在EMBL的MultiBac蛋白质复杂的生产平台
July 11th, 2013
蛋白质复合物催化关键的细胞功能。详细的功能及结构表征多种人体所需的复合需要重组生产。 MultiBac杆状病毒/昆虫细胞表达真核蛋白质及其复合系统特别定制。 MultiBac实施作为一个开放的接入平台，开发的标准作业程序，以最大限度地发挥其效用。
该程序的总体目标是通过使用多背 baula 病毒昆虫细胞系统产生蛋白质复合物。这是通过首先生成多基因构建体，编码所选的蛋白质复合物来实现的。第二步是通过转化细菌细胞并筛选正确的后中位来制备包含多基因构建体的复合 baula 病毒。
接下来，分离 baula 病毒基因组，并在测试蛋白质生产后，在六孔板中使用它小规模感染昆虫细胞。所选的蛋白质复合物在更大的规模上表达并得到纯化。最终，纯化的蛋白质复合物用于发现其结构和功能，并有可能用于药物发现。
与现有的 echovirus 系统相比，该技术的主要优点是双重的。MultiPro 复合物可以以前所未有的方式生产。此外，生产的材料质量要高得多，因为我们对埃可病毒进行设计以实现最佳蛋白质生产。
这项技术的含义远远超出了基本的生物学问题。我们的 Multi Bag 平台已成功用于生产蛋白质，这些蛋白质是各种疾病的有前途的新候选疫苗，并通过生产导致肿瘤生长的关键蛋白质组装体来催化癌症研究。通常，刚接触这种方法的人会在过程和无菌需求方面遇到一些困难。
因此，我们非常努力地建立标准作程序，使非专业用户尽可能轻松地申请 Multi-Bank。这种方法的视觉演示至关重要，因为当过程以运动方式显示时，机器人步骤更容易理解。无论多么详细，你都不能仅仅通过查看写下来的协议来提取这一点。
在开始此过程之前，仔细规划共表达策略非常重要。建议先模拟实验。在计算机中。
基因需要分布在受体和供体质粒上。最有效的方法是将可能形成生理亚模块的亚基组合在一起。由于大型复合物具有许多蛋白质亚基，因此需要同时表达许多基因。
Multi Back 系统通过使用自动化程序将基因放置在小 DNA 祖细胞分子中，这些小分子包含称为锁 P 的短 DNA 序列，可被 Cree 重组酶识别，从而大大简化了基因的克隆。然后通过添加前重组酶将这些祖细胞组合到一步反应中，该反应将具有 lox P 位点的所有物质连接到一个大的 DNA 质粒中。这种多基因构建体随后入到多背布拉病毒基因组中。
如果要生成大量构建体，建议使用机器人脚本和液体处理工作站。该工作站配备了用于小量制备和 PCR 纯化的真空装置，以及用于自动加载 PCR 样品的 EEL。用于 PCR 和孵育步骤的热循环仪，用于复苏悬浮细胞和冷块的摇床。
对于酶，通过使用限制性内切酶和连接酶将目标基因插入选定的供体和受体中，或者通过使用不依赖连接的方法验证所有供体和受体构建体，通过限制性作图和测序克隆。通过 CRE LAX P 重组进行弥散供体受体组合，以生成选择的多基因表达构建体。组装的多基因构建体通过使用专门设计的引物组的分析 PCR 反应进行验证。
此处显示了机器人辅助 TR 过程的快照。它们包括在多孔板中制备 PCR 反应、提供模板 DNA 和引物、DNA 的 PCR 扩增以及通过在多孔板中碱裂解制备在细菌培养物中生长的多基因构建体。要开始此过程，通过转化到 DH 10 细胞中，将多基因转移载体整合到多 bula 病毒基因组中，DH 10 细胞含有病毒基因组和 TN 7 转座所需的功能。
通过蓝白斑筛选选择具有包含目标基因的复合 baula 病毒的 TN 7 转座细胞后，成功的 TN 7 转座导致 β 半乳糖的 α 互补丢失。因此，具有正确 TN 7 转座的菌落在含有 xal 的选择性 APL 上保持白色。从白色菌落中制备细菌培养物，并通过碱裂解和乙醇异丙醇沉淀分离背蛋白。
接下来，在无菌罩中用纯化的 bao 病毒基因组转染昆虫细胞，将对数期 SF 21 昆虫细胞的等分试样在六孔组织培养板中。向每个中充分添加纯化的 bao 病毒基因组和在培养基中混合的转染试剂。将转染的细胞在 27 摄氏度下孵育 48 至 60 小时，不要移动。
48 至 60 小时后，通过去除培养基，补充新鲜培养基来收获初始病毒或 V zero，并在 2 至 3 天后将板放回培养箱中，检测蛋白质产量。如果存在 A YFP 标志物，则检测病毒扩增的荧光。使用初始病毒 V 零感染在轨道平台上搅拌的小锥形摇瓶中 25 至 50 mL 的对数期细胞。
摇床每 24 小时对细胞进行计数并分液细胞，直到它们停止加倍。遵循低感染复数或 MOI 方案，细胞必须至少加倍一次，否则重复实验并添加较小体积的 V 零。左图显示了感染多背鲍拉病毒后未感染的昆虫细胞。
受感染的昆虫细胞已停止增殖并增大，如右图所示。48 至 60 小时后，通过沉淀细胞收获 V 1 病毒。删除并存储包含病毒的介质。
用新鲜培养基复苏细胞，并将其转移回锥形瓶中。通过沉淀每 12 或 24 小时向 6 个细胞中取出 10 次，如果需要更大的表达体积，则检测蛋白质产生和标记蛋白质信号。用 V one 病毒感染 2 升摇瓶中多达 400 mL 的细胞，进一步扩增病毒。
遵循低 MOI 方案，我们强烈建议使用 ular 病毒感染的昆虫细胞或 VIC 方法将 V one 病毒作为生产病毒储存，以防止重组病毒的修饰并保持高表达水平。在增殖停止后 24 小时观察到沉淀感染的细胞。在这个阶段，细胞在被释放到培养基中之前包含完整的病毒颗粒。
去除培养基，将细胞沉淀重悬于冷冻溶液中，并在冷冻管中对 BIIC 进行冷冻，用于蛋白质生产运行。使用 V、1、V、2 或冷冻 BIC 等分试样感染较大的细胞培养物。通常，2 升培养瓶中的 400 mL 溶液遵循低 MOI 方案。
调整用于感染的病毒体积，使受感染的培养物至少翻倍一次。如果存在 YFP 标记蛋白，则以规定的时间间隔向 6 个细胞中抽取 10 次，对细胞进行超声处理和离心，然后转移到 96 孔板中，在能够记录荧光信号的标准 96 孔读板器中测量 YFP 水平，监测 YFP 信号的演变，直到达到平台期， 表示重组蛋白产量最大。在这个阶段收获细胞，将细胞沉淀短期储存在零下 20 摄氏度或长期储存在零下 80 摄氏度，应通过根据蛋白质的要求量身定制的方法放置细胞，然后是胞质溶胶和细胞核。
分级的核蛋白通常存在于核沉淀中。而胞质蛋白保留在胞质溶胶中。通过分级分离大大简化了蛋白质纯化。
因为可以在一个离心步骤中去除大量污染物。通过使用小型化纯化方法（例如基于多孔或微针头的纯化），可以方便地从小规模初始细胞培养物中纯化蛋白质复合物。与小体积色谱系统（如 ACTA micro）结合使用，未来的步骤是将整个实验装置小型化并集成到与克隆工作站接口的小型桌面应用程序中。
这里显示的是目前正在开发的微型批处理机器人，它将用于此目的。异源蛋白的强共表达是通过 multi back 系统实现的，如图所示。在全细胞提取物、WCE 和澄清的裂解物中可以清楚地识别过表达的蛋白质禁令。
Sn.生产的蛋白质材料的质量和数量通常就足够了。能够对蛋白质复合物进行结构化测定，例如下图所示的有丝分裂检查点复合物 MCC。通常，这些分析纯化运行的产量足以通过各种方法（包括电子显微镜）分析纯化复合物的结构和功能。
我们开发的标准作程序使非专业用户能够轻松应用我们的方法，我们的技术可用于许多对大分子蛋白质复合物感兴趣的实验室，就像今天 Nikola 的小分子蛋白质一样。观看本视频后，您应该对如何使用多袋制备目标蛋白复合物有一个很好的了解，以便以无与伦比的数量和质量生产目标蛋白质复合物，从而实现您雄心勃勃的研究目标。使用我们的系统不需要特殊的安全条件。
但是，请记住，如果您马虎，病毒会感染您，即使它不会在您的细胞中复制。因此，在执行此程序时，必须小心处理您的类固醇状况。我们的方法已经在全球 600 多个实验室中广受欢迎。
使用我们的技术。我们相信，在未来，我们的方法将成为解决人类复杂区的大规模结构基因组学工作不可或缺的一部分。这可能有助于揭示疾病的基础，从长远来看，这可能导致新的和更好的药物和疗法。
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概述
本文介绍了使用MultiBac杆状病毒/昆虫细胞系统生产蛋白质复合物的程序。该过程包括生成多基因构建体、创建复合杆状病毒，以及在昆虫细胞中表达蛋白质复合物以进行纯化和功能分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质表达
- 细胞生物学
- 结构生物学
背景
- 蛋白质复合物对于各种细胞功能至关重要。
- 重组生产对于研究这些复合物至关重要。
- MultiBac是一个设计用于真核蛋白质表达的开放访问平台。
- 标准操作程序提高了MultiBac的实用性。
研究目的
- 高效生产蛋白质复合物。
- 表征这些复合物的结构和功能。
- 促进在药物发现中的潜在应用。
使用的方法
- 生成编码蛋白质复合物的多基因构建体。
- 转化细菌细胞以创建复合杆状病毒。
- 用杆状病毒感染昆虫细胞。
- 纯化表达的蛋白质复合物以供进一步分析。
主要结果
- 成功生成多基因构建体。
- 在昆虫细胞中高效生产蛋白质复合物。
- 纯化的蛋白质复合物已准备好进行结构和功能研究。
- 在药物发现计划中的潜在应用。
结论
- MultiBac系统有效用于生产真核蛋白质复合物。
- 该方法增强了对蛋白质结构和功能的理解。
- 它为通过详细蛋白质分析开辟了药物发现的途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
The MultiBac platform at EMBL enables robust, scalable production of eukaryotic multiprotein complexes, addressing a critical bottleneck in structural and functional proteomics. By standardizing recombinant complex expression, it supports predictive confidence in target validation and accelerates early discovery through preclinical research. This capability is directly relevant for biopharma teams seeking to de-risk mechanistic hypotheses and streamline portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of complex biological pathways by providing high-quality multiprotein assemblies.
- Supports functional target validation through recombinant production of physiologically relevant complexes.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing detailed structural and functional analysis of protein assemblies.
- Improves predictive confidence for go/no-go decisions in early-stage discovery.
Screening & Assay Development
- Delivers validated protein complexes for downstream assay development and compound screening.
- Standardizes expression and purification protocols to ensure reproducibility and scalability.
- Enables quantitative assessment of protein production using fluorescence markers and analytical purification.
- Prepares robust biological systems for reliable evaluation of candidate molecules.
Translational & Preclinical Research
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting production of disease-relevant complexes.
- Aligns with translational biomarker strategies through structural elucidation of therapeutic targets.
- Reduces biological risk in preclinical models by ensuring access to high-quality protein assemblies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
The MultiBac platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling seamless transition of validated complexes across the R&D continuum.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling recombinant production of multiprotein assemblies.
- Screening: Provides assay-ready complexes with standardized protocols for reproducible outputs.
- Analytics: Delivers quantitative readouts, such as fluorescence-based measurements, to compare expression conditions.
- Translational Research: Facilitates structural and functional studies that inform biomarker and disease model alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a platform approach with SOPs, enabling broad adoption and scalability across research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and automates complex expression workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, insect cell culture, and protein purification.
- Needs access to liquid handling workstations, analytical PCR, and fluorescence plate readers.
- Demands strict adherence to sterility and SOPs for reproducible outcomes.
- Adaptable to a range of protein complexes but may require optimization for specific assemblies.
- Practical limitations include the need for careful planning of co-expression strategies and construct design.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:13
Tandem Recombineering (TR) for Creating Multigene Expression Constructs
4:57
Composite Multigene Baculovirus Generation, Amplification and Storage
5:02
Baculovirus Generation
6:42
Amplification
8:14
Storage
8:55
Protein Production and Downstream Processing
8:57
Infecting Larger Cultures and Monitoring YFP
10:20
Cell Lysis and Fractionation
10:45
Protein Purification
11:07
Future Outlook
11:33
Results: Production of Eukaryotic Protein Complexes by MultiBac
12:18
Conclusion
