标记的单细胞在中枢神经系统果蝇
2013年3月4日
我们提出了一种技术，用于标识单个神经元在中枢神经系统（CNS）的果蝇，胚胎，它允许由任一透射光或激光共聚焦显微镜的神经元的形态学分析。
该程序的总体目标是标记早期 17 型果蝇胚胎中枢神经系统中的单个神经元。这是通过收集鸡蛋并让它们发育到正确的阶段来实现的。该程序的第二步是手动氯化和对齐鸡蛋。
在这个 diva 之后，胚胎的定植和锉削使神经脊髓可以接近。最后一步是通过亲脂性模具眼的 Iono retic 应用来标记单细胞。最终，如果需要，在已知 GFP 表达模式和/或突变背景的背景下，结果允许对单个神经元形态进行可视化。
与现有的单细胞标记方法（如 markum）相比，该技术的主要优点是它在胚胎中起作用，并允许有意识地可视化已识别的细胞。这种方法的视觉演示非常有用，因为许多步骤都很精细，因此很难学习。让健康的果蝇将胚胎产在琼脂平板上。
在 25 摄氏度下每 1 个半小时更换一次板并保留胚胎。将胚胎在 25 或 18 摄氏度的平板上孵育，直到它们达到所需的发育阶段。准备好后，将胚胎转移到覆盖有双面胶带的载玻片上。
避免将任何琼脂与胚胎一起转移，因为这会干扰它们与胶带的粘附。在磁带上。等待时让胚胎干燥 5 到 10 分钟。
用庚烷胶涂覆 24 毫米 x 60 毫米的盖玻片。在载玻片中央滴一小滴胶水，并使用 18 毫米见方的盖玻片将其涂抹成非常薄的薄膜。胚胎干燥后，用针轻轻触摸它们。
冠状体会裂开，胚胎会粘在针头上。立即将脱氯的胚胎转移到琼脂块中，以防止它们干燥。将它们排成一行 10 个，腹侧朝上。
用手术刀从块上切掉多余的琼脂。然后用涂有庚烷胶的盖玻片轻轻触摸胚胎。它们应该贴在盖玻片上，腹侧朝下。
在盖玻片周围贴上一框胶带并将其贴在显微镜载玻片上。将胚胎保持在盖玻片的顶部。在每个胚胎的后端附近用大量的 PBS 覆盖胚胎。
用玻璃针穿透玻璃膜，沿背中线撕开膜，将胚胎从膜中拖出。现在将胚胎腹侧向下重新定位到庚烷胶基材上的其他位置。用玻璃针轻轻穿孔体壁并沿背中线撕裂，将胚胎锉平。
使用针头向下推体壁，使其粘附在载玻片上。撕开肠道的前端和后端，然后将肠道抬起。由于几个胚胎将在同一张载玻片上归档，因此非常准确地确定它们的方向或绘制它们的方向图是有帮助的。
接下来，可以将胚胎在 7.4% 甲醛的 PBS 溶液中轻轻固定 10 到 15 分钟，然后在 PBS 中洗涤四次，请格外小心，避免胚胎接触溶液表面。表面张力将在 10 倍物镜下摧毁它们。将视野置于准备好的胚胎上，增加放大倍率并在 DIC 光学或荧光下定位感兴趣的细胞。
如果目标细胞表达 GFP，请确保显微镜的视场光阑刚好打开到视场的边缘，而不是超出狭窄的照明。光束将有助于将微量移液器更换回 10 倍物镜，并将直流放大器的浴电极放入远离胚胎和微量移液器路径的溶液中。将装满氯化锂溶液的注射微量移液管安装到支架上，并将其连接到微型纵器上。
使用航向控制，将微量移液管定位在目标下方和胚胎上方。如果微肽的角度太陡，尖端将无法聚焦。如果太浅，竖井会撞到浴缸壁上，使尖端在视野的中心
。现在降低微量移液器并交替聚焦，直到移液器在 PBS 中并且不要在胚胎上方太远。现在更改为高倍物镜并将移液器置于视野内。当轴聚焦时，沿 X 轴移动微量移液器，直到其尖端位于视野的中心。
微量移液器吸头应远高于胚胎的水平。切换到荧光照明并检查尖端。检查染眼是否渗漏。
调整直流电流，使染料眼晶体不会在尖端积聚。现在将 Z 轴上的微量移液管降低到胚胎。随着胚胎成为焦点，逐渐调整焦点。
切换到使用精细控制。将要注射的细胞聚焦在视野中心，然后重新聚焦在微量移液器吸头上。从这一点开始，使用显微镜的载物台控制相对于微量移液器移动胚胎可能更方便。
使微量移液器尖端与细胞接触，并在其表面形成凹陷。在几秒钟内通过几纳安培的去极化电流。细胞上会形成一个小的染料眼晶体，以确认细胞已被标记。
短暂打开快门，用荧光灯照亮视野。如果单元格主体显示标记迹象，请再应用 current 几秒钟。然后关闭电流，并使用载物台控制器快速将胚胎从微量移液器中拉出。
如果没有明显的 D 眼标记，则微量移液器可能已被堵塞，需要更换。如果移液管的尖端在细胞根部卡住其他组织并弄脏该组织，请尝试稍微抽出微量移液管并重新接近细胞，然后再根据需要更换微量移液器。继续标记同一胚胎或同一载玻片上其他胚胎中的其他细胞。
将尖端移动到视野的边缘，然后重复该过程。去除注射室中的大部分溶液。然后加入 7.4% 甲醛 PBS 10 分钟固定胚胎，然后用 PBS 洗涤四次。
现在可以使用概述的方案对制剂进行照片转换或安装以进行共聚焦显微镜检查。在 DIC 光学元件下，充满 dai 的神经元间被完美地进行了照片转换。未标记的周围组织中标记细胞的空间上下文得到了很好的解析。
例如，在这种制剂中可以看到细胞体在皮层内的位置和神经丸内纤维突起的位置。染料滴有点太大了。几个相邻的细胞同时被标记，这使得很难将单个投影与不同的细胞体联系起来。
还要注意，在荧光显微镜下，如果没有照片转换，背景分辨率要低得多。该制剂中也可以注射相邻片段中的多个细胞，这是一种针对神经药丸中快速两种染料的抗体。尽管有透明的细胞体，但该制剂显示出延长光转换期的可能副作用。
与使用共聚焦光学元件标记单个细胞相比，标记强度更高的细胞往往会被过度染色并开始膨胀。携带 GFP 报告基因构建体的胚胎中的染料眼标记可以提供 GFP 阳性神经元或神经胶质细胞类型特定群体中 D 填充细胞的空间背景和身份。观看此视频后，您应该对 oph 后胚胎 CNS 中单个神经元的准备和执行标记有很好的了解。
但是在尝试此过程时，请记住，每一步都要求很高，因此请期待重复几次，直到整个过程顺利进行。
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概述
本文介绍了一种在果蝇胚胎中对中枢神经系统中的单个神经元进行标记的技术。该方法使得通过透射光或共聚焦显微镜可以分析神经元形态。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 显微技术
背景
- 理解神经元形态对神经科学研究至关重要。
- 果蝇胚胎是研究中枢神经系统发育的模式生物。
- 标记技术增强了对单个神经元的可视化。
- 共聚焦显微镜提供了详细的成像能力。
研究目的
- 开发一种标记单个神经元的可靠方法。
- 便于分析果蝇胚胎中的神经元形态。
- 在已知的GFP表达模式下实现可视化。
使用的方法
- 收集果蝇卵并发育到17期。
- 人工氯化和对齐胚胎。
- 定殖和剖析以接触神经索。
- 应用亲油染料对神经元进行标记。
主要结果
- 成功标记了中枢神经系统中的单个神经元。
- 通过显微镜实现了神经元形态的可视化。
- 结果可以与GFP表达模式进行关联。
- 该方法适用于各种遗传背景。
结论
- 该技术为研究神经元结构提供了有价值的工具。
- 增强了对果蝇中枢神经系统发育的理解。
- 在遗传和发育神经科学研究中具有潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-cell labeling in the Drosophila CNS enables high-resolution morphological analysis of individual neurons, supporting mechanistic de-risking and target validation in neurodevelopmental research. This capability is critical for early discovery teams seeking to link genetic perturbations to cellular phenotypes with predictive confidence. The method's genotype-agnostic flexibility enhances its value for portfolio-wide mutant analysis and cross-functional R&D integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of neuronal morphology at single-cell resolution for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by correlating genetic backgrounds with cellular phenotypes.
- Facilitates hypothesis testing in disease-relevant model systems.
- Allows interrogation of mutant phenotypes to clarify pathway involvement.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neuronal systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative morphological outputs for assay standardization.
- Supports colocalization with genetically encoded reporters for multiplexed readouts.
- Enables reliable evaluation of compound or genetic interventions at the single-cell level.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell morphological data with translational biomarker discovery in neurodevelopmental models.
- Provides continuity from genetic manipulation to preclinical phenotype assessment.
- Reduces risk in advancing neuroactive candidates by clarifying cellular mechanisms.
- Supports cross-species and cross-genotype comparisons for translational relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This single-cell labeling technique integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through preclinical model validation, particularly in neurobiology and developmental genetics.
- Discovery Biology: Enables precise hypothesis testing and pathway clarification by visualizing individual neuron morphology in defined genetic contexts.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible single-cell outputs for downstream phenotypic screens.
- Analytics: Generates quantitative morphological data and supports statistical comparison across genotypes or interventions.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by enabling biomarker alignment at the cellular level.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for single-cell analysis across diverse genetic backgrounds and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell labeling and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying cellular mechanisms early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroactive targets and mutant phenotypes for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, microinjection, and advanced microscopy.
- Demands precise instrumentation for micro-manipulation and confocal or DIC imaging.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility of single-cell outputs.
- Adaptable to various genotypes but may require protocol optimization for different model systems.
- Delicate procedural steps and potential for off-target labeling necessitate careful operator training.
