鉴定睡美人转座子插入连接器介导的PCR实体瘤

该程序展示了如何通过定位驱动肿瘤形成的小鼠插入点的转座来识别新的癌基因和肿瘤抑制基因。这是通过首先从转基因小鼠模型中生成和收获肿瘤来实现的。该程序的下一步是分离肿瘤 DNA，进行接头介导的 PCR，然后对扩增的 DNA 样品进行测序并分析插入时的转座。

最终，该程序确定了候选肿瘤驱动基因。使用接头介导的 PCR 与使用睡美人转座子进行无偏倚的遗传筛选相结合的主要优点是，我们可以轻松识别癌症的新遗传驱动因素。始终通过用 70% 乙醇喷洒处死小鼠的外部来开始解剖。

收集的组织和肿瘤应分为四个部分，大小为 50 至 100 毫克。将一段在 10% 缓冲的福尔辛中固定 18 小时，然后加入 70% 乙醇。该切片可用于 h 和 e 染色和/或免疫组织化学。

将剩余部分在液氮中快速冷冻。这些可以储存在冰箱中，用于 D-N-A-R-N-A 和蛋白质分离，以从冷冻肿瘤样本中收集 DNA。首先用剃须刀片将组织切碎。

接下来，在 1.5 毫升试管中加入 1 毫升细胞裂解缓冲液，以及 5 微升（每毫升 20 毫克）消化组织。蛋白酶 K 溶液彻底涡旋混合物，然后进行基于标准异丙醇的 DNA 提取。通过在 1.5 毫升试管中对接头进行退火来开始此协议。

将 50 μL 的每种接头溶液与 2 μL 的浓氯化钠混合。然后将管子放入 95 摄氏度的加热块中。五分钟后，关火，让它慢慢冷却至室温，冷却后可能需要一个小时或更长时间。

肛门接头可以存放在冰箱中，直到需要。通过 Ali 从每个样品中引用 1 微克 DNA 制备 2 个 96 孔板，并将其放入两个 96 孔板的相应孔中。例如，将样品 1 中的 1 微克 DNA 放入两个孔板的 A 孔中。

96 孔板中的 DNA 将使用右侧酶 NLA 3 消化，并使用左侧酶 BFA 1 消化另一个 96 孔板中的 DNA 样品。让 DNA 在 37 摄氏度下消化过夜。第二天，加热完成消化，使酶失活 20 分钟。

现在使用 mini loot 96 孔板清理消化反应。使用多通道移液器，将每个样品转移到 mini loot 中。96 孔板。

将 mini loot 96 孔板放入真空歧管中。对板施加真空，直到孔看起来干燥。通常，在整个协议中为 15 分钟。

需要非常小心，不要污染您的样品。使用 96 时，孔板应尽可能用盖子覆盖孔，并避免将移液器穿过打开的孔，因为任何不需要的液体都会破坏样品。从真空歧管中取出迷你战利品板，并用纸巾堵住板底部，直到完全干燥。

DNA 重悬于 mini loot. 96 孔板中，向每个孔板中加入 30 微升双蒸水。将迷你战利品板放在设置为高的轨道振动器上两分钟。

接下来，将 Mini Loot 板内容物转移到干净的 96 孔板中。进行接头连接反应。通过在试剂储液槽中混合足量的连接缓冲液、来自步骤 3.2 T 的跪下接头、四种 DNA 连接酶和水来制备连接反应。

使用多通道移液器将上一步中消化的 10 μL DNA 转移到新的 96 孔板中。然后使用多通道移液器将 10 μL 连接反应物 Eloqua 到 96 孔板的所有孔中。毕竟，孔中已经加载了 DNA 和连接试剂。

将板在 16 摄氏度下孵育 4 小时至过夜。第二天早上。通过在 65 摄氏度下灭活 T 4 连接酶 10 分钟来结束连接。

和以前一样，使用 Mini Loot 板和真空歧管清理连接反应物以干燥板，然后吸干板底部直至完全干燥。将 DNA 重悬于 30 μL 双蒸水中。放在轨道摇床上 2 分钟，然后将迷你战利品板内容物转移到干净的板上。

接下来，用 bam H one 进行第二次 DNA 消化，以破坏剩余的 concat 转座子。在 37 摄氏度下消化 DNA 3 到 6 小时或过夜，然后按照与以前相同的程序使用迷你战利品板清理消化物。使用转座特异性引物和接头特异性引物进行 30 个循环 PCR。

反应应包含 3 μL 消化的 DNA 和接头。接下来，使用 mini loot 清理 PCR 反应。96 孔板和之前执行的真空歧管。

DNA 重悬于 30 μL 水中，并将悬浮液转移至干净的 96 中。使用两微升稀释产物将 2 微升 PCR 反应产物稀释到 148 微升双蒸水中。使用 100 μL 体积的嵌套引物进行 30 个循环的 PCR。

这些引物适用于 Illumina GA two X 机器。每个样品将具有来自 PCR 运行的唯一 12 个碱基对条形码，每种产物在 1% 凝胶上加入 45 μL（含 AUM 溴化物）。应该有一条 PCR 产物弥散条带，代表肿瘤中许多不同转座子插入的扩增子。

使用前面描述的真空洗涤方法纯化剩余的 50 μL PCR，然后将 DNA 重悬于 50 μL 水中并再次进行真空洗涤。现在 Resus，将 DNA 悬浮在 30 μL TE 中，并将其转移到干净的 96 孔板中。确定每个样品中 DNA 的浓度。

然后将来自每个样品的等量 DNA 混合到一个试管中。只要每个样品都是使用该方案使用不同的条形码引物生成的，就可以在 Illumina 运行的单个泳道中对数百个 DNA 样品进行测序。在 1% 凝胶上运行一半的二级 PCR 产物后，成功的 L-M-P-C-R 应该在单个肿瘤中扩增插入的数百个转座，DNA 弥散条带代表这种扩增。

如果 LM PCR 不成功，则不存在 DNA 弥散条带。相反，您将在 Illumina GA 的单个泳道中看到 1 到 200 个肿瘤的 DNA 测序明确条带，两个 X 平台应产生超过 3000 万个序列，每个序列 100 个碱基对 在尝试此程序时。重要的是要记住缓慢而小心地工作，以确保此程序后不会发生污染。

可以对新发现的癌症遗传驱动因素进行分析，以回答其他问题，例如，这些驱动因素中的哪些可以作为治疗的目标？