Name: 在EMBL的MultiBac蛋白质复杂的生产平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: 了解使用MultiBac杆状病毒/昆虫细胞系统生产蛋白质复合物的完整流程。该方法通过构建多基因表达载体、生成重组病毒并在昆虫细胞中高效表达，为结构生物学研究和药物开发提供高质量的蛋白材料。

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感谢Christoph Bieniossek、Simon Trowitzsch、Daniel Fitzgerald、Yuichiro Takagi、Christiane Schaffitzel、Yvonne Hunziker、Timothy Richmond以及Berger实验室所有过去和现在的成员提供的帮助与建议。MultiBac平台及其开发工作一直得到多个资助机构的慷慨支持，包括瑞士国家科学基金会（SNSF）、法国国家研究署（ANR）、法国国家科学研究中心（CNRS）以及欧洲委员会在第六和第七框架计划（FP6和FP7）中的资助。跨国访问支持由欧洲委员会FP7项目P-CUBE（<a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a>）和BioStruct-X（<a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a>）提供。特别感谢法国科学部通过“未来投资计划”FRISBI项目对EMBL的MultiBac平台给予的支持。

1. 用于构建多基因表达载体的串联重组工程（TR）
<ol>
 <li>设计共表达策略。设计将目标基因插入供体（Donors）和受体（Acceptors）的方法。复合物中潜在的生理功能亚模块应分别集中于特定的受体和供体上。使用由归巢内切酶（Homing endonuclease, HE）- BstXI 对组成的乘法模块，将表达盒组合到单个供体和受体质粒上。7,8 在开展实验前，应在计算机中（in silico）构建所有相关载体，并对策略进行充分验证。例如，应检查目标基因是否不含HE或其他限制性酶切位点，并确认开放阅读框（ORFs）的正确性。可考虑订购针对昆虫细胞密码子偏好和mRNA二级结构优化的合成基因，以提高蛋白表达水平，同时去除目标基因中已有的HE位点。根据文献中关于目标蛋白N端或C端柔性或暴露区域的数据，考虑在合适位置添加纯化标签。若因复合物中各蛋白的化学计量关系需要精确控制各亚基的相对表达量，可考虑采用多聚蛋白（polyprotein）策略，以在同一转录本中表达多个蛋白亚基。4 准备详细的“操作指南”文档（建议使用电子实验记录本），记录从起始到构建完整多基因载体的全部实验步骤。创建Cre-LoxP融合质粒的电子文件，例如使用Berger课题组提供的Cre-ACEMBLER软件（可从其主页下载：<a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies/cre-acembler</a>）。</li>
 <li>使用限制性内切酶与连接酶，或依据已发表的方案采用无需连接的方法，将目标基因插入选定的供体和受体中。5,6,14 若具备液体处理工作站，并计划构建大量载体（例如用于组合式策略），可考虑使用Berger课题组开发并实现的机器人操作脚本（图2）。14,15 若无液体处理工作站，也可通过手工操作结合微孔板，以高通量类似的方式完成基因插入。</li>
 <li>在需要控制表达亚基化学计量比的情况下，可能会遇到实际限制。若蛋白复合物中各亚基的表达水平存在化学计量失衡，可考虑采用多聚蛋白策略，将多个亚基与特定蛋白酶（例如烟草蚀刻病毒NIa蛋白酶）通过特定的蛋白酶切割位点连接，构成单一的长开放阅读框（ORF）。4,8 若复合物结构庞大、亚基数量众多且各亚基分子量差异显著，可考虑将一个多聚蛋白与单个表达盒共同表达。若某一蛋白表达产量较低，可考虑在同一多聚蛋白中重复表达多个相同基因，或构建多个相同的表达盒进行共表达，以提高其表达量。4,13</li>
 <li>通过限制性酶切图谱分析（可选高通量方式）和测序，验证所有构建的供体和受体载体。随后通过Cre-LoxP重组将供体与受体组合融合，构建所需的多基因表达载体。使用Cre-ACEMBLER或类似软件生成的电子序列作为参考，通过限制性酶切图谱验证纯化的受体-供体融合质粒。</li>
 <li>将纯化并验证后的供体、受体及供体-受体融合质粒储存于-20 °C或-80 °C。妥善归档质粒及其序列信息（如使用Microsoft Excel、Filemaker等工具），以备后续使用。</li>
</ol>
2. 复合型多基因杆状病毒的构建、扩增与保存
<ol>
 <li>通过将多基因转移载体转化至携带病毒基因组及Tn7转座所需功能的DH10细胞中，将其整合至MultiBac杆状病毒基因组。需注意，MultiBac杆状病毒基因组可在其自身的LoxP位点（经工程改造位于Tn7插入位点远端）预先装载特定目的基因（如YFP标记、分子伴侣等），通过 体内 Cre 反应先于 Tn7 整合。13 转座Tn7后，通过蓝/白筛选选择含有目的基因的复合型杆状病毒的细胞（成功的Tn7转座导致β-半乳糖苷酶的α-互补功能丧失；因此，在含有X-gal的选择性琼脂平板上，正确完成Tn7转座的菌落保持白色），随后通过碱裂解及乙醇/异丙醇沉淀法提取基因组。5,6</li>
 <li>转染与初始病毒制备将6孔组织培养板放入无菌操作台中。从对数生长期的Sf21昆虫细胞培养物中取细胞等分试样接种于各孔中，并按照所述方法，在培养基中加入纯化的杆状病毒基因组和转染试剂混合物进行转染。6 48–60 小时后通过移除培养基收获初始病毒（高质量、低滴度病毒 V）0，通常每孔加入3 ml）。补充新鲜培养基，继续培养额外2-3天后检测蛋白表达（如果含有YFP标记，则同时检测荧光）。6,7 </li>
 <li>病毒扩增，低感染复数方案. 使用 V0 病毒用于感染处于对数生长期的 25-50 ml 细胞（细胞密度 &lt;1×106 每毫升细胞数）置于小型（100–250 ml）锥形摇瓶中，在轨道摇床平台上振荡培养（图3）。计数细胞，每24小时传代一次，直至细胞停止倍增（增殖停滞）。采用低感染复数（multiplicity of infection，MOI） 即 每个细胞的病毒颗粒数）方案：细胞必须至少倍增一次（MOI &lt; 1），否则使用更小体积的V重复实验0 加入。通常，加入 3 ml 的 V0 用于感染25 ml密度为0.5×10⁶个/ml的Sf21昆虫细胞6 细胞/毫升。这是防止病毒过度扩增和自删除的关键步骤，可避免目标异源基因的丢失。收获 V1 病毒（25-50 ml），于48-60小时后通过离心收集细胞并移除含病毒的培养基。更换新鲜培养基，并通过取1×10⁶细胞检测YFP及蛋白表达情况。6 每12或24小时收集细胞，离心沉淀并验证蛋白表达及标记蛋白（YFP）信号。6，扩增病毒（至 V2若目标是获得更大表达量，可通过在2 L摇瓶中感染最多400 ml细胞来进一步实现1 病毒，遵循上述低感染复数（MOI）方案（细胞在感染V后必须至少倍增一次）1严格检测扩增过程中的蛋白质表达及标记蛋白信号，以避免缺陷型病毒（不再含有目的基因）的积累。5-7 利用每次扩增步骤中已积累的细胞沉淀，建立目标表达蛋白复合物的纯化方案。</li>
 <li>生产病毒的BIIC储存我们强烈建议储存 V2 使用BIIC方法将病毒作为生产病毒B杆状病毒-i感染的 i昆虫 c细胞）方法，以防止修饰（例如 目的基因的缺失）以及维持高水平的表达。16 在增殖停滞后24小时收集感染的细胞——此阶段的细胞含有完整的病毒颗粒，即将通过出芽方式释放到培养基中。移除培养基，将细胞沉淀分装后用液氮速冻，并可长期保存。7,16</li>
</ol>
3. 蛋白质生产与下游处理
<ol>
 <li>感染较大培养物并监测YFP. 使用 V1，V2 或使用冻存的 BIIC 分装样品感染更大体积的细胞培养物以进行生产（通常为 2 L 三角瓶中的 400 ml）。遵循低 MOI 操作方案（调整用于感染的病毒体积，使感染后的细胞至少倍增一次）。必要时可通过增加三角瓶数量来扩大感染培养体积。若存在 YFP 标记蛋白，则在预定时间间隔内取样 1×10⁶ 细胞6 细胞，离心收集并裂解细胞，监测YFP信号的变化，直至信号达到平台期，表明重组蛋白的表达达到最大量。YFP水平可在标准的96孔板荧光酶标仪上测定，该仪器需具备记录荧光信号的功能（例如 Tecan SPECTRAFluor）。在此阶段收获细胞。将细胞沉淀物储存于 -20 °C（短期）或 -80 °C（长期）。</li>
 <li>细胞裂解与分馏采用适合目标蛋白特性的常用方法裂解细胞（如冻融法、超声破碎法、法国压滤法或其他方法）。5-7 分离细胞质和细胞核组分，并检测目标蛋白的存在。根据实验结果制定纯化方案，以简化蛋白纯化流程。若目标蛋白定位于细胞核，可考虑在高KCl条件下采用浸提方法从核组分中提取蛋白。7,18</li>
 <li>蛋白质纯化（微规模，大规模）请注意，由于杆状病毒/昆虫细胞系统中异源蛋白的表达水平通常较高或非常高（每升培养物常可产生10–100 mg甚至更多的蛋白），因此通常仅需少量细胞培养物（10或25 ml）即可获得足够量的细胞沉淀，用于纯化目标蛋白。结合微量纯化技术（如多孔板、微探针方法、GE Healthcare ÄKTAmicro系统等），可获得生化与活性数据，且通常还能获得足量的目标蛋白及蛋白复合物，用于纳升级别的高通量结晶（HTX）。建议在目标蛋白复合物的暴露亚基上添加寡聚组氨酸标签（6–10个残基），并采用金属亲和层析（如Clonetech Takara TALON、Qiagen NiNTA金属螯合树脂），再结合离子交换层析和凝胶过滤层析，在小体积条件下进行纯化，例如使用ÄKTAmicro或类似的微量纯化设备。图4）。此外，根据目标蛋白的生化特性及个人偏好，还可并应考虑采用其他亲和纯化步骤以及离子交换层析（IEX）步骤，与带有寡聚组氨酸标签或其他标签（可选自GST、MBP、CBP等）的亲和纯化联用。可考虑对多个亚基同时进行亲和标签标记，以提高纯化效率。浓缩纯化的蛋白复合物，并建立储存方案，例如添加或不添加甘油进行冷冻保存。建立可标准化应用的质量控制标准（如活性测定、生物化学及生物物理检测），用于评估纯化蛋白批次间的差异。</li>
</ol>

<ol><li>Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+a+Grip+on+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Getting a Grip on Complexes.</a> Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).</li>
<li>Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+sociology+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular sociology of the cell.</a> Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiBac%3A+expanding+the+research+toolbox+for+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).</li>
<li>Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li>
<li>Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiBac%3A+multigene+baculovirus-based+eukaryotic+protein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20(2008).</li>
<li>Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+baculovirus+expression+tools+for+recombinant+protein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).</li>
<li>Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robots%2C+pipelines%2C+polyproteins%3A+enabling+multiprotein+expression+in+prokaryotic+and+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells.</a> J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).</li>
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<li>Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structures+of+the+eukaryotic+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Atomic structures of the eukaryotic ribosome.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).</li>
<li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+core%2C+two+shells%3A+bacterial+and+eukaryotic+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).</li>
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<li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).</li>
<li>Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li>
<li>Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li>
<li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H.D.+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+%28TIPS%29+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+%28sGC%29+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).</li>
<li>Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+mitotic+checkpoint+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the mitotic checkpoint complex.</a> Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).</li>
<li>Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li>
</ol>

IB 是本文件所述技术部分的专利和专利申请的发明人。

图 2 和 3 中的视频截图展示了从cDNA开始，通过机器人辅助生成多基因表达载体，直至感染昆虫细胞培养物以进行蛋白质生产的完整过程。研究人员已开发出新的试剂（质粒和病毒）以及稳健的实验方案，从而建立了一条依赖标准操作程序（SOP）的实验流程。该完整流程已在位于格勒诺布尔的欧洲分子生物学实验室（EMBL）作为平台技术得以实施。许多来自学术界和工业界、从事多蛋白研究的科学家均已使用过MultiBac平台。该平台的培训使用由欧洲委员会资助的专项访问计划（P-CUBE、BioSTRUCT-X）提供支持。
提供利用MultiBac系统进行蛋白复合物表达的标准操作流程（SOP），使得该技术也易于非专业用户使用。当需要并行生成大量复合物（例如感兴趣样本的变体和突变体）时，机器人辅助操作尤其能够加速多蛋白复合物的生产。然而，即使在低至中等通量的手动操作中，SOP的可用性也带来了显著优势。根据我们的经验，要将流程成功编写为机器人操作程序，必须首先投入大量努力进行优化，直至获得足够稳健且适用于机器人操作的实验方案。此类方案构成了我们...

生物活性由蛋白质及其他生物分子的复合体协同调控，这些复合体共同作用以催化细胞功能。典型的例子包括将DNA中的遗传信息转录为信使RNA的分子机器。在人类中，超过100种蛋白质通过特定且受调控的过程协同作用以转录基因，形成包含10个或更多亚基的大型多蛋白复合物，其中包括RNA聚合酶II以及通用转录因子如TFIID、TFIIH等9。其他例子包括由多种蛋白质和RNA分子组成的核糖体，其催化蛋白质的合成；以及在真核生物中负责将生物分子穿梭通过核膜的核孔复合物。对细胞中几乎所有多组分分子机器进行详细的结构与生化解析，对于理解其功能至关重要。例如，原核与真核核糖体的结构解析即为里程碑式的研究，为这些大分子机器如何在细胞内执行特定功能提供了前所未有的深入见解10,11。
由于核糖体可占细胞质量的30%，因此通过从培养细胞中纯化内源性物质，可以获得足量且高质量的核糖体用于深入研究。相比之下，RNA聚合酶II的丰度则低几个数量级，为获得该转录核心复合物的原子分辨率结构，曾需处理数千升的酵母培养物12。然而，绝大多数其他必需复合物在天然细胞中的含量极低，因而无法从天然来源材料中充分纯化。要使这些复合物能够进行深入的结构与功能分析，必须借助重组技术进行异源表达生产。
重组蛋白的生产对生命科学研究产生了重大影响。许多蛋白质通过重组技术得以表达，并在高分辨率下对其结构和功能进行了深入解析。结构基因组学项目利用多种生物基因组的解析成果，以高通量（HT）模式系统性地研究整个生物体的基因产物谱。因此，已有数千种蛋白质结构被确定。迄今为止，最广泛使用的重组蛋白表达系统是E. coli，多年来已针对该宿主开发并优化了多种表达系统。携带大量功能元件、用于在E. coli中实现蛋白表达的质粒，已占据商业供应商产品目录的整册篇幅。
然而，E. coli 存在某些局限性，使其不适合表达许多真核蛋白，特别是由多个亚基组成的蛋白复合物。因此，近年来在真核宿主中进行蛋白表达已成为首选方法。其中，杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system, BEVS）是一种特别适用于表达真核蛋白的系统，该系统利用携带异源基因的重组杆状病毒感染在实验室中培养的昆虫细胞。MultiBac 系统是近年来发展起来的一种 BEVS，专为表达具有多个亚基的真核蛋白复合物而优化设计（图1）。MultiBac 于2004年首次被提出13。自推出以来，该系统不断得到改进和简化，通过制定高效的标准操作程序（SOPs），使操作更便捷、目标蛋白质量更高，并让非专业用户也能轻松使用4。目前，MultiBac 已在全球范围内的学术界和工业界众多实验室中得到应用。在位于格勒诺布尔的欧洲分子生物学实验室（EMBL），欧盟委员会设立了跨国访问项目，为希望利用该表达系统推进研究的科学家提供 MultiBac 平台的专业培训。许多此前难以获得的蛋白复合物的结构与功能，正是通过 MultiBac 表达的样品得以解析4。下文将概述在 EMBL 格勒诺布尔 MultiBac 平台实际运行中所采用的 MultiBac 表达关键步骤的操作方案。

<table><tbody><tr><td>Bluo-Gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028 (1 g)</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Euromedex</td><td>UT2965-B (25 g)</td><td>1,000倍溶液，浓度为10 mg/ml</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Euromedex</td><td>EU0420 (25 g)</td><td>1,000倍溶液，浓度为50 mg/ml</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>SIGMA</td><td>G3632 (5 g)</td><td>1,000倍溶液，浓度为10 mg/ml</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B (5 g)</td><td>1,000倍溶液，浓度为1 M</td></tr><tr><td>Cre重组酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0298</td><td></td></tr><tr><td>X-Treme GENE HP 转染试剂</td><td>Roche</td><td>06 366 236 001</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone SFM4 昆虫细胞培养基</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30913.02</td><td></td></tr><tr><td>6孔板 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 移液管 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 移液管 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 移液管 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 移液管 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 移液管 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml 冻存管 Nunc</td><td>Dominique Dutscher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>100 ml 摇瓶 Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211917</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 摇瓶 Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211918</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 摇瓶 Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211919</td><td></td></tr><tr><td>2 L 摇瓶 Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211921</td><td></td></tr><tr><td>Certomat 轨道摇床 + 平台</td><td>Sartorius</td><td>4445110, 4445233</td><td></td></tr><tr><td>35 L 液氮杜瓦罐</td><td>Fisher Scientific</td><td>M76801</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜 Faster</td><td>Sodipro</td><td>FASV20000606</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td>451207</td><td></td></tr><tr><td>Sf21 昆虫细胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hi5 昆虫细胞</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Tecan freedom EVO 配备 Evoware plus 系统</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l 导电吸头（黑色）</td><td>TECAN</td><td>10 612 516</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l 导电吸头（黑色）</td><td>TECAN</td><td>10 612 510</td><td></td></tr><tr><td>一次性试剂槽，100 ml</td><td>TECAN</td><td>10 613 049</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec 96孔PCR板，带裙边</td><td>Eppendorf</td><td>0030 128.648</td><td></td></tr><tr><td>96孔V型底板，非无菌</td><td>BD falcon</td><td>353263</td><td></td></tr><tr><td>96深孔板，自然色，聚丙烯材质</td><td>Fisher</td><td>M3752M</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微孔板，96孔平底</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>96深孔板</td><td>Thermo scientific</td><td>AB-0932</td><td></td></tr><tr><td>24孔反应块 RB</td><td>Qiagen</td><td>19583</td><td></td></tr><tr><td>DpnI 限制性内切酶</td><td>NEB</td><td>R0176L</td><td>20 U/μL</td></tr><tr><td>NEBuffer 4 10X</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion 高保真预混液</td><td>Finnzyme</td><td>ref F-531L</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion GC 预混液</td><td>Finnzyme</td><td>ref F-532L</td><td></td></tr><tr><td>DGLB 1.5X</td><td>自制</td><td></td><td>含7.5%甘油、0.031%溴酚蓝、0.031%二甲苯蓝FF</td></tr><tr><td>高分子量DNA Marker（用于E-gel）</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>低分子量DNA Marker（用于E-gel）</td><td>Life Technologies</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>E-gel 48 1%琼脂糖凝胶GP</td><td>Life Technologies</td><td>G8008-01</td><td></td></tr><tr><td>Nucleo Spin-robot-96 质粒提取试剂盒</td><td>Macherey Nagel</td><td>740 708.24</td><td></td></tr><tr><td>PCR产物纯化试剂盒，Nucleospin Robot-96 Extract</td><td>Macherey Nagel</td><td>740 707.2</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq Green 预混液</td><td>Promega</td><td>M7113</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA聚合酶（适用于LIC克隆）</td><td>Novagen</td><td>70099-3</td><td></td></tr><tr><td>DTT 100 mM</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素 2 M</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA 500 mM pH 8.0</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB培养基（Miller配方），500 g</td><td>Athena ES</td><td>103</td><td></td></tr></tbody></table>

欧洲分子生物学实验室的 multibac 蛋白复合物生产平台

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

蛋白质组学研究以前所未有的细节揭示了真核生物蛋白质组的惊人复杂性。目前普遍认为，细胞中的蛋白质大多并非以孤立形式存在，而是通过与许多其他蛋白质相互作用来发挥其生物学功能；在人类中，这种相互作用通常涉及十个或更多的蛋白质，从而在细胞内形成执行大部分甚至全部生命功能的组装线。1,2 要深入了解这些多蛋白复合物的功能与结构，需要获得高质量且足量的复合物样品，以便进行详细分析。然而，许多蛋白质复合物在细胞内的含量极低，尤其是在真核生物中，这使得从天然来源提取变得不可行，因而必须依赖重组表达手段进行生产。杆状病毒表达载体系统（BEVS）已被证明在表达真核蛋白方面特别有效，因为这些蛋白的功能往往依赖于翻译后修饰，而其他常用的表达系统通常难以支持此类修饰。3 BEVS利用一种重组杆状病毒，将目标基因插入该病毒基因组中，再用其感染昆虫细胞培养物，从而让细胞表达目标蛋白。MultiBac 是一种专门优化用于表达包含多个亚基的真核蛋白复合物的BEVS系统。4 高效表达蛋白质及其复合物的关键前提，是建立针对表达实验各步骤的稳健实验方案，理想情况下可作为标准操作程序（SOP）实施，并能被非专业用户相对轻松地遵循。欧洲分子生物学实验室（EMBL）的 MultiBac 平台为多蛋白复合物表达实验的各个环节均制定了标准操作程序，涵盖从将基因插入经过工程化改造、优化用于异源蛋白表达的杆状病毒基因组，到对所获得蛋白样品进行小规模分析的全过程。5-8 该平台以开放访问模式部署于EMBL格勒诺布尔分部，已支持了来自学术界和工业界的众多科研人员，加速了蛋白质复合物研究项目的进展。

MultiBac 系统实现异源蛋白的高效共表达，结果如图1d所示（在感染悬浮细胞培养物后48小时取样）。在全细胞提取物（SNP）和澄清裂解液（SN）中，过表达的蛋白条带清晰可辨。所获得蛋白样品的质量和数量通常足以支持蛋白质复合物的结构解析，例如如图1e所示的有丝分裂检验点复合物MCC。17
图2展示了通过机器人辅助串联重组工程（TR）进行基因组装实验的工作流程。稳健的DNA组装方案已被编写为机器人操作程序，用于平行化组装多基因表达载体。各个机器人操作步骤以快照形式展示（图2c，I - IV）。待组装的DNA组分通过PCR生成，并利用电子凝胶进行质量控制（图2d，左侧）；组装完成的多基因载体同样通过特异性设计的引物组进行PCR验证（图2d，右侧）。14,15
重组杆状病毒的生成与扩增遵...

蛋白质复合物催化细胞内的关键功能。对许多重要复合物进行详细的功能和结构表征需要通过重组表达来实现。MultiBac 是一种杆状病毒/昆虫细胞表达系统，专为表达真核蛋白及其复合物而设计。MultiBac 已被构建为一个开放获取的平台，并开发了标准操作程序以最大化其应用价值。

欧洲分子生物学实验室的 MultiBac 蛋白复合物生产平台

蛋白质组学研究以前所未有的细节揭示了真核生物蛋白质组的惊人复杂性。如今，这一观点已被广泛接受：……

本实验的总体目标是利用多基因杆状病毒昆虫细胞系统来生产蛋白质复合物。首先构建包含目标蛋白质复合物编码序列的多基因表达载体，然后通过转化细菌细胞并筛选正确的杆状病毒重组体，获得含有该多基因表达载体的重组杆状病毒。接下来，分离巴乌拉病毒基因组，并在检测蛋白表达后，利用其在六孔板中对昆虫细胞进行小规模感染。随后对选定的蛋白复合物进行大规模表达并纯化。最终，利用纯化的蛋白复合物研究其结构与功能，并可能用于药物发现。与现有的埃可病毒系统相比，该技术的主要优势有两点。MultiPro复合物可以以前所未有的产量进行生产。此外，所获得的材料质量更高，因为我们对埃可病毒进行了改造，以实现最优的蛋白质表达。该技术的意义远不止于基础生物学问题。我们的多袋培养平台已成功用于生产多种疾病的新型候选疫苗蛋白，并通过生成导致肿瘤生长的关键蛋白复合物，推动了癌症研究。通常，初次接触该方法的人员在操作流程和无菌要求方面会遇到一些困难。因此，我们投入了大量努力来制定标准操作程序，以使非专业用户能够尽可能轻松地应用多通道移液技术。对该方法进行可视化演示至关重要，因为当过程以动态形式展示时，机器人操作步骤会更容易被理解。这一点仅通过阅读书面方案是无法获得的，无论这些方案多么详尽。在开始此操作之前，必须仔细规划共表达策略。建议首先在计算机中进行模拟实验。基因需要分布在受体质粒和供体质粒上。最佳策略是将可能形成生理学亚模块的亚基对应的基因分组。由于大分子复合物包含多种蛋白质亚基，因此需要同时表达多个基因。多基因克隆系统通过使用自动化程序，将基因插入含有短DNA序列（称为loxP位点）的小型DNA前体分子中，从而极大地简化了基因克隆过程，该loxP位点可被Cre重组酶识别。随后，通过加入Cre重组酶，将这些前体分子在一步反应中组合，使所有含有loxP位点的片段连接成一个大型DNA质粒。该多基因结构随后被插入多基因克隆载体——杆状病毒基因组中。若需构建大量重组质粒，建议使用机器人程序和液体处理工作站。该工作站配备有用于小量提取和PCR产物纯化的真空系统，以及用于PCR样本自动上样的EEL系统。同时配有用于PCR和孵育步骤的热循环仪、用于重悬细胞的振荡器，以及冷区块。对于酶，通过使用限制性内切酶和连接酶，或 alternatively 使用无需连接的克隆方法，将目的基因插入选定的供体和受体载体中。通过限制性酶切图谱分析和测序验证所有供体和受体构建体。利用 CRE LAX P 重组系统组合不同的供体-受体组合，以生成所需的多基因表达构建体。通过设计特异性引物组进行分析性 PCR 反应，对组装好的多基因构建体进行验证。此处展示了机器人辅助的TR过程的各个步骤，包括在多孔板中制备PCR反应、提供模板DNA和引物、对DNA进行PCR扩增，以及通过碱裂解法在多孔板中制备在细菌培养物中生长的多基因构建体。开始该操作时，将多基因转移载体整合到多杆状病毒基因组中，方法是将其转化至含有病毒基因组及实现TN7转座所需功能的DH10细胞中。通过蓝白斑筛选，选择含有目标基因的复合型巴尔病毒的 TN 七次转座细胞，成功的 TN 七次转座会导致 β-半乳糖苷酶的 α 互补功能丧失，因此正确完成 TN 七次转座的菌落在含有 Xal 的选择性 APL 培养基上保持白色。从白色菌落中制备细菌培养物，并通过碱裂解法及乙醇-异丙醇沉淀法分离质粒。接下来，在无菌操作台中将纯化的 bao 病毒基因组转染入昆虫细胞，取对数生长期的 SF 21 昆虫细胞等分试样，接种于六孔组织培养板中。向每孔加入纯化的 bao 病毒基因组以及用培养基混合的转染试剂。将转染后的细胞在 27 °C 静置培养 48 至 60 小时。在48至60小时后，通过移除培养基收集初始病毒（即V零），补充新鲜培养基，将培养板放回培养箱继续培养两至三天后，检测蛋白表达水平。若存在YFP标记物，通过检测荧光判断病毒扩增情况。使用初始病毒（V零）感染处于对数生长期的小型锥形摇瓶中的25至50毫升细胞，置于旋转平台上振荡培养。震荡培养并计数细胞，每24小时传代一次，直至细胞停止倍增。采用低感染复数（MOI）方案时，细胞必须至少倍增一次，否则应减少加入的V0病毒量后重复实验。左侧图像显示的是未感染的昆虫细胞在感染多角体病毒后的状态。受感染的昆虫细胞已停止增殖，并且体积增大，如右侧图像所示。在48至60小时后，通过沉淀细胞收获V一病毒。移除并保存含有病毒的培养基。用新鲜培养基重悬细胞，并将细胞转移回锥形瓶中。每12或24小时，通过离心收集一乘以十的六次方个细胞，检测蛋白表达和标志蛋白信号，以便在需要更大表达量时进行监测。使用V1病毒在2升摇瓶中感染最多400毫升的细胞，进一步扩增病毒。在采用低感染复数（MOI）方案后，我们强烈建议使用病毒感染的昆虫细胞或VIC方法将V一病毒作为生产用病毒进行保存，以防止重组病毒发生修饰，并维持高水平的表达。观察到增殖停滞24小时后，收集被感染的细胞沉淀。在此阶段，细胞内含有完整的病毒颗粒，此时病毒尚未释放到培养基中。吸去培养基，将细胞沉淀重悬于冻存液中，并在冻存管中对BIIC进行冷冻，用于蛋白表达实验。使用V1、V2或冻存的BIC分装样品感染较大规模的细胞培养物，通常在2升摇瓶中接种400毫升培养物，并遵循低MOI感染方案。调整用于感染的病毒体积，使感染后的细胞培养物至少倍增一次。如果存在YFP标记蛋白，在设定的时间间隔内取出1 × 10⁶个细胞，进行超声处理并离心，然后转移至96孔板，在能够记录荧光信号的标准96孔板读数仪中检测YFP水平，持续监测YFP信号的变化直至达到平台期，表明重组蛋白的表达已达到最大值。在此阶段收获细胞，将细胞沉淀短期保存于-20°C或长期保存于-80°C；随后根据目标蛋白的需求选择适当的方法裂解细胞，分离胞质与细胞核组分。分离后的核蛋白通常存在于核沉淀中，而胞质蛋白则保留在胞质溶胶中。通过组分分离可大大简化蛋白质纯化过程。由于许多污染物可以通过一次离心步骤去除，因此可以利用多孔板或微提示纯化等微型化纯化方法，从小规模初始细胞培养物中方便地纯化蛋白质复合物。结合ACTA micro等小体积层析系统，下一步的发展方向是将整个实验装置微型化并集成到一个可与克隆工作站联用的小型台式系统中。此处展示的是目前正在开发的微量化批量机器人，将用于此目的。通过此处所示的多拷贝系统，可实现异源蛋白的高效共表达。在全细胞提取物（WCE）和澄清裂解液中，过表达的蛋白条带清晰可辨。所产生的蛋白质材料在质和量上通常均足够。能够对蛋白质复合物进行结构解析，例如本图中所示的有丝分裂检验点复合物MCC。这些分析性纯化实验的产量通常足以通过多种方法分析纯化复合物的结构与功能，包括电子显微镜技术。我们开发的标准操作流程使非专业用户也能轻松应用我们的方法，我们的技术可用于众多对大型蛋白质复合物感兴趣的研究实验室，就像如今在Nikola对小型蛋白质所做的那样。观看本视频后，您将充分了解如何使用多袋系统，以无与伦比的数量和质量生产您感兴趣的蛋白质复合物，助力实现雄心勃勃的研究目标。使用我们的系统无需特殊的安全部件。然而，请注意，即使该病毒在您的细胞中无法复制，如果您操作不慎，仍可能被感染。因此，在进行此操作时，必须谨慎处理您的类固醇条件。我们的方法已经广受欢迎，全球已有超过600家实验室采用。采用我们的技术。我们相信，未来该方法将成为大规模结构基因组学研究中不可或缺的一部分，用于解析人类复杂区域的结构。这有助于揭示疾病的根本机制，并最终推动开发出更有效的新药和新疗法。

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杆状病毒表达载体系统（BEVS）是一种强大的平台，可用于表达筛选和生产蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs），以用于生化、生物物理和结构研究。对于大多数PRMTs及其他需要真核表达平台的目标蛋白，均可产生毫克级的材料。...

利用杆状病毒表达载体系统生产重组PRMT蛋白

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了解使用MultiBac杆状病毒/昆虫细胞系统生产蛋白质复合物的完整流程。该方法通过构建多基因表达载体、生成重组病毒并在昆虫细胞中高效表达，为结构生物学研究和药物开发提供高质量的蛋白材料。

欧洲分子生物学实验室的 MultiBac 蛋白复合物生产平台

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