使用连接介导的 PCR 鉴定实体瘤中 Sleeping Beauty 转座子插入位点

本实验方案展示了如何通过定位驱动小鼠肿瘤形成的转座子插入位点，来鉴定新的癌基因和肿瘤抑制基因。首先，从转基因小鼠模型中诱导并获取肿瘤组织。随后的步骤包括分离肿瘤DNA、进行连接介导的PCR扩增，然后对扩增后的DNA样本进行测序，并分析转座子插入位点。

最终，该实验流程可鉴定出候选的肿瘤驱动基因。利用连接介导的PCR结合基于睡美人转座子的无偏倚遗传筛选方法，其主要优势在于我们能够轻松鉴定出新的癌症遗传驱动因子。开始解剖时，应首先用70%乙醇喷洒已处死小鼠的体表。

收集的组织和肿瘤应分为四个部分，每部分大小为 50 至 100 毫克。取其中一部分用 10% 缓冲福尔马林固定 18 小时，随后转入 70% 乙醇。该部分可用于苏木精和伊红染色及/或免疫组织化学。

用液氮速冻剩余的组织样本。这些样本可存于冷冻箱中，用于后续的DNA-RNA和蛋白质分离，以从冷冻的肿瘤组织中提取DNA。首先用剃刀片将组织精细切碎。

接下来，在1.5毫升离心管中加入1毫升细胞裂解缓冲液和5微升20毫克/毫升的蛋白酶K溶液，对组织进行消化，充分涡旋混匀，然后按照标准的异丙醇法DNA提取步骤进行操作。本方案首先在1.5毫升离心管中退火连接子。

将每种连接溶液的 50 微升与 2 微升浓氯化钠混合。然后将试管放入 95 °C 的加热块中。5 分钟后，关闭加热，使其缓慢冷却至室温，冷却后可能需要一小时或更长时间才能达到室温。

肛门连接物可保存在冷冻箱中，直至需要时使用。准备两个96孔板，将每个样本的1微克DNA分别转移到两个96孔板的对应孔中。例如，将样本1的1微克DNA加入两个96孔板的A1孔中。

将其中一个96孔板中的DNA用右侧酶NLAⅢ进行消化，同时用左侧酶BFAⅠ消化另一个96孔板中的DNA样品。在37摄氏度下孵育过夜以完成DNA消化。第二天，通过加热使酶失活20分钟，以结束消化反应。

现在使用 MiniLoot 96 孔板对消化反应进行纯化。使用多通道移液器，将每个样品转移至 MiniLoot 96 孔板中。

将迷你96孔板放入真空抽滤装置中。对板施加真空，直至孔中看起来干燥。通常为15分钟。在整个方案中均如此操作。

必须格外注意，避免样品受到污染。在使用96孔板时，应尽可能用盖子盖住孔板，并避免将移液器穿过敞口的孔上方，因为任何一滴外来液滴都可能破坏样品。从真空抽滤装置上取下微型孔板后，用纸巾堵住孔板底部，直至其完全干燥。

向每个孔中加入 30 µL 双蒸水，重悬迷你板（96 孔板）中的 DNA。将迷你板置于摇床上，调至高速，振荡 2 分钟。

接下来，将微型捕获板中的内容物转移至一个洁净的96孔板中，以进行接头连接反应。通过在试剂储液槽中混合足量的连接缓冲液、步骤3.2中制备的磷酸化接头、T4 DNA连接酶和水，配制连接反应体系。

使用多通道移液器将上一步骤中消化的 DNA 各 10 微升转移至新的 96 孔板中。然后使用多通道移液器将 10 微升连接反应液加入到 96 孔板的所有孔中。至此，所有孔均已加入 DNA 和连接反应试剂。

将培养板在16摄氏度下孵育4小时至过夜。次日早晨，于65摄氏度下灭活T4连接酶10分钟以终止连接反应。

与之前相同，使用小型离心柱板和真空 manifold 装置纯化连接反应产物，干燥板材后，将板底部用吸水纸 blot 至完全干燥。将 DNA 重悬于 30 µL 双蒸水中。置于摇床孵育 2 分钟，随后将小型离心柱板中的内容物转移至新的洁净板中。

接下来，使用 BamH I 进行第二次 DNA 消化，以破坏残留的串联转座子。在 37 摄氏度下消化 DNA 3 至 6 小时或过夜，然后使用 Mini Elute 试剂盒按照此前相同的步骤进行纯化。使用针对转座子的特异性引物和针对接头的特异性引物进行 30 个循环的 PCR 扩增。

反应体系应包含三微升带有接头的已消化 DNA。接着，使用 mini loot、96 孔板和真空 manifold 按照之前的方法对 PCR 反应进行纯化。

将 DNA 重悬于 30 微升水中，并将悬液转移至洁净的 96 孔板中。取 2 微升 PCR 反应产物加入到 148 微升双蒸水中进行稀释，随后仅使用 2 微升稀释后的产物。采用引物的巢式版本，在 100 微升反应体系中进行 30 个循环的 PCR 扩增。

这些引物适用于Illumina GA two X仪器。每个样本在PCR扩增中将具有独特的12个碱基对条形码，取每种产物45 µL在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上电泳。应可见PCR产物的弥散条带，代表肿瘤中多种不同转座子插入的扩增子。

使用先前所述的真空洗涤法对剩余的50微升PCR产物进行纯化，然后将DNA重悬于50微升水中，并再次进行真空洗涤。接着，将DNA重悬于30微升TE缓冲液中，转移至洁净的96孔板。测定每个样品中DNA的浓度。

然后将每个样本的等量DNA合并到一个试管中。只要每个样本在建库过程中使用了不同的带条形码的引物，便可以在一次Illumina测序运行的单个泳道中对数百个DNA样本进行测序。成功的L-M-P-C-R应在对一半的二次PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，在单个肿瘤中扩增出数百个转座子插入片段，此时DNA涂抹状条带即代表该扩增结果。

如果 LM-PCR 不成功，则不会出现 DNA 弥散条带，而是会看到明确的 DNA 条带。在 Illumina GA IIx 平台上，单个泳道对一至 200 个肿瘤进行测序，应产生超过 3000 万条、每条 100 个碱基对的序列。在进行该操作时，务必牢记要缓慢而仔细地操作，以确保不发生污染。

可以对新发现的癌症遗传驱动因素进行分析，以回答更多问题，例如，这些驱动因素中哪些可作为治疗靶点？