Name: 凋亡细胞清除过程中实时成像果蝇胚胎发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 了解果蝇胚胎中凋亡细胞清除过程的实时成像方法，利用转基因GFP标记和共聚焦显微镜技术动态观察吞噬细胞行为。该技术为细胞生物学和发育生物学研究提供了重要的活体观察手段。

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本工作由玛丽·居里回归基金（IRG249084）资助。我们感谢Kurant实验室的所有成员。我们还感谢跨学科生物成像中心的E. Suss-Toby提供的出色技术支持。

追踪凋亡细胞清除的动态过程 体内 需要标记两种细胞群体：吞噬细胞和凋亡细胞。
为了标记吞噬细胞群体，我们使用一种含有simu-cytGFP标记的Drosophila品系，该标记可特异性地标记胚胎中的吞噬细胞：巨噬细胞、胶质细胞和外胚层8。也可使用其他不同的吞噬细胞标记，包括含有血细胞特异性Gal4驱动子（crq-Gal4）或胶质细胞特异性Gal4驱动子（repo-Gal4）的品系，以及在UAS调控下的遗传编码荧光报告基因（uas-GFP）。
为了在凋亡细胞清除过程中监测凋亡细胞，我们使用不同的凋亡/吞噬标记物。Annexin V（Molecular Probes）作为凋亡细胞的早期标志物10；Phiphilux（OncoImmunin）是一种荧光原性caspase-3底物，用作较晚期的凋亡标志物；LysoTracker（Molecular Probes）则作为吞噬体的标记物。我们使用PicoPump PV 820微注射系统注入这些试剂。
1. 准备工作
<ol>
	<li>庚烷胶水： 
	将双面胶带展开，尽可能多地放入闪烁瓶中，加入庚烷，用Parafilm密封瓶口，摇动24小时。若胶水过稠，可添加庚烷稀释。</li>
	<li>我们让果蝇在预热的葡萄汁琼脂平板加酵母糊上产卵2小时，然后将平板转移至25 °C培养10–12小时（根据所需发育阶段而定），随后进行显微注射及注射后胚胎的时间序列成像记录。我们从维持在25 °C的琼脂平板上收集胚胎，从而获得发育至15或16阶段的胚胎。</li>
	<li>注射针制备： 
	制备注射针时，我们使用“Sutter instrument”拉针仪和薄壁玻璃毛细管（FHC Capillary tubing）。将拉制后的毛细管尖端敲断，使其直径达到0.5–2 μm。</li>
	<li>带胶的盖玻片： 
	用移液器吸头将一滴庚烷胶水沿盖玻片中央均匀涂抹成一条线，静置数秒使其干燥。准备多个此类盖玻片。</li>
</ol>
2. 胚胎制备
<ol>
	<li>用干净的画笔和流动水从琼脂平板上收集胚胎，并将其转移至细胞筛（SPL Life Sciences）中，筛子置于烧杯上方以收集废水。</li>
	<li>在细胞筛中用水清洗胚胎，直至完全去除酵母糊。</li>
	<li>用Kimwipes擦拭细胞筛外壁，吸干多余水分。</li>
	<li>将细胞筛放入干净的培养皿中，加入足量50%次氯酸钠溶液，完全覆盖细胞筛中的胚胎。期间轻轻搅拌2-3次，脱膜处理2分钟。</li>
	<li>用大量水冲洗胚胎，直至无明显次氯酸钠气味。</li>
	<li>将细胞筛转移至另一干净培养皿中，并加水覆盖胚胎，防止干燥。</li>
	<li>在开始胚胎固定前，将1 μl目标试剂分别加入两根显微注射针中（以防针头堵塞）。液体需约5分钟到达针尖。</li>
	<li>切取一块矩形葡萄汁琼脂，放置于显微镜载玻片上。用干净画笔将脱膜后的胚胎从培养皿转移至琼脂块表面。</li>
	<li>在荧光解剖显微镜下，使用湿润画笔挑选表达GFP标记物且发育阶段合适的胚胎，并将其依次排列在琼脂块边缘附近（图1A）。为便于成像观察胶质细胞在中枢神经系统（CNS）中的吞噬作用，胚胎应腹面朝上放置。</li>
	<li>每行排列约10个胚胎。</li>
	<li>将胚胎固定在盖玻片上，盖玻片中央预先涂有一条庚烷胶水（图1B, C）。</li>
	<li>将盖玻片放入脱水室中约5分钟（具体时间取决于室内湿度及待注射胚胎数量）。</li>
	<li>干燥后，用卤代烃油700（Sigma）覆盖胚胎，防止进一步脱水。</li>
	<li>将盖玻片放置于显微镜载玻片上，胚胎面朝上。可在载玻片上滴加一滴水以防止盖玻片移动。此时胚胎已准备好进行显微注射，通常注射位置位于胚胎中段的侧面。</li>
</ol>
3. 胚胎注射
<ol>
	<li>将针头连接到显微操作仪上。</li>
	<li>为折断针尖，将盖玻片的边缘置于视野中，并调节针头至同一焦平面。小心移动盖玻片，直至其接触针尖并将其折断。</li>
	<li>聚焦于胚胎，将针头插入油中，并确保针头形成液滴。这表明针尖已成功折断。</li>
	<li>在不触碰针头夹持器的情况下，将胚胎移至针头下方，向胚胎内注入一滴液体。随后移开胚胎，继续对下一个胚胎操作，直至所有胚胎完成注射。</li>
</ol>
4. 成像
我们在倒置共聚焦显微镜下使用40倍或100倍物镜对胚胎进行成像。选择位置良好的胚胎，其中枢神经系统位于中央，GFP表达强烈，并且在注射后能清晰标记凋亡细胞。
对于活体胚胎的延时记录，我们通常选择5或6个共聚焦切片（每个厚2 μm）。随后，我们将3个切片（总厚度6 μm）进行投影，以观察完整的细胞。
我们使用对凋亡细胞进行标记的染料，这些染料稳定性高且不易褪色。为避免GFP发生光漂白，我们以60秒的时间间隔进行成像记录。
在某些情况下，胚胎可能在视频录制期间开始滚动。因此，我们会不时查看录制画面，必要时停止并重新开始。

<ol><li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+to+die+for%3A+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm%2C+fly+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+signaling%3A+you+can+touch%2C+but+you+can%27t+eat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li>
<li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li>
<li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+CNS+clear%3A+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li>
<li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li>
<li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

凋亡细胞清除是凋亡过程的关键终末阶段，具有高度动态性。因此，对该过程进行实时研究至关重要。本文介绍了一种可在活体发育过程中监测凋亡细胞清除的实验方案。 果蝇 胚胎。在此操作中，必须使用特异性标记物标记两类细胞群体：凋亡细胞和吞噬细胞。 simu-cytGFP 报告基因适用于在同一胚胎中同时监测吞噬性巨噬细胞、胶质细胞和外胚层， w这使得同时追踪不同的吞噬细胞群体成为可能。该方法的优势在于可同时研究“专业”与“非专业”清除过程，并对过程中的特定方面（如清除速率、特异性及降解能力）进行比较。该方法的缺点是 simu-cytGFP 巨噬细胞中该标记物表达极强，而胶质细胞中表达弱得多，这在同一视频中可能难以协调。然而，可通过使用特异性Gal4驱动GFP表达，将巨噬细胞在中枢神经系统中清除凋亡细胞的过程与此过程分开成像。crq-Gal4 用于巨噬细胞和 repo-Gal4 用于胶质细胞。
用于标记凋亡细胞的不同标志物可反映特定的分子和形态学改变，对于理解细胞凋亡的动态过程及其可逆性以及...

通过凋亡及随后的吞噬作用，正确清除不需要的或异常的细胞，对于胚胎发育以及成体组织稳态至关重要。凋亡细胞的吞噬作用，即凋亡细胞清除，是一个高度动态的过程，分为四个步骤：（1）招募吞噬细胞至凋亡细胞（“找到我”信号），（2）识别该细胞为吞噬靶标（“吃掉我”信号），（3）吞噬，随后是（4）吞噬体成熟以及凋亡颗粒的降解1-5。吞噬细胞分为两类：一类是“专业性”吞噬细胞，如巨噬细胞和未成熟树突状细胞；另一类是“非专业性”组织驻留的邻近细胞，后者在多细胞动物发育过程中的凋亡细胞清除中起关键作用6,7。
在Drosophila发育过程中，多余细胞通过凋亡被清除，主要发生在三个阶段：首先是在胚胎中期至晚期，然后是在蛹中期，最后是在成虫早期。在胚胎发生期间，凋亡颗粒由“专业”吞噬细胞（如巨噬细胞）以及“非专业”外胚层和胶质细胞清除8,9。
在之前的研究中，我们鉴定出一种吞噬受体Six-microns-under（SIMU），该受体在胚胎发育期间仅在吞噬细胞中表达。利用 模拟 启动子，我们为吞噬细胞群体生成了一种特异性标记simu-cytGFP可让我们在活体发育胚胎中同时监测巨噬细胞、外胚层和神经胶质细胞8此外，通过使用针对凋亡不同阶段细胞的特异性标记物，我们能够追踪凋亡细胞清除的动态过程 体内.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Annexin V </td><td>Molecular Probes</td><td>A35108</td><td></td></tr><tr><td>PhiPhiLux G&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>OncoImmunin</td><td>A304R2G-5</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>Molecular Probes</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>毛细玻璃管</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网</td><td>SPL</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

活体成像凋亡细胞清除过程 果蝇 胚胎发生

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

通过凋亡及随后的吞噬作用（凋亡细胞清除）正确清除不需要或异常的细胞，对于所有后生动物的正常发育至关重要。凋亡细胞清除是一个高度动态的过程，与细胞死亡密切相关；在正常情况下几乎观察不到未被吞噬的凋亡细胞。 体内 在正常条件下。为了理解凋亡细胞清除的不同步骤，并比较“专业”吞噬细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）与“非专业”吞噬细胞（如组织驻留的邻近细胞）， 体内 活体成像该过程具有极高的价值。本文描述了一种用于研究活体中凋亡细胞清除的实验方案 果蝇 胚胎。为了追踪吞噬作用中不同步骤的动态过程，我们使用针对凋亡细胞和吞噬细胞的特异性标记物。此外，我们能够同时监测两种吞噬细胞系统：发育中的中枢神经系统（CNS）中的“专业性”巨噬细胞和“半专业性”胶质细胞。本文所述方法采用 果蝇 胚胎是研究凋亡细胞清除过程的优良实时模型。

图 2 展示了一段影片中的代表性画面，其中凋亡细胞用 Annexin V 标记，胶质细胞、外胚层和巨噬细胞用 simu-cytGFP 标记。图 2 中每一帧图像均为 3 个 2 μm 层切片的投影。
15期胚胎已正确放置，可见其中央为胚胎中枢神经系统（CNS），胶质细胞（g）标记清晰。主要位于CNS外的巨噬细胞（m）表现出强烈的胞质GFP表达。表皮细胞也带有胞质GFP标记（e）。在CNS内外均可见大量Annexin V阳性细胞。追踪吞噬事件并不容易。我们用一个白色矩形标出了一例事件，显示一个胶质细胞正在吞噬一个凋亡颗粒。请注意该胶质细胞的探查行为：多次接触凋亡颗粒但未立即吞噬，最终完成对Annexin V标记的凋亡细胞的吞噬（图2）。
可采用相同步骤使用针对不同凋亡阶段的其他标志物。
<img src="/fil...

本文介绍了一种研究凋亡细胞清除动态过程的有效方法 体内. 该方法采用活体 果蝇 利用凋亡细胞和吞噬细胞的特异性标记，将胚胎作为监测凋亡细胞吞噬作用的有力模型。

通过凋亡及随后的吞噬作用（凋亡细胞清除）正确清除不需要或异常的细胞，对于正常生理功能至关重要……

本实验的总体目标是观察果蝇胚胎中凋亡细胞清除的动态过程。该目标通过使用携带细胞质GFP标记的转基因果蝇实现，该标记可标记吞噬细胞群体。收集带有Simio GFP标记的胚胎，经清洗和包被处理后，将胚胎定位以进行显微注射，随后对中枢神经系统（CNS）进行实时监测。第三步是通过向胚胎注射特异性的凋亡细胞吞噬标记物（如 X in five）来标记凋亡细胞，最后一步是利用共聚焦显微镜对胚胎中枢神经系统进行延时成像记录。最终，结果可通过荧光共聚焦显微镜显示在不同阶段凋亡细胞清除过程中凋亡细胞与吞噬细胞的定位及行为。该技术相较于现有的固定胚胎免疫组织化学等方法的主要优势在于，能够动态追踪凋亡细胞清除过程。凋亡细胞清除是一个包含多种步骤的高度动态过程。该技术使我们能够利用凋亡细胞和吞噬细胞的特异性标记物来追踪各个不同步骤。本实验方案首先使用常规试剂制备胶状物：展开双面胶带，然后将其重新卷起，以适配闪烁瓶。用庚烷填充小瓶，并用封口膜密封。然后将小瓶固定在振荡器上，轻轻摇动24小时。室温下反应过夜后，将制备好的胶液转移至新的小瓶中。使用玻璃移液器将制备好的胶水转移至新文件中。制备完成后，用移液器吸头将胶水涂抹到盖玻片上。将一滴庚烷胶水沿盖玻片中央呈线状分散。让胶水干燥几秒钟。盖玻片可在室温下置于密闭盒中保存，最长可达一个月。用二氧化碳麻醉果蝇后，将约400只果蝇收集到一个容器中，并在25摄氏度下放置已预热的葡萄汁产卵板约两小时。收集葡萄汁产卵板，并用新的培养板覆盖容器，以保持果蝇的活力。收集的培养皿中含有零至两小时龄的胚胎。将带有胚胎的葡萄汁产卵培养皿放回25摄氏度的培养箱中，直至胚胎达到所需发育时间点。本示例中，胚胎在培养箱中孵育10至12小时，使其发育至第15或第16阶段。使用自来水和干净的画笔将胚胎从培养皿转移到细胞过滤筛中。将过滤筛置于容器上方，以便回收可能溢出的胚胎。冲洗收集到的胚胎，直至去除所有酵母糊。然后用擦拭滤网外侧的方法去除多余的水分。将细胞滤器放入洁净的培养皿中，加入足量的50%次氯酸钠溶液覆盖滤器中的胚胎，静置两分钟，并在此期间搅拌两到三次以去除卵膜。接下来，用清水冲洗胚胎，直至不再有漂白剂气味。将装有胚胎的细胞容器放入干净的培养皿中，并加水覆盖，防止胚胎干燥。用于注射胚胎。使用拉针仪和薄壁玻璃毛细管预先制备注射针。将一微升所需试剂装入两根注射针中，其中一根作为备用。应选用不易淬灭的稳定标记物，例如五分之叉（X in five），作为合适的试剂。现在将一块矩形的葡萄汁琼脂放置在显微镜载物台上，将胚胎从滤网转移到琼脂上。在荧光解剖显微镜下，使用洁净的毛笔根据 GFP 标记筛选出处于合适发育阶段的胚胎用于注射。用湿润的画笔将选定的胚胎移至一行，共10个，腹面朝上。将该行置于琼脂块边缘。可在胚胎的中枢神经系统中观察到绿色荧光蛋白（GFP）。现在用一条正庚烷胶带将

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凋亡细胞清除过程中实时成像<em&gt;果蝇</em&gt;胚胎发育

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