Name: 鉴定睡美人转座子插入连接器介导的PCR实体瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学习使用睡美人转座子插入和连接子介导PCR技术鉴定小鼠实体瘤中的新型致癌基因和抑癌基因。该方法通过无偏遗传筛选有效发现肿瘤驱动基因，为癌症机制研究提供重要工具。

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作者谨此感谢明尼苏达大学的 Branden Moriarity、David Largaespada 和 Vincent Keng，以及爱荷华大学的 Adam Dupuy，他们在上述实验方案的开发过程中提供了帮助。

1. 转基因动物的繁育与老化
<ol>
 <li>选择适合实验的转基因小鼠品系。典型的实验将使用三个转基因品系：条件性转座酶小鼠、携带串联排列转座子的小鼠，以及在目标癌症起源细胞中表达Cre 重组酶的小鼠。如果所建模的癌症在大部分患者中具有已知的突变，则可在起始阶段引入该突变。此类“易感性”突变的示例包括激活型 Kras、显性失活型Tp53或 floxed Pten等位基因。通过加入易感性突变，模型可能更接近人类癌症的真实情况（见1.3）。多种Sleeping Beauty转座酶和转座子小鼠可从美国国家癌症研究所小鼠资源库获取（<a href="http://mouse.ncifcrf.gov/" target="_blank">http://mouse.ncifcrf.gov/</a>）。</li>
 <li>将条件性转座酶小鼠与携带转座子的小鼠杂交，尽可能最终获得对两个等位基因均为纯合的小鼠。再将纯合子后代与表达Cre 重组酶的小鼠杂交，以生成三重转基因实验小鼠（图2）。注意：获得纯合小鼠并不总是可行或理想。例如，p53 显性失活纯合小鼠的繁殖难度远高于杂合小鼠。此外，建议确认后代符合孟德尔遗传规律，以验证杂交方案的成功。</li>
 <li>若使用易感性遗传背景，首先将携带转座酶的小鼠与携带易感性等位基因的小鼠杂交。同时，将表达Cre 重组酶的小鼠与携带转座子的小鼠杂交。尽可能分别获得各等位基因的纯合小鼠。最后，将前两组杂交所得的纯合子后代进行杂交，以生成四重转基因实验动物。</li>
 <li>除实验动物外，还需建立对照组小鼠群体。对照组通常由实验杂交过程中产生的同窝仔鼠组成，仅继承三个等位基因中的两个（图2）。在易感性背景下，还需包括四个等位基因中携带其中三个的小鼠。</li>
 <li>每日监测实验组和对照组小鼠的肿瘤发生情况和/或濒死状态。遵循所在机构动物护理与使用委员会（IACUC）规定的动物饲养要求。此外，通常需设定一个终点年龄，即若动物尚未濒死也需在此年龄实施安乐死。18个月是小鼠实施安乐死的常见年龄。</li>
</ol>
2. 转基因动物的尸检
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>试剂名称</td>
 <td>公司</td>
 <td>货号</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
 <td>Brain Tree Scientific</td>
 <td>EZ-177</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cryovial</td>
 <td>Bioexpress</td>
 <td>C-3355-2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Buffered Formalin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>HT501128-4L</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 所需试剂。
<ol>
 <li>当小鼠处于濒死状态或已达到预定的寿命终点时，根据本单位动物护理与使用委员会（IACUC）的指导原则，使用CO2安乐死装置对动物实施安乐死。通常将动物放入洁净的气体室，打开气罐并调节减压阀，使其压力读数不超过每平方英寸5磅。缓慢充入气体以减少对鼻腔和眼部的刺激，并降低小鼠对CO2的厌恶反应。确保动物心脏已停止跳动，且触碰眼球时无任何反应。</li>
 <li>用70%乙醇喷洒已处死小鼠的体表。</li>
 <li>将小鼠置于解剖板上，并用解剖针固定。使用剪刀和镊子打开小鼠体腔并取出器官。需采集的器官取决于具体研究项目。但建议始终采集脾脏和肝脏，因为这些器官常能提供小鼠濒死原因的重要线索。同时采集胸骨，以便后续进行骨髓分析。此外，应尽可能采集任何外观异常的器官或组织。</li>
 <li>所采集的组织和肿瘤应分为四个部分。其中一部分固定于10%中性缓冲福尔马林溶液中18小时，随后转移至70%乙醇中保存。该部分可用于苏木精-伊红（H&amp;E）染色和/或免疫组化（IHC）分析。其余三部分通常每块重50至100 mg，应迅速置于液氮中冷冻。这些样本可用于DNA、RNA和蛋白质的提取。</li>
 <li>根据IACUC的指导原则妥善处理尸体及剩余组织。</li>
</ol>
3. 从肿瘤中分离基因组DNA
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>试剂名称</td>
 <td>公司</td>
 <td>目录编号</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein Precipitation solution</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>158910</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell lysis buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>158906</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>158920</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase A</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>158924</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE Buffer</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V6232</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表2. 所需试剂。
<ol>
 <li>使用干净的剃刀将冷冻的肿瘤样本（50 至 100 mg）精细切碎。</li>
 <li>将切碎的组织放入一个 1.5 ml 微量离心管中，并加入含有 5 μl 蛋白酶 K 溶液（20 mg/ml）的 1 ml 细胞裂解缓冲液。</li>
 <li>充分涡旋振荡。</li>
 <li>在 55 °C、250 rpm 的摇床中孵育至少 4 小时，最好过夜。</li>
 <li>加入 1 μl 核糖核酸酶 A 溶液（10 mg/ml），并将管子颠倒混合 25 次。</li>
 <li>在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
 <li>将管子置于冰上 3 分钟，冷却至室温。</li>
 <li>加入 333 μl 蛋白质沉淀溶液，并剧烈涡旋振荡。</li>
 <li>在 14,000 rpm 下离心 10 分钟。蛋白质应形成沉淀。如果沉淀非常小，再次涡旋振荡，冰上孵育 5 分钟，然后重新离心。</li>
 <li>将含有 DNA 的上清液倒入一个干净的 15 ml 离心管中。</li>
 <li>加入等体积的 100% 异丙醇，通过轻轻颠倒混合 50 次。</li>
 <li>在 3,500 rpm 下离心 3 分钟。</li>
 <li>弃去上清液。</li>
 <li>加入 1 ml 70% 乙醇，反复颠倒管子以洗涤沉淀。</li>
 <li>将洗涤后的沉淀连同乙醇一起转移至一个 1.5 ml 微量离心管中。</li>
 <li>在 4 °C 下以 14,000 rpm 离心 5 分钟。</li>
 <li>倒出乙醇，将管子倒置以空气干燥（约 5 至 30 分钟）。</li>
 <li>根据 DNA 沉淀的大小，用 50 至 500 μl TE 缓冲液重悬 DNA 沉淀。</li>
 <li>可选：在 37 °C 下孵育以促进 DNA 溶解。</li>
 <li>短期储存于 4 °C，长期储存则置于 -20 °C。</li>
</ol>
4. 使用肿瘤基因组DNA进行连接子介导的PCR
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>试剂名称</td>
 <td>公司</td>
 <td>货号</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BfaI</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>R0568S</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NlaIII</td>
 <td>新英格兰生物实验室</td>
 <td>R0125S</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MinElute 96孔板</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28051</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96 真空抽滤装置</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-MicroPlate Genie，120V</td>
 <td>Scientific Industries, Inc.</td>
 <td>SI-4000</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA连接酶与5倍连接缓冲液</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15224-041</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BamHI</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>R0136S</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 mM dNTPs</td>
 <td>Bioexpress</td>
 <td>C-5014-200</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum Taq</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>10966-034</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FastStart Taq DNA 聚合酶</td>
 <td>罗氏</td>
 <td>12032929001</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>琼脂糖</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3121</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAE 缓冲液</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V4271</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE缓冲液</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V6232</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>溴化乙锭</td>
 <td>Promega</td>
 <td>H5041</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表3. 所需试剂。
连接序列
BfaI 接头 + 5' GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3'
BfaI 接头- 5' 磷酸-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3'NH2
NlaIII 接头+ 5'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG 3'
NlaIII 接头- 5' 磷酸-GTCCCTTAAGCGGAGCC 3'
引物序列
第一轮 PCR 正向引物右侧（NlaIII）：Spl IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCC
第一轮 PCR 正向引物左侧（BfaI）：Spl IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC
左右两侧的初级PCR反向引物：Spl Link1 1 GTAATACGACTCACTATAGGGC
第二轮 PCR 正向右侧引物：Illumina 带条形码的第二轮引物示例 5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttcaa（其中 N 代表 12 bp 的条形码，大写序列为 Illumina 平台所需，小写序列将与转座子结合）。
第二轮 PCR 正向左侧引物：Illumina 带条形码的第二轮引物示例 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAgtgtatgtaaacttccgacttcaa（N 代表 12 个碱基的条形码，大写字母序列为 Illumina 平台所必需，小写字母序列将与转座子结合）。
左右两侧的二次PCR反向扩增：接头嵌套反向引物 5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC
<ol>
 <li>将BfaI接头和NlaII接头的+和-链分别进行退火处理：在1.5 ml微量离心管中，混合50 μl接头+（100 μM）与50 μl接头-（100 μM），并加入2 μl NaCl（5 M）。置于95 °C金属浴中加热5分钟，随后关闭加热块，让混合物缓慢冷却至室温（此过程需一小时或更长时间）。退火完成后，可将接头产物储存于-20 °C冰箱中备用。</li>
 <li>准备两份肿瘤DNA样品，每份含1 μg DNA。其中一份将用限制性内切酶消化，该酶切割位点靠近转座子的“右侧”末端；另一份则使用切割位点靠近转座子“左侧”末端的限制性内切酶。此步骤旨在最大化扩增所有转座子插入位点的可能性。</li>
 <li>使用“右侧”酶NlaII消化一份肿瘤DNA，使用“左侧”酶BfaI消化另一份：分别加入1 μl酶、5 μl 10x NEB Buffer #4、1 μg DNA，并用ddH2O补足至总体积50 μl。在37 °C水浴或培养箱中过夜消化。</li>
 <li>热失活酶活性（BfaI：80 °C处理20分钟；NlaIII：65 °C处理20分钟）。</li>
 <li>通过将样品加入MinElute 96孔板，再将板置于真空装置中抽真空约15分钟，直至孔内干燥，以纯化已消化的样品。</li>
 <li>从真空装置中取出96孔板，用纸巾轻拍板底以彻底去除残留液体。</li>
 <li>向每孔加入30 μl ddH2O，在高速振荡器上震荡2分钟，或用移液器反复吹打20至40次，以充分重悬DNA。</li>
 <li>将MinElute 96孔板中全部体积（30 μl）转移至新的洁净96孔板中。</li>
 <li>使用第4.8步获得的已消化DNA和第4.1步制备的接头进行接头连接反应：混合10 μl已消化DNA、4 μl 5x连接缓冲液、5.5 μl退火后的接头（950 μg/μl）、0.5 μl T4 DNA连接酶（5 U/μl）。</li>
 <li>在16 °C孵育4小时至过夜。</li>
 <li>在65 °C加热10分钟以失活T4 DNA连接酶。</li>
 <li>使用MinElute 96孔板和真空装置，按照第4.5–4.6步所述方法纯化连接产物。</li>
 <li>用30 μl H2O重悬DNA，并转移至洁净的96孔板中。</li>
 <li>进行第二次DNA消化，以消除残留的串联转座子结构。该步骤通过再次使用一种能切割用于构建含转座子串联体转基因小鼠所用质粒载体DNA的酶来实现。</li>
 <li>使用BamHI对左右两侧DNA进行消化：混合25 μl第4.13步获得的接头连接DNA、5 μl 10x NEB Buffer #3、0.5 μl BamHI（20 U/μl）、0.5 μl BSA（10 mg/ml）以及19 μl ddH2O。</li>
 <li>在37 °C消化3–6小时或过夜。</li>
 <li>使用特异性针对转座子的引物和特异性针对接头的引物进行第一轮PCR扩增。所用引物因使用的转座子和接头类型而异。上述引物表中列出的引物适用于T2/Onc和T2/Onc2转座子。</li>
 <li>第一轮PCR体系：5 μl 10x缓冲液、2.0 μl MgCl2（50 mM）、4 μl dNTPs（2.5 nM）、1 μl 引物1（20 μM）、1 μl 引物2（20 μM）、0.25 μl Platinum Taq（5 U/μl）、3 μl 带接头的已消化DNA（用量可调整），并用ddH2O补足至50 μl。</li>
 <li>PCR程序：94 °C预变性5分钟；进行30个循环（94 °C变性30秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸90秒）；最后72 °C延伸5分钟。</li>
 <li>使用MinElute 96孔板和真空装置，如上所述纯化PCR产物。</li>
 <li>用30 μl H2O重悬DNA，并转移至洁净的96孔板中。</li>
 <li>将第4.21步所得DNA进行1:75稀释：取2 μl DNA加入148 μl ddH2O中。</li>
 <li>使用巢式引物进行第二轮PCR扩增，这些引物还包含Illumina GAIIx测序仪所需的序列以及每个肿瘤样本特有的12个碱基条形码（参见上述引物表中的引物示例）。</li>
 <li>第二轮PCR体系：10 μl 10x Buffer（含MgCl2）、8 μl dNTPs（2.5 mM）、1 μl Illumina条形码二级引物（20 μM）、1 μl Illumina Nest 1二级引物（20 μM）、0.25 μl FastStart Taq（5 U/μl）、2 μl经1:75稀释的第一轮PCR产物DNA，并用ddH2O补足至100 μl。</li>
 <li>PCR程序：94 °C预变性2分钟；进行30个循环（94 °C变性30秒，53 °C退火45秒，72 °C延伸90秒）；最后72 °C延伸5分钟。</li>
 <li>取45 μl该PCR产物在含溴化乙锭（0.5 μg/ml）的1%琼脂糖凝胶上电泳。应观察到代表肿瘤中多个不同转座子插入位点扩增产物的“弥散条带”（图3）。</li>
 <li>使用MinElute 96孔板和真空装置，如上所述对剩余的50 μl PCR产物进行纯化。加入50 μl ddH2O洗涤一次，再次抽真空。</li>
 <li>用30 μl TE缓冲液重悬DNA，并转移至洁净的96孔板中。</li>
 <li>测定各样品中DNA浓度。将等量DNA混合于一个1.5 ml微量离心管中，形成用于Illumina HiSeq 2000测序仪单通道测序的文库。一次Illumina测序运行的单通道中可同时测序数百个肿瘤样本。</li>
 <li>提交含有所有肿瘤等量DNA的单管用于测序。此步骤可由所在机构或商业测序服务完成。</li>
</ol>
5. 转座子插入分析
<ol>
 <li>用于分析转座子插入数据的软件可通过 SourceForge 免费下载（<a href="http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/" target="_blank">http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/</a>）。该程序名为 TapDance，需要来自 Illumina 平台的序列文件以及条形码到文库的映射文本文件。</li>
</ol>

<ol><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61, 759-767 (1990).</li>
<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscapes+of+Human+Breast+and+Colorectal+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+Transposon+from+Fish%2C+and+Its+Transposition+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Starr, T. K., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon.</a> Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).</li>
<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Footprinting+of+a+Muscle+Specific+Enhancer+by+Ligation+Mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
<li>Bergemann, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+finding+common+insertion+sites+and+co-occurring+common+insertion+sites+in+transposon-+and+virus-based+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens.</a> Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+transposons+for+cancer+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Harnessing transposons for cancer gene discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).</li>
<li>Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+solid+tumours+using+transposon-based+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse.</a> Nature. 436, 272-276 (2005).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323, 1747-1750 (2009).</li>
<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+transposon-based+insertional+mutagenesis+screen+for+genes+associated+with+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 27, 264-274 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+mutagenesis+using+a+highly+mobile+somatic+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system.</a> Nature. 436, 221-226 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

利用 Sleeping Beauty 转座子系统进行正向遗传筛选，可提供一种识别致癌突变的方法。通过选择适当的启动子以调控 Cre 重组酶，并结合任何易感突变，SB 筛选能够鉴定已知及新的候选癌症基因。
SB 筛选的成功在很大程度上取决于用于构建筛选体系的小鼠品系。对于转座子，我们建议使用两种不同的小鼠品系，其基因组中分别在不同染色体上携带致癌转座子的串联重复序列7。在选择可激活 SB 转座酶的组织特异性 Cre 重组酶 时，应谨慎考虑。必须有证据表明 Cre 酶在所研究癌症的疑似起源细胞类型中具有活性。成功的实例包括 Villin-Cre（胃肠道癌症）、Albumin-Cre（肝细胞癌）和 Aid-Cre（淋巴瘤）8–10。
成功进行筛选所需的小鼠数量取决于肿瘤外显率。通常，肿瘤数量越多，小鼠数量越多，筛选结果就越可靠。为了检测到癌症发生潜伏期的2倍差异，对照组和实验组中均应至少包含60只动物。11...

<table><tbody><tr><td>Sure-Seal 诱导室</td><td>Brain Tree Scientific</td><td>EZ-177</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Bioexpress</td><td>C-3355-2</td><td></td></tr><tr><td>10% 缓冲福尔马林</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质沉淀溶液</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>158906</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Qiagen</td><td>158920</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液</td><td>Promega</td><td>V6232</td><td></td></tr><tr><td>BfaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0568S</td><td></td></tr><tr><td>NlaIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0125S</td><td></td></tr><tr><td>MinElute 96 孔板</td><td>Qiagen</td><td>28051</td><td></td></tr><tr><td>QIAvac 96 真空抽滤装置</td><td>Qiagen</td><td>19504</td><td></td></tr><tr><td>Multi-MicroPlate Genie，120V</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-4000</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶（含 5× 连接缓冲液）</td><td>Invitrogen</td><td>15224-041</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>25 mM dNTPs</td><td>Bioexpress</td><td>C-5014-200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq</td><td>Invitrogen</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA 聚合酶</td><td>Roche</td><td>12032929001</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>TAE 缓冲液</td><td>Promega</td><td>V4271</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液</td><td>Promega</td><td>V6232</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Promega</td><td>H5041</td><td></td></tr></tbody></table>

使用连接介导的 pcr 鉴定实体瘤中 sleeping beauty 转座子插入位点

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

对人类肿瘤的基因组、蛋白质组、转录组和表观基因组分析表明，与配对的正常组织相比，每种癌症基因组中均存在数千个异常。这些分析结果明确显示，仍有许多尚未发现的癌症遗传驱动因子1。然而，这些驱动因子隐藏在基因组中数量更为庞大的乘客突变背景之中，这些乘客突变并不直接促进肿瘤的形成。癌症基因组的另一个特征是，在相似的肿瘤类型中存在显著的遗传异质性。每个肿瘤可能携带不同的突变，从而为肿瘤形成提供选择性优势2。在小鼠中进行无偏倚的正向遗传筛选，可提供生成肿瘤并分析其遗传组成的方法，同时减少乘客突变的背景干扰。其中一种方法是使用 Sleeping Beauty（SB）转座子系统3。SB 系统利用可由转座酶催化插入基因组各处的可移动载体（转座子）。通过使用一种由 Cre 重组酶 激活的条件性转座酶等位基因，可将突变限制在特定细胞类型中。目前已存在多种在特定组织中表达 Cre 重组酶 的小鼠品系。通过将其中一种品系与条件性转座酶等位基因（例如 Lox-stop-Lox-SB11）杂交，SB 系统仅在表达 Cre 重组酶 的细胞中被激活。Cre 重组酶 将切除阻断转座酶等位基因表达的终止盒，从而在指定的细胞类型中启动转座子诱变。SB 筛选通过繁育三种转基因小鼠品系启动，使实验小鼠同时携带条件性转座酶等位基因、转座子串联体以及组织特异性 Cre 重组酶 等位基因。让这些小鼠自然衰老直至肿瘤形成并进入濒死状态。随后对小鼠进行解剖，并从肿瘤组织中分离基因组 DNA。接下来，对基因组 DNA 进行连接介导的 PCR（LM-PCR），以扩增包含 SB 转座子的基因组位点。对单个肿瘤进行 LM-PCR 可产生数百个不同的扩增子，代表该肿瘤中数百个含有转座子插入的基因组位点4。分析所有肿瘤中的转座子插入位点，并采用适当的统计方法识别共同插入位点（CISs）5。位于 CIS 内的基因极有可能是癌基因或肿瘤抑制基因，被视为候选癌症基因。使用 SB 系统识别候选癌症基因的优势包括：1）由于转座子序列已知，可轻松定位其在基因组中的位置；2）转座可靶向几乎任何细胞类型；3）转座子能够诱导功能获得性和功能缺失性突变6。以下方案描述了如何设计并实施基于 SB 转座子系统的正向遗传筛选，以鉴定候选癌症基因（图 1）。

建立繁育方案后，繁育鼠应每19-21天生产一窝。每窝产仔数通常为5至12只幼鼠，具体数量取决于繁育鼠的年龄和遗传背景。此外，应确保每窝幼鼠的基因型符合孟德尔遗传规律，以此验证繁育方案的正确性和成功性。
为了确保实验成功，实验组动物的肿瘤发生率应显著高于对照组动物。如果实验中未引入“易感”突变，则对照组动物中应出现极少甚至没有肿瘤。如果实验中包含了“易感”突变，则这些动物的肿瘤发生率应远低于同时携带该突变和SB活性的动物。 
LM-PCR 应能在单个肿瘤中扩增出数百个转座子插入片段。将二次 PCR 产物的一半在 1% 琼脂糖凝胶上电泳后，应出现代表此类扩增的 DNA “涂布”条带（图 3）。如果仅出现一或两条条带，则表明睡美人转座子（SB）在肿瘤中未发挥作用，或实验操作过程中存在错误（图 4）。
在Illumina GAIIx平台的一个通道中对一至两百个肿瘤样本进行测序，应产生超过3000万条长度为100 ...

介绍了一种使用无偏方法识别致癌未知驱动因素的技术。该方法利用 Sleeping Beauty 转座子作为靶向特定组织的随机诱变工具。通过对驱动肿瘤形成的转座子插入位点进行基因组定位，可鉴定出新的癌基因和肿瘤抑制基因

使用连接介导的 PCR 鉴定实体瘤中 Sleeping Beauty 转座子插入位点

人类肿瘤的基因组、蛋白质组、转录组和表观基因组分析表明，每种癌症基因组中均存在数千种异常……

本实验方案展示了如何通过定位驱动小鼠肿瘤形成的转座子插入位点，来鉴定新的癌基因和肿瘤抑制基因。首先，从转基因小鼠模型中诱导并获取肿瘤组织。随后的步骤包括分离肿瘤DNA、进行连接介导的PCR扩增，然后对扩增后的DNA样本进行测序，并分析转座子插入位点。最终，该实验流程可鉴定出候选的肿瘤驱动基因。利用连接介导的PCR结合基于睡美人转座子的无偏倚遗传筛选方法，其主要优势在于我们能够轻松鉴定出新的癌症遗传驱动因子。开始解剖时，应首先用70%乙醇喷洒已处死小鼠的体表。收集的组织和肿瘤应分为四个部分，每部分大小为 50 至 100 毫克。取其中一部分用 10% 缓冲福尔马林固定 18 小时，随后转入 70% 乙醇。该部分可用于苏木精和伊红染色及/或免疫组织化学。用液氮速冻剩余的组织样本。这些样本可存于冷冻箱中，用于后续的DNA-RNA和蛋白质分离，以从冷冻的肿瘤组织中提取DNA。首先用剃刀片将组织精细切碎。接下来，在1.5毫升离心管中加入1毫升细胞裂解缓冲液和5微升20毫克/毫升的蛋白酶K溶液，对组织进行消化，充分涡旋混匀，然后按照标准的异丙醇法DNA提取步骤进行操作。本方案首先在1.5毫升离心管中退火连接子。将每种连接溶液的 50 微升与 2 微升浓氯化钠混合。然后将试管放入 95 °C 的加热块中。5 分钟后，关闭加热，使其缓慢冷却至室温，冷却后可能需要一小时或更长时间才能达到室温。肛门连接物可保存在冷冻箱中，直至需要时使用。准备两个96孔板，将每个样本的1微克DNA分别转移到两个96孔板的对应孔中。例如，将样本1的1微克DNA加入两个96孔板的A1孔中。将其中一个96孔板中的DNA用右侧酶NLAⅢ进行消化，同时用左侧酶BFAⅠ消化另一个96孔板中的DNA样品。在37摄氏度下孵育过夜以完成DNA消化。第二天，通过加热使酶失活20分钟，以结束消化反应。现在使用 MiniLoot 96 孔板对消化反应进行纯化。使用多通道移液器，将每个样品转移至 MiniLoot 96 孔板中。将迷你96孔板放入真空抽滤装置中。对板施加真空，直至孔中看起来干燥。通常为15分钟。在整个方案中均如此操作。必须格外注意，避免样品受到污染。在使用96孔板时，应尽可能用盖子盖住孔板，并避免将移液器穿过敞口的孔上方，因为任何一滴外来液滴都可能破坏样品。从真空抽滤装置上取下微型孔板后，用纸巾堵住孔板底部，直至其完全干燥。向每个孔中加入 30 µL 双蒸水，重悬迷你板（96 孔板）中的 DNA。将迷你板置于摇床上，调至高速，振荡 2 分钟。接下来，将微型捕获板中的内容物转移至一个洁净的96孔板中，以进行接头连接反应。通过在试剂储液槽中混合足量的连接缓冲液、步骤3.2中制备的磷酸化接头、T4 DNA连接酶和水，配制连接反应体系。使用多通道移液器将上一步骤中消化的 DNA 各 10 微升转移至新的 96 孔板中。然后使用多通道移液器将 10 微升连接反应液加入到 96 孔板的所有孔中。至此，所有孔均已加入 DNA 和连接反应试剂。将培养板在16摄氏度下孵育4小时至过夜。次日早晨，于65摄氏度下灭活T4连接酶10分钟以终止连接反应。与之前相同，使用小型离心柱板和真空 manifold 装置纯化连接反应产物，干燥板材后，将板底部用吸水纸 blot 至完全干燥。将 DNA 重悬于 30 µL 双蒸水中。置于摇床孵育 2 分钟，随后将小型离心柱板中的内容物转移至新的洁净板中。接下来，使用 BamH I 进行第二次 DNA 消化，以破坏残留的串联转座子。在 37 摄氏度下消化 DNA 3 至 6 小时或过夜，然后使用 Mini Elute 试剂盒按照此前相同的步骤进行纯化。使用针对转座子的特异性引物和针对接头的特异性引物进行 30 个循环的 PCR 扩增。反应体系应包含三微升带有接头的已消化 DNA。接着，使用 mini loot、96 孔板和真空 manifold 按照之前的方法对 PCR 反应进行纯化。将 DNA 重悬于 30 微升水中，并将悬液转移至洁净的 96 孔板中。取 2 微升 PCR 反应产物加入到 148 微升双蒸水中进行稀释，随后仅使用 2 微升稀释后的产物。采用引物的巢式版本，在 100 微升反应体系中进行 30 个循环的 PCR 扩增。这些引物适用于Illumina GA two X仪器。每个样本在PCR扩增中将具有独特的12个碱基对条形码，取每种产物45 µL在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上电泳。应可见PCR产物的弥散条带，代表肿瘤中多种不同转座子插入的扩增子。使用先前所述的真空洗涤法对剩余的50微升PCR产物进行纯化，然后将DNA重悬于50微升水中，并再次进行真空洗涤。接着，将DNA重悬于30微升TE缓冲液中，转移至洁净的96孔板。测定每个样品中DNA的浓度。然后将每个样本的等量DNA合并到一个试管中。只要每个样本在建库过程中使用了不同的带条形码的引物，便可以在一次Illumina测序运行的单个泳道中对数百个DNA样本进行测序。成功的L-M-P-C-R应在对一半的二次PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，在单个肿瘤中扩增出数百个转座子插入片段，此时DNA涂抹状条带即代表该扩增结果。如果 LM-PCR 不成功，则不会出现 DNA 弥散条带，而是会看到明确的 DNA 条带。在 Illumina GA IIx 平台上，单个泳道对一至 200 个肿瘤进行测序，应产生超过 3000 万条、每条 100 个碱基对的序列。在进行该操作时，务必牢记要缓慢而仔细地操作，以确保不发生污染。可以对新发现的癌症遗传驱动因素进行分析，以回答更多问题，例如，这些驱动因素中哪些可作为治疗靶点？

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医学

鉴定<em&gt;睡美人</em&gt;转座子插入连接器介导的PCR实体瘤

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