欧洲分子生物学实验室的 MultiBac 蛋白复合物生产平台

本实验的总体目标是利用多基因杆状病毒昆虫细胞系统来表达蛋白复合物。首先构建包含目标蛋白复合物编码序列的多基因表达载体，然后通过转化细菌细胞并筛选正确的重组杆粒，获得含有该多基因表达载体的复合杆状病毒。

接下来，分离巴乌拉病毒基因组，并在检测蛋白表达后，将其用于在六孔板中小规模感染昆虫细胞。随后大规模表达目标蛋白复合物并进行纯化。最终，利用纯化的蛋白复合物研究其结构与功能，并可能用于药物发现。

与现有的埃可病毒系统相比，该技术的主要优势有两点。MultiPro复合物可以以前所未有的效率进行生产。此外，所获得的材料质量显著更高，因为我们对埃可病毒进行了改造以实现最优的蛋白质生产。

该技术的意义远不止于基础生物学问题。我们的多袋培养平台已成功用于生产多种疾病的新型候选疫苗蛋白，并通过生成导致肿瘤生长的关键蛋白复合物，推动了癌症研究。通常，初次接触该方法的人员在操作流程和无菌要求方面会遇到一定困难。

因此，我们投入了大量努力来制定标准操作程序，以便使非专业用户能够尽可能轻松地应用多通道移液技术。对该方法进行可视化演示至关重要，因为当过程以动态形式展示时，机器人操作步骤会更容易被理解。这一点仅通过阅读书面方案是无法获得的，无论这些方案多么详尽。

在开始此实验步骤之前，必须仔细规划共表达策略。建议首先在计算机上进行模拟实验。

基因需要分布在受体质粒和供体质粒上。最佳策略是将可能形成生理学亚模块的亚基组合在一起。由于大分子复合物包含多个蛋白质亚基，因此需要同时表达多个基因。

多基因载体系统通过使用自动化程序，将基因插入含有短DNA序列（称为loxP位点）的小型DNA前体分子中，从而极大地简化了基因克隆流程，该loxP位点可被Cre重组酶识别。随后，通过加入Cre重组酶，将所有含有loxP位点的前体分子在一步反应中连接，形成一个大型DNA质粒。该多基因结构随后被插入至多基因载体杆状病毒基因组中。

如果需要构建大量重组体，建议使用机器人程序和液体处理工作站。该工作站配备有用于小量质粒提取和PCR产物纯化的真空系统，以及用于PCR样本自动上样的EEL系统。此外，还配有用于PCR和孵育步骤的热循环仪、用于重悬细胞的振荡器以及冷块。

对于酶，通过使用限制性内切酶和连接酶，或 alternatively 使用无需连接的方法，将目的基因插入选定的供体和受体中；通过限制性酶切图谱分析和测序验证所有供体和受体载体构建。利用 CRE LAX P 重组系统组合不同的供体-受体组合，以生成所需的多基因表达载体。通过使用特异性设计的引物组进行分析性 PCR 反应，验证组装好的多基因表达载体。

此处展示了机器人辅助TR过程的各个步骤，包括在多孔板中制备PCR反应、提供模板DNA和引物、对DNA进行PCR扩增，以及通过碱裂解法在多孔板中制备在细菌培养物中生长的多基因构建体。开始该实验前，需将多基因转移载体整合到多杆状病毒基因组中，方法是将其转化至含有病毒基因组及实现TN7转座所需功能元件的DH10细胞中。

经过TN7转座后，通过蓝白斑筛选选择含有目标基因的复合型baula病毒的七个转座细胞；成功的TN7转座会导致β-半乳糖苷酶的α互补功能丧失，因此具有正确TN7转座的菌落在含有Xal的选择性APL平板上呈现白色。从白色菌落中制备细菌培养物，并通过碱裂解法及乙醇-异丙醇沉淀法分离质粒。

接下来，在无菌操作台中将纯化的 bao 病毒基因组转染入昆虫细胞，取对数生长期的 SF 21 昆虫细胞等分试样，接种于六孔组织培养板中。向每个孔中加入纯化的 bao 病毒基因组以及用培养基混合的转染试剂。将转染后的细胞在 27 °C 下静置培养 48 至 60 小时。

在 48 至 60 小时后，通过移除培养基收集初始病毒（即 V 零），补充新鲜培养基，将培养板放回培养箱中继续培养两到三天后，检测蛋白表达。如果存在 YFP 标记物，则检测荧光以确认病毒扩增。使用初始病毒 V 零感染处于对数生长期的 25 至 50 毫升细胞，细胞置于小型锥形摇瓶中，并在旋转平台上振荡培养。

震荡培养并计数细胞，每24小时传代一次，直至细胞停止倍增。采用低感染复数（MOI）方案时，细胞必须至少倍增一次，否则应减少加入的V0体积后重复实验。左侧图像显示的是未感染的昆虫细胞在感染多角体病毒后的状态。

受感染的昆虫细胞已停止增殖，且体积增大，如右侧图像所示。在48至60小时后，通过沉淀细胞收获V一病毒。移除并保存含有病毒的培养基。

用新鲜培养基重悬细胞，并将其转移回锥形瓶中。每12或24小时，通过离心收集一乘以十的六次方个细胞，检测蛋白表达和标志蛋白信号，以便在需要更大表达量时进行监测。在2升摇瓶中，用V1病毒感染最多400毫升的细胞，以进一步扩增病毒。

在采用低感染复数（MOI）方案后，我们强烈建议使用病毒感染昆虫细胞（VIC）方法或杆状病毒感染的昆虫细胞来保存V一型病毒作为生产用病毒，以防止重组病毒发生修饰，并维持高水平的表达。观察到增殖停滞24小时后，收集感染的细胞沉淀。在此阶段，细胞内含有完整的病毒颗粒，此时病毒尚未释放到培养基中。

吸去培养基，将细胞沉淀重悬于冻存液中，并在冻存管中对BIIC进行冷冻，用于蛋白表达实验。使用V1、V2或冻存的BIC分装样品感染较大规模的细胞培养物，通常在2升摇瓶中培养400毫升培养液，并遵循低MOI操作方案。

调整用于感染的病毒体积，使感染后的细胞培养物至少倍增一次。如果存在YFP标记蛋白，则在规定时间间隔取样1 × 10⁶个细胞，超声处理并离心细胞，将样品转移至96孔板，在能够记录荧光信号的标准96孔板读数仪中测定YFP水平，持续监测YFP信号的变化直至达到平台期，表明重组蛋白的表达已达到最大水平。在此阶段收获细胞，将细胞沉淀短期保存于-20°C或长期保存于-80°C。应根据目标蛋白的特性选择适当的裂解方法裂解细胞，随后分离细胞质和细胞核。

分级分离的核蛋白通常存在于核沉淀中，而胞质蛋白则保留在胞质溶胶中。通过分级分离可大大简化蛋白质纯化过程。

由于许多污染物可通过单次离心步骤去除，因此可利用微型化纯化方法（如多孔板或微柱纯化）从小规模的初始细胞培养物中便捷地纯化蛋白质复合物。结合小体积层析系统（如ACTA micro），下一步的发展方向是将整个实验装置微型化并整合为可与克隆工作站联用的小型台式系统。

此处展示的是正在开发中的微尺度批量机器人，将用于此目的。通过如图所示的多拷贝系统，可实现异源蛋白的高效共表达。在全细胞提取物（WCE）和澄清裂解液中，过表达的蛋白条带清晰可辨。

所产生的蛋白质材料在质和量上通常均足够。可实现对蛋白质复合物的结构解析，例如本图所示的有丝分裂检查点复合物（MCC）。这些分析性纯化实验的产量通常足以通过多种方法分析纯化复合物的结构与功能，包括电子显微镜技术。

我们制定的标准操作流程使非专业用户也能轻松应用我们的方法，我们的技术可用于众多对大型蛋白质复合物感兴趣的研究实验室，就像如今在Nikola中研究小型蛋白质一样普遍。观看本视频后，您将充分了解如何使用多袋系统，以无与伦比的数量和质量生产您感兴趣的蛋白质复合物，助力实现雄心勃勃的研究目标。使用我们的系统无需特殊的安全部件条件。

然而，请注意，即使该病毒在您的细胞中无法复制，如果您操作不慎，仍可能被感染。因此，在进行此操作时，必须谨慎处理您的类固醇条件。我们的方法已经广受欢迎，全球已有超过600家实验室采用。

采用我们的技术。我们相信，未来该方法将成为大规模结构基因组学研究的重要组成部分，用于解析人类蛋白质复合物区域。这有助于揭示疾病的发生机制，并最终推动开发出更有效的新药和新疗法。