脂，轻轻将胚胎接触涂有庚烷胶的盖玻片，胚胎应以腹面朝下的方向粘附于盖玻片上。加入足量PBS覆盖胚胎（见图2，步骤4–6）。 
 用玻璃针或钨针在每个胚胎背部近后端处刺穿卵黄膜，沿背中线撕开膜，并将胚胎从中拖出。将胚胎重新定位至庚烷胶基质上的另一位置，腹面朝下，然后采用与2.3A）相同的方法进行剖开处理（见图2，步骤7–8）。由于多个胚胎将在同一载玻片上进行剖开，因此建议精确控制其方向，或在载玻片上绘制示意图记录各胚胎的位置和朝向。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>剖开后，可将胚胎在含7.4%甲醛的PBS中进行短暂固定（10–15分钟），随后用PBS洗涤4次。在此过程中必须格外小心，避免胚胎接触液面，否则表面张力会破坏胚胎结构。此预固定步骤并非绝对必要，但有助于防止晚期胚胎体壁肌肉收缩，并有助于稳定早期胚胎组织。需注意的是，固定会使胚胎组织透明度降低，从而在微分干涉差（DIC）显微观察下略微影响成像质量。</li>
</ol>
3. 注射微量移液管的填充
取一个0.5 ml的Eppendorf微量离心管，加入0.1%的碳菁染料DiI（Molecular Probes，Eugene，OR）溶于100%乙醇的溶液至半满（务必使用“干燥”的无水乙醇，以避免DiI沉淀）。在管盖上打一个细小孔洞，将微量移液器的钝端穿过盖上的孔插入管中。让DiI溶液沿移液器丝线上升至少5分钟。（每次不填充移液器时，务必盖住盖上的孔洞，以防止乙醇挥发）。
神经元染料注射所需的设备（图3）。
显微镜。 进行神经元染料注射时必须使用固定载物台的显微镜，以避免在调焦过程中胚胎发生垂直移动。任何此类移动都会在移液管与胚胎接触后导致其位置偏移。我们发现蔡司Axioskop FS和奥林巴斯AX50/BX50固定载物台型号均非常适合此用途。显微镜应配备透射光微分干涉差（DIC）光学系统，用于染色前神经元的观察。显微镜应为直立式而非倒置式。在直立式显微镜中，微移液管尖端与观察物镜位于胚胎的同一侧；而在倒置式显微镜中，两者则位于胚胎的相对两侧。后一种配置会降低DIC光学系统的成像质量。显微镜应具备荧光显微镜功能，并配备适用于DiI观察的滤光片组。由于DiI的光谱相对较宽，其激发和发射波长最大值分别为549 nm和565 nm，因此该范围内的许多滤光片组均可使用，例如 Alexa 568、Cy3、Rhodamine、Texas Red或TRITC对应的滤光片组。尽管在荧光光源路径中安装电子控制快门以便无需手动接触显微镜即可操作快门较为方便，但我们也在仅配备手动快门的系统上成功完成了标记。最后，注射过程中的观察需要使用高倍率、高数值孔径的水浸物镜。该物镜应设计为无需盖玻片使用。我们已成功使用蔡司Achroplan 100x/1.0W、奥林巴斯LUMPlan FL 100x/1.0W以及奥林巴斯LUMPlan FL/IR 60x/0.9 W物镜。
在神经元染料注射过程中，需要使用显微操作器来定位和移动微移液管。我们曾使用过徕卡（Leica）显微操作器，以及安装在载物台上的纳拉西ige（Narashige）三轴液压显微操作器。
需要使用带有电流注射功能的细胞内直流放大器，以实现从微电极管中通过离子电泳方式注入DiI。
4. 染料注射步骤
<ol>
 <li>将载有固定胚胎的载玻片放置在显微注射镜的载物台上（图3）。使用10倍物镜定位胚胎，并将其移至视野中央。</li>
 <li>将高倍物镜转入观察位置，并对胚胎进行调焦。在微分干涉差（DIC）光学下定位目标细胞（若目标细胞表达GFP，则可使用荧光观察），并将其移至视野中央。确保显微镜的视场光阑仅打开至视野边缘，不可超出。较窄的照明光束有助于微吸管的定位（见下文步骤4.4）。将物镜抬升至尽可能高于胚胎的位置，同时仍保持与Ringer/PBS溶液接触。</li>
 <li>将直流放大器的浴电极放入PBS孔中，避开胚胎及微吸管的移动路径。</li>
 <li>将注射用微吸管插入已充满0.1 M LiCl溶液的持针器中。将微吸管持针器连接至显微操作仪。利用显微操作仪的粗调控制装置，将微吸管移至物镜尖端与胚胎之间的空间，确保其位置明显高于胚胎水平。由于高倍物镜的工作距离较短，必须以较小的角度持握微吸管才能使其进入焦点（见图3）。初次操作时需通过反复尝试确定合适角度：若角度过陡，则无法使微吸管尖端进入焦点；若角度过平，则微吸管杆部会触碰到固定灌流液的围堰壁面。</li>
 <li>将微吸管尖端置于视野中央。为此，将视线调整至与胚胎同一水平，使用显微镜载物台的Y轴控制装置前后移动微吸管。当其尖端穿过光路时，可观察到光线在其表面产生的明亮反射。沿X轴方向向前移动微吸管尖端，使其越过光束。在高倍物镜的小视野中，若寻找微吸管杆部而非尖端，将更易于定位。现在通过显微镜目镜观察，并逐渐降低高倍物镜，直至微吸管杆部进入焦点。使用显微操作仪控制装置在Y轴方向来回移动微吸管，有助于其在逐渐聚焦过程中被定位。当杆部清晰聚焦后，沿X轴移动微吸管，使其尖端位于视野中央。此时微吸管尖端应仍明显高于胚胎水平。切换至荧光照明，检查尖端是否有DiI渗漏。调节直流电流，防止尖端形成DiI结晶。</li>
 <li>使用显微操作仪控制装置，沿Z轴方向降低微吸管，并通过显微镜调焦装置使其重新进入焦点。以这种方式逐步将微吸管向胚胎方向降低。初始阶段可使用显微操作仪和显微镜的粗调Z轴控制装置。但当胚胎进入焦点时，应切换至微调旋钮。</li>
 <li>当胚胎表面进入焦点时，沿显微操作仪方向将微吸管尖端移向视野边缘。对目标注射细胞进行聚焦，并确认其位于视野中央。重新对微吸管尖端聚焦，并在Y轴方向移动，使其与细胞处于相同的Y轴水平。在沿Z轴降低微吸管的同时，沿X轴方向将其尖端移向细胞。若使用Leica显微操作仪，您可能会发现显微镜载物台控制装置在X轴方向的移动控制比显微操作仪控制装置更精细，因此当尖端接近细胞时应切换至载物台控制。</li>
 <li>使微吸管尖端接触细胞，并在其表面形成压痕。施加数秒的数纳安去极化电流。应可见细胞表面形成微小的DiI结晶。为确认细胞已被标记，短暂打开快门以荧光照明照射胚胎，随后切换回DIC模式。若目标细胞本体显示出标记迹象，则继续施加电流数秒。关闭电流后，立即使用显微镜载物台控制装置沿X轴方向将胚胎快速移离微吸管，随后将微吸管从溶液中撤出。若未观察到明显的DiI标记，微吸管可能已被堵塞，需更换新的微吸管。您可能会发现微吸管尖端在到达目标细胞途中钩住了其他组织，导致非目标组织被染色而非目标细胞。此时可尝试将微吸管略微回撤，并重新接近细胞。必要时需更换微吸管并重试。</li>
</ol>
<ol start="9">
 <li>如有需要，可在同一胚胎中对多个细胞进行单独标记。</li>
 <li>移除注射皿中大部分溶液，然后加入7.4%多聚甲醛/PBS固定10分钟，随后用PBS洗涤4次。将胚胎置于避光、湿润的容器中，在室温下静置至少4小时（或在4 °C过夜），以使DiI充分扩散至神经元突起中（避免荧光漂白或样本干燥）。在此阶段，DiI标记的细胞可直接在共聚焦显微镜下观察，或进行光转化处理后再观察。</li>
</ol>
5. 使用微分干涉相差光学显微镜观察的光转化
光转化的原理是：在适当波长的光照下，被染色细胞发出的荧光促使DAB发生（光）氧化反应。这意味着强荧光细胞的光转化所需时间比弱荧光细胞更短。如果同一标本中多个标记细胞的荧光强度差异过大，则可能导致无法以相同质量对所有细胞进行光转化（见图4C）：此时可能需要在忽略较弱细胞（采用短时间照射）与接受较强细胞开始肿胀（采用较长时间照射）之间做出折中选择。如果所有细胞标记均过弱（因而需要非常长的照射时间），内源性过氧化物酶引起的背景信号可能成为问题。由于DAB具有毒性，操作时应格外小心。废弃物可用7%含氯漂白剂进行“去活化”处理。
<ol>
 <li>光转化必须对每个胚胎单独进行。当每个载玻片上仅注射一个胚胎时，将覆盖胚胎的PBS溶液替换为DAB溶液（3 mg DAB/ml Tris缓冲液），将载玻片置于荧光显微镜下，用100倍物镜观察已填充的细胞。（若使用正置显微镜，物镜会浸入DAB溶液中，因此在光转化完成后需多次用水清洗物镜；若使用倒置显微镜则可避免此问题）。使用Cy3滤光片组和100W汞灯，持续用红光激发波长照射细胞，直至标记的神经元中出现明显的棕褐色DAB反应产物（通过切换至明场照明定期检查）。达到最佳DAB染色所需时间不一，但需在荧光完全消失后继续暴露于激发光下。光转化完成后，用PBS多次洗涤样品。将PBS替换为一滴70%甘油，用手术刀片刮除硅胶，替换为一圈凡士林，并加盖盖玻片。</li>
 <li>当同一载玻片上有多个胚胎完成填充时，将每个胚胎转移至独立的24 × 60 mm盖玻片上的少量PBS液滴中，使胚胎腹面朝向玻璃。在每个胚胎周围贴上一圈胶带以形成小室，并用PBS覆盖样品。光转化前将载玻片置于湿盒中，防止干燥。将覆盖胚胎的PBS更换为DAB溶液。立即将载玻片置于配备100W汞灯的倒置显微镜上，使用Cy3滤光片组激发DiI，并采用50倍物镜。光转化完成后，将胚胎转移至新的载玻片上的70%甘油液滴中，加盖盖玻片并用指甲油封固。</li>
</ol>
6. 共聚焦显微镜观察
<ol>
 <li>在完成步骤4.10后，将胚胎转移至新鲜的24 × 60 mm盖玻片上的一小滴PBS中。为获得最佳光学效果，应将胚胎展平后背侧朝向盖玻片放置（仅在盖玻片与胚胎之间保留少量PBS）。</li>
 <li>在胚胎周围贴一圈胶带作为框架，当盖上载玻片时，扩大PBS液滴以充满整个框架。小心地将载玻片盖上，并用指甲油固定。应尽快在共聚焦（或荧光）显微镜下观察已填充的神经元。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

一个主要优势是 果蝇 作为一种模式系统，其优势在于能够对单个细胞水平上的发育和功能进行分析。这对于神经系统尤其重要，因为神经系统的细胞类型多样性极高，相邻细胞的功能和形态可能完全不同。
本文介绍的方法可用于对单个神经元进行染料标记，该染料既可转化为永久性染色，也可直接通过荧光显微镜观察。该方法能够清晰地展示神经突起的形态细节（图4）。该方法的主要优势之一在于，它几乎可以用于研究中枢神经系统（CNS）中任何类型的神经元形态（关于胚胎腹神经索，参见 Rickert et al., 2011；关于胚胎脑，参见 Kunz et al., 2012）。此外，与某些遗传标记技术不同，该方法无需胚胎中存在复杂的遗传元件组合。染料注射可应用于携带报告基因构建体的动物细胞，从而能够在野生型或突变型背景下，结合特定基因表达模式来观察单个细胞的形态（图4D 和 图5）。我们还曾利用该技术在活体胚胎神经元中监测轴突发育的动态过程11, 12<...

了解单个细胞水平上的神经元形态是理解神经元连接性和中枢神经系统功能的关键前提。因此，自神经科学发展的早期以来，研究人员一直致力于开发单细胞标记技术（关于此问题的历史讨论参见7）。传统的高尔基染色等方法虽然能够很好地分辨神经元形态，但如果需要特异性地标记某一特定类型的神经元，则并不适用，因为其染色具有随机性。通过微电极向细胞内或近细胞内注射染料以标记单个细胞的方法，解决了特异性标记的需求。
单个神经元染料注射技术的应用 果蝇 由于生物体及其神经元的尺寸微小，这构成了一个主要挑战。尽管如此，仍可对胚胎的单个神经元进行染色 果蝇 20世纪80年代中期，Corey Goodman 实验室实现了对神经元的研究突破 15该方法已被证明极为有用，为神经元发育机制提供了一些关键见解 果蝇 在过去的20到30年里（例如 2, 10），许多研究人员对其望而却步，主要原因是其技术要求较高。
近年来，果蝇（Drosophila）神经元标记遗传技术的出现也导致单个神经元染料注射方法变得不再流行。由GAL4驱动的膜靶向GFP构建体表达能够实现神经形态的高分辨率成像1, 20。然而，该方法存在某些局限性：GFP常常不可避免地在多个细胞中表达，从而掩盖单个神经元的结构；此外，可能缺乏可用于在特定目标神经元中驱动表达的GAL4驱动品系。MARCM（利用可抑制细胞标记物的嵌合体分析）方法8原则上可在单细胞水平上标记任意神经元，但由于GAL80蛋白的降解速度较慢，该方法无法在胚胎和早期幼虫中成功应用。
鉴于遗传标记技术存在上述局限性，我们认为在Drosophila胚胎中进行单神经元染料注射仍然是一种有价值的技术，值得更广泛的应用。为了推动这一目标，本文提供了该方法的详细描述。我们近期关于晚期Drosophila胚胎腹节神经节中所有中间神经元形态的研究14，充分展示了该技术的强大能力。该研究揭示了不同类型神经元细胞形态的变异性以及胚胎中枢神经系统神经节组织的基本规律，而这些成果是目前其他任何可用的标记方法均无法实现的。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DAB</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank"&gt;D-5905&lt;/a&gt;</td><td>100 mM TRIS-Hcl（pH 7.4）中配制成 2-3 mg/ml</td></tr><tr><td>DiI</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Invitrogen/Molecular Probes</a></td><td>&lt;a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank"&gt;D-282&lt;/a&gt;</td><td>乙醇中配制成 1 mg/ml</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydl&amp;#8211;sung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWp&amp;#8211;fVhTl" target="_blank"&gt;Formaldehyde&lt;/a&gt;</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>PBS 中配制成 7.4%</td></tr><tr><td>甘油</td><td><a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank"&gt;Roth&lt;/a&gt;</a></td><td>3783</td><td>PBS 中配制成 70%</td></tr><tr><td>庚烷胶</td><td>Beiersdorf AG</td><td>Cello 31-39-30 *</td><td>用正庚烷稀释至约 1:1</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>TRIS</td><td><a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank"&gt;Roth&lt;/a&gt;</a></td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td><a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Vector Laboratories</a></td><td>&lt;a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank"&gt;H1000&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>TCS SP2</td><td>用于观察和记录荧光标记</td></tr><tr><td>直流放大器</td><td>Dragan Corporation</td><td>Cornerstone ION-100</td><td>用于进行标记操作</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td><a href="http://www.menzel.de/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.menzel.de/" target="_blank"&gt;Menzel&lt;/a&gt;</a></td><td>BB018018A1</td><td>18 × 18 mm</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td><a href="http://www.menzel.de/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.menzel.de/" target="_blank"&gt;Menzel&lt;/a&gt;</a></td><td>BB024060A1</td><td>24 × 60 mm</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td>用于胚胎的制备和解剖</td></tr><tr><td>扁平毛细管</td><td><a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank"&gt;Hilgenberg&lt;/a&gt;</a></td><td></td><td>外径 1 mm；玻璃厚度 0.1 mm</td></tr><tr><td>注射毛细管</td><td>Science Products</td><td>GB 100 TF 8P</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪 R</td><td>Leica</td><td></td><td>用于进行标记操作</td></tr><tr><td>拉针仪 P-97</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>用于拉制毛细管</td></tr><tr><td>载玻片</td><td><a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank"&gt;Marienfeld Superior&lt;/a&gt;</a></td><td>1000000</td><td></td></tr><tr><td>科研显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop 2 mot</td><td>用于光转化后观察标记</td></tr><tr><td>科研显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX50</td><td>用于进行标记操作</td></tr><tr><td>Sony MC3255 视频相机</td><td>Sony/AVT Horn</td><td>Sony MC3255</td><td>用于记录光转化后的标记图像</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class="jove_content"&gt;&lt;strong&gt;表 1。&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

果蝇（drosophila melanogaster）中枢神经系统中单个细胞的标记

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

本文介绍了如何通过邻近细胞注射脂溶性荧光膜标记物DiI，对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎中枢神经系统中的单个神经元进行特异性标记。该方法可实现神经元细胞形态的高分辨率可视化。可在中枢神经系统中对任意细胞进行标记：目标神经元的细胞体可通过微分干涉差（DIC）光学显微镜观察，或通过表达荧光遗传标记物（如GFP）来识别。标记后，可通过光转化将DiI转化为永久性的棕褐色染色，从而利用透射光和DIC光学显微镜观察细胞形态。 Alternatively，也可直接使用共聚焦显微镜观察DiI标记的细胞，从而实现与遗传引入的荧光报告蛋白的共定位分析。该技术适用于任何基因型的动物，因此能够在单细胞分辨率下分析突变体表型。

图4展示了本研究中所述技术的典型结果。图4A显示了一个DiI标记的单个中间神经元被清晰光转化的示例，很好地体现了此类样本所能提供的细节水平。在微分干涉差（DIC）光学下观察时，标记细胞在未标记周围组织中的空间位置关系变得清晰可见，例如细胞体在皮层中的位置以及纤维投射在神经网中的走向。
图4B 是一个染料液滴稍大的示例，导致多个相邻细胞同时被标记。这种情况常常使得难以将单个投射结构与特定的细胞体相对应。此外，该图还显示，在荧光显微镜下直接观察时（未进行光转化），背景分辨率明显较低。
图4C中的标本展示了一种多个细胞在相邻节段中被分别标记的情况。经光转化后，按照标准方案13，使用抗Fas2抗体对样本进行染色，以在神经纤维网中提供标记结构（神经束）。尽管在此样本中，大多数细胞体分离良好，能够可靠地绘制其投射路径，但它也展示了当光转化时间延长（以同时转化标记较弱的细胞）时可能出现的情...

我们介绍一种用于标记黑腹果蝇（Drosophila）胚胎中枢神经系统（CNS）中单个神经元的技术，该技术可通过透射光显微镜或共聚焦显微镜对神经元形态进行分析。

果蝇（Drosophila melanogaster）中枢神经系统中单个细胞的标记

在本文中，我们描述了如何通过邻近细胞注射法将黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎中枢神经系统中的神经元进行单个标记……

本实验的总体目标是对早期17期果蝇胚胎中枢神经系统中的单个神经元进行标记。首先收集卵并使其发育至合适阶段来实现该目标。实验的第二步是手动对卵进行氯化处理并排列整齐。经过这种解剖操作后，对胚胎进行固定和切片，可使神经索暴露并便于观察。最后一步是通过离子电泳法施加亲脂性染料DiI，以标记单个细胞。最终，可在已知GFP表达模式背景下，或在突变体背景下，实现单个神经元形态的可视化观察（如需要）。与现有的单细胞标记方法（如markum）相比，该技术的主要优势在于其可在胚胎中发挥作用，并能够有目的地可视化特定细胞。该方法的直观演示极为重要，因为许多操作步骤十分精细，难以掌握。让健康的果蝇在琼脂平板上产卵。在 25 摄氏度下每 1.5 小时更换一次培养板，并保留胚胎。将胚胎留在培养板上，在 25 或 18 摄氏度下孵育，直至达到所需的发育阶段。准备就绪后，将胚胎转移至载有双面胶带的载玻片上。转移胚胎时应避免带入任何琼脂，以免影响其在胶带上的黏附。将胚胎置于胶带上，静置干燥5至10分钟。用庚烷胶将一块24毫米×60毫米的盖玻片进行包被。在载玻片中央滴加少量胶液，然后用一块18毫米见方的盖玻片将其铺展成极薄的薄膜。待胚胎干燥后，用针轻轻触碰它们。卵壳将裂开，胚胎会粘附在针上。立即将脱氯的胚胎转移至琼脂块上，以防其干燥。将胚胎腹面朝上，每10个排成一行。用解剖刀切除琼脂块上多余的琼脂。然后用涂有庚烷胶的盖玻片轻轻接触胚胎，使其腹面朝下粘附在盖玻片上。在盖玻片周围贴上一圈胶带，并将其固定在显微镜载玻片上，保持胚胎位于盖玻片上方。在每个胚胎后端背侧滴加足量的PBS覆盖胚胎。用玻璃针刺穿卵黄膜，沿背中线撕开膜，并将胚胎从膜中拖出。现在将胚胎重新定位到庚烷胶基质的另一位置，腹面朝下。用玻璃针轻轻穿刺体壁，并沿背中线撕开，对胚胎进行剖开处理。用针将体壁向下压，使其贴附在载玻片上。在肠道的前端和后端撕开，并将肠道提起移除。由于多个胚胎将放置在同一张载玻片上，因此最好精确保持其方向一致，或绘制出它们的方向示意图。随后，可将胚胎在含7.4%甲醛的PBS中轻微固定10至15分钟，再用PBS洗涤四次，操作时需格外小心，避免胚胎接触液面表面。表面张力会使其在10倍物镜下被破坏。将视野中心对准已制备好的胚胎，提高放大倍数，并在微分干涉差（DIC）光学或荧光下定位目标细胞。如果靶细胞表达GFP，请确保显微镜的视场光阑仅打开至视野边缘，不要超过窄视野照明范围。光束将有助于定位微移液管，随后切换回10倍物镜，并将直流放大器的浴电极置于远离胚胎及微移液管路径的溶液中。将装有氯化锂溶液的注射微移液管安装到持针器上，并连接至显微操作仪。使用课程控制将微量移液器置于物镜下方，并远高于胚胎的位置。如果微量移液器的角度过陡，其尖端将无法对焦；如果角度过浅，则杆部会触碰到浴槽壁。请将尖端居中于视野中。现在降低微量移液器，并交替调焦，直至移液器进入 PBS 溶液中，且距离胚胎不过高。接着切换至高倍物镜，将移液器置于视野中央。当杆部清晰对焦后，沿 X 轴方向移动微移液器，使其尖端位于视野中心。微量移液器吸头应位于胚胎液面之上。切换至荧光照明并观察吸头，检查是否有染料泄漏至眼睛。调节直流电流，防止染料结晶在尖端积聚。现在将微移液管沿Z轴方向缓慢下降，靠近胚胎。随着胚胎逐渐对焦，逐步调整焦距。切换至精细控制。将待注射的细胞聚焦于视野中央，然后重新对焦至微移液管尖端。此后，使用显微镜的载物台控制来移动胚胎相对于微移液管的位置可能会更加方便。将微量移液器尖端与细胞接触，并在其表面形成凹陷。施加几秒的数纳安去极化电流。细胞上将形成微小的染料结晶，以确认细胞已被标记。短暂打开快门，用荧光照射视野。如果细胞体显示出标记迹象，则继续施加电流数秒。随后关闭电流，并使用载物台控制迅速将胚胎从微移液管移开。若未观察到D眼的标记，则可能是微移液管堵塞，需要更换。如果移液管尖端在到达细胞的过程中钩住根部其他组织并使其染色，可尝试将微移液管稍微回撤，重新接近目标细胞；若仍无法解决，再根据需要更换微移液管。继续在同一胚胎或其他位于同一载玻片上的胚胎中对其他细胞进行标记。将吸头移至视野边缘并重复该操作。吸除注射 chamber 中大部分溶液，然后加入 7.4% 甲醛 PBS 固定胚胎 10 分钟，随后用 PBS 洗涤四次。现在可按照上述方案对样品进行光转化，或用于共聚焦显微镜观察。在微分干涉差（DIC）光学条件下，一个充满染料的迟发性中间神经元被完美地光转化。标记细胞在未标记周围组织中的空间位置关系清晰可辨。例如，在该制备样本中，可同时观察到细胞体在皮层中的位置以及纤维投射在神经微柱中的路径。染料滴加量稍大，导致多个邻近细胞同时被标记，从而难以将单个投射与特定的细胞体相对应。还需注意，在荧光显微镜下，未进行光转化时背景分辨率明显较低。在此制备过程中，也可对相邻节段中的多个细胞进行注射，一种针对快速运动神经元中假染的抗体。尽管细胞体清晰可见，但该制备显示出长时间光转化可能带来的副作用。与使用共聚焦光学对单个细胞进行标记相比，标记较深的细胞往往会出现过度染色并开始肿胀的现象。在携带GFP报告基因构建体的胚胎中进行染料示踪标记，可以提供D填充细胞在特定GFP阳性神经元或胶质细胞群体中的空间位置信息及其细胞身份。观看本视频后，您应能够充分理解如何在胚胎中枢神经系统中进行单个神经元的标记制备与操作步骤。但在尝试此操作时，请务必注意，每一步骤都具有挑战性，因此可能需要重复数次，才能使整个操作流程顺利进行。

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