量化的内皮细胞糖复合物的力学性能，用原子力显微镜

以下实验的总体目标是使用原子力显微镜或 FM 测量内皮糖萼的机械性能。这是通过首先培养，在生物反应器中的生理流动下培养单层内皮细胞来实现的，以便作为第二步建立糖萼层。微米大小的珠子连接到 FM 悬臂上，并用作探针来测量压痕过程中细胞体和糖萼的阻力。接下来，用两层模型拟合压痕曲线，以确定糖萼模量和厚度，结果表明，根据两层分析，内皮糖萼的模量为 0.7 千克帕斯卡，厚度为 380 纳米。

大家好，我是 Rick Wa.我是罗切斯特大学生物医学工程系主任。近年来，关于内皮糖萼在炎症中可能的作用进行了很多讨论，特别是关于它是否可以作为保护屏障来防止炎症期间不必要的细胞粘附。解决围绕这个问题的问题的关键之一是能够在正常条件下和炎症反应期间测量物理特性，即该层的厚度和刚度。

我是 Graham Marsh。我是罗切斯特大学生物医学工程系的研究生。表征内皮糖萼的最大问题是它非常柔软。

我们想出的方法是将一个大珠子固定在 A 和 A FM 悬臂的尖端，以便测量的力可以用 A 解析 FM.To 开始此过程，构建一个流动室，如此处所示，能够在 1.0 帕斯卡的剪切应力下培养细胞。首先在食人鱼溶液中清洁载玻片 15 分钟，准备用于实验的流通室。用蒸馏水冲洗 3 次，然后在 70 摄氏度下干燥 30 分钟。

接下来，通过气相沉积用氨基丙基 trixi、cy lane 或 apte 包被载玻片。将 1 毫升 apte 添加到装有样品的真空室的烧瓶中。然后盖上培养瓶，用 0.7 bar 的真空真空反应 1 小时。

在此期间，将真空吸尘器刷新 3 次。接下来，使用 silhouette SD 切割工具从 0.4 毫米厚的硅胶片上切割出新的流动室垫圈。通道尺寸为 6.4 毫米宽 x 19 毫米长，外径被切割成 35 毫米，以便放入庇护培养皿中。

使用这些尺寸，计算产生 1 帕斯卡的绝对应力所需的流速，公式中所示。Q 代表流量。Tau 是纯粹的压力。

Mu 是介质的粘度。H 是通道高度，W 是流室的宽度。下一步是将流通室的顶部与细胞培养皿中的垫圈对齐，并用磁环固定。

将细胞培养皿中的流路端口连接到三个带有管路的 30 毫升注射器的波形阀。然后用异丙醇冲洗 5 分钟，对整个组件进行消毒。然后去除酒精，让它在组织中风干。

培养罩 将 4% 胎牛血清在 McCoy 培养基中预热至 37 摄氏度。晾干 5 到 10 分钟后，用 30 毫升预热的胎牛血清冲掉剩余的酒精。然后用 20 毫升 veek MCDB 1 31 生长培养基填充注射器。

接下来，盖上注射器以防止污染。将系统从无菌罩中移出时，将针头伸入液体中，将介质吸回上游储液槽，从而套上集水储液罐的盖子。最后，将 0.2 微米无菌过滤器连接到瓶盖上的进气口，然后收获人脐静脉。

内皮细胞在 T 25 培养瓶中生长汇合。将沉淀的细胞以每毫升 100， 000 个细胞的浓度悬浮在培养基中，然后将溶液吸入注射器中。然后通过三通阀将悬浮液注入流通室。

让细胞沉淀并粘附在玻璃基板上 2 小时。在开始流液之前，将生物反应器和细胞移至培养箱中，让细胞沉降并粘附 2 小时。将储液槽连接到蠕动泵的管道穿过培养箱的背面细胞粘附后，将蠕动泵设置为所需的流速。

介质在储液槽之间移动，产生压力水头和流经生物反应器的流动，从而产生 1 帕斯卡的壁面剪切应力。让细胞在 37 摄氏度下连续流动孵育 1 到 5 天，直到腔室汇合。要开始准备悬臂，请在硝酸中清洁尖端和 FM 悬臂 5 分钟，然后用蒸馏水冲洗。

干燥后，在气相沉积室中用 apdi 对悬臂进行功能化，如前面所示的载玻片。然后在 Hank 缓冲盐溶液中制备每毫升 5 毫克/毫升 NHS Sulf O lc、生物素溶液。将悬臂浸入溶液中 15 分钟。

该反应偶联 CY 和末端羟基氧化物，并在悬臂表面呈递生物素分子。前一天，将 20 毫升含有 20% 血清的 vexcel 培养基与 200 微升 strept ENC 包被的珠子混合，开始制备无生物素培养基溶液，并在旋转时孵育 12 小时。在实验当天。

用磁铁将磁珠拉至试管底部 2 分钟，然后将含有不含生物素的培养基的上清液转移到新试管中。将培养基通过 0.22 微米过滤器进行消毒，然后将其放入新管中。下一步是从细胞培养皿中取出流动室，然后用 2 毫升 37 摄氏度、不含生物素的培养基洗涤细胞 3 次。

然后加入 1 微克直径为 2.4 微米、剥离的 Aden 包被珠子。将 10 μg/mL 的浓度加入细胞培养皿中，并轻轻混合。接下来，通过将 A FM tib 连接到剥离针珠并将其压入普通玻璃表面来校准 A FM tib。

为了实现这一目的，将尖端降落在珠子旁边的玻璃表面上，缩回尖端，然后将悬臂的顶点放在珠子上并向下按压几秒钟。最后，使用校准的悬臂压痕样品。2.4 微米微珠与细胞表面的接触面积更大，因此更容易检测软糖萼层的机械特性。

为了完成这个位置，将悬臂悬臂放在细胞核附近的细胞上，用尖端轻柔地接近细胞，将悬臂高度设置在细胞表面上方约 3 微米处。然后以每秒 1 微米的速率将表面压痕 20 次，最大力为 7。纳牛顿允许在连续触点之间经过 6 秒钟的时间。

使用与赫兹理论相关的方程计算糖萼层的厚度。压痕力 F 由此方程描述，其中 delta 是压痕深度。R 是球体半径，estar 是材料在应力下的组合模量。

为了将组合弹性模量 estar 分离成细胞和糖萼成分，将糖萼层视为细胞体表面均匀的薄软膜，并使用 Clifford 的两层模型，C.In 该方程，PQ 和 N 由聚合物拟合凭经验确定为常数。M 是聚合物模型中的常数，Z 与薄膜或糖萼层的厚度有关，公式如下。以纳牛顿为单位测量的 A FM 测量的力在与表面接触后开始增加，最初由糖萼层成分主导。

一旦糖萼层被压缩，细胞体就成为变形的主要组成部分。蓝色的两层拟合线是通过拟合四个自由参数来计算的，以使其与使用的方程式中以红色显示的压痕数据相匹配，细胞模量、糖萼、层模量和糖萼层厚度都可以确定。将 25 个单元格的属性编译到此处显示的直方图中。

平均糖萼层模量确定为 0.7 正负 0.5 kipa cals，糖萼层厚度确定为 380 正负 50 纳米。这种方法为我们提供了回答有关糖萼在炎症期间调节细胞粘附中的作用的基本问题所需的工具。我们现在能够解决有关糖萼特性在炎症过程中如何改变的问题。

通过什么方式完成这些更改。此方法可以通过多种方式进行扩展。例如，人们可以用它来测试对糖萼特性的新颖、更复杂的理论描述。

或者在更实际的层面上，人们可能能够使用它来测试仿生表面涂层，旨在保护植入式设备免受宿主免疫反应的影响。非常感谢您对我们工作的关注。