Name: 量化的内皮细胞糖复合物的力学性能，用原子力显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 了解如何使用原子力显微镜直接测量内皮细胞糖复合物的力学性能，包括模量和厚度。该方法采用微米级珠粒探针和双层力学模型，为研究白细胞粘附与炎症机制提供定量数据。

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作者感谢Elena Lomakina、Richard Bauserman、Margaret Youngman、Shay Vaknin、Jessica Snyder、Chris Striemer、Nakul Nataraj、Hung Li Chung、Tejas Khire和Eric Lam在本项目中的协助。本项目由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号#PO1 HL 018208。

1. 方法
1.1 细胞流室
如图1所示，构建了一个流体腔室，使细胞可在1.0 Pa（10 dyn/cm2）的剪切力下培养，随后直接转移至Asylum MFP3D原子力显微镜（Santa Barbara, CA）中进行检测。
<ol>
	<li>通过以下步骤准备流动腔以进行实验：首先将玻璃载玻片在piranha溶液（3:1 H2SO4:H2O2）中清洗15分钟，然后用蒸馏水冲洗。随后将载玻片烘干，并在真空沉积室中用氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）进行包被。</li>
	<li>使用Silhouette SD切割工具切割硅胶垫圈。这使我们能够精确控制流动腔的尺寸，从而在细胞培养过程中调控流速和剪切应力。通常，从一张0.4 mm厚的硅胶片上切割出一个6.4 mm宽、19 mm长的通道。假设为矩形通道中的层流流动，生成1.0 Pa（10 dyn/cm2）剪切应力所需的流速可通过以下公式计算：</li>
</ol>
<img alt="流体动力学方程 Q=(1/6)(τ/μ)h²w，用于说明剪切应力与流动关系的公式。" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1"> 
其中 Q 为流速，τ 为剪切应力，μ 为培养基的黏度，此处假设为 1.0 mPa (0.01 dyn*sec/cm2)，h 为流动腔室的高度，w 为流动腔室的宽度。
<ol start="3">
	<li>将流室的上部部件与细胞培养皿中的垫圈对齐，并用磁力环固定。组装完成后，用异丙醇（IPA）填充以进行灭菌。</li>
	<li>完成整个流体系统的组装。将细胞培养皿中的流路接口连接至三通阀，三通阀再连接至开口的30 ml注射器。用异丙醇冲洗整个系统，随后用30 ml含4%胎牛血清（FCS）的McCoy's培养基洗涤系统。然后向系统中加入20 ml Vec Technologies细胞生长培养基。在注射器顶部盖上盖子，收集储液器注射器的盖子上装有针头，用于将培养基回流至供液储液器。在盖子的进气口处安装无菌0.2 μm滤器，以防止系统污染。流室系统此时即可用于细胞接种。</li>
</ol>
1.2 细胞培养
<ol>
	<li>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和培养基购自 Vec Technologies 公司（Rensselaer, NY），并在 T25 培养瓶中培养至融合。</li>
	<li>从培养瓶中移除培养基，加入 2 ml 2.5% 胰蛋白酶消化，使细胞单层解离。待细胞悬浮后，向培养瓶中加入 10 ml 细胞培养基以终止胰蛋白酶消化。</li>
	<li>将细胞悬液以 5 分钟离心，弃去上清液。将细胞重悬于 1 ml 含血清的细胞培养基中，用于注入流室。</li>
	<li>取 0.5 ml 细胞悬液（约含 50,000 个细胞）装入注射器，通过三通阀注入流室。</li>
	<li>细胞在无流动条件下静置 2 小时，使其沉降并贴附于玻璃基底。随后在 37 °C 培养箱中施加流动条件培养 1 至 5 天，直至形成融合单层。</li>
</ol>
1.3 悬臂梁制备与细胞压痕
<ol>
	<li>将无针尖的原子力显微镜悬臂梁（NanoWorld，瑞士）在硝酸中清洗5分钟，并在蒸气沉积室中用氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）进行功能化处理。</li>
	<li>配制5 mg/ml（质量浓度）的NHS-磺基-LC-生物素溶液于Hank's平衡盐溶液（HBSS）中。将悬臂梁浸入该溶液中15分钟，通过N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）化学反应将硅烷偶联。</li>
	<li>通过将20 ml Vec Technologies细胞培养基（含血清）与200 μl链霉亲和素珠在37 °C孵育12小时制备无生物素培养基；使用磁铁从培养基中去除珠子，并将培养基经0.22 μm无菌滤器过滤。</li>
	<li>从细胞培养皿中移除流动室，并用37 °C的无生物素培养基洗涤细胞。</li>
	<li>配制1 μl 2.4 μm链霉亲和素包被微珠溶于1 ml无生物素培养基中的储备液，取100 μl加入细胞培养皿中。</li>
	<li>通过将悬臂梁落于靠近微珠的玻璃表面，回撤，将悬臂梁顶端定位至微珠上方，然后将悬臂梁压向微珠并静置数秒，从而用悬臂梁拾取链霉亲和素微珠。</li>
	<li>通过在裸露玻璃区域进行压痕测量悬臂梁的灵敏度，并利用曲线斜率设定悬臂梁偏转与电压之间的关系。</li>
	<li>随后在MFP3D软件中通过热调校计算悬臂梁的弹簧常数。</li>
	<li>校准后的悬臂梁用于对样品进行压痕测试，如图2所示。这些2.4 μm微珠可提供更大的与细胞表面接触面积，从而能够检测柔软糖萼层的力学特性。将悬臂梁定位在细胞核附近的细胞上方，采用轻柔的接近方式使悬臂梁高度位于细胞表面约3 μm处。软件设置为以1 μm/sec的速度进行20次重复压痕，最大作用力为7 nN，连续两次接触之间间隔约6秒。可通过不同压痕速率检测糖萼的时间依赖性特性，但在本项初步实验中仅使用单一压痕速率（1 μm/sec）。</li>
</ol>
2. 压痕理论
使用半径为 R 的球体对弹性半空间进行压痕时，可通过赫兹理论描述，其中压痕力 F 由以下公式给出：
<img alt="静力学平衡方程；F=4/3E*R^(1/2)δ^(3/2)；力学公式；用于教学" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 2"> 
其中 δ 为压痕深度，E* 为被测材料的约化模量（图 3）。当无限刚性的压头压入均匀弹性半空间时，E* 由以下方程给出：
<img alt="弹性模量公式，E*=E/(1-ν²)，示意图，材料属性计算。" fo:content-width="0.757in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 3"> 
其中 E 为材料的弹性模量，ν 为材料的泊松比。近年来对聚合物薄膜的研究推动了双层模型的发展，用于测定薄膜的模量和厚度1。我们将该模型应用于细胞生物学，将糖萼视为覆盖在细胞体表面的一层均匀且柔软的薄膜。利用该模型，系统的约化模量变为：
<img alt="电化学势方程；E*=EGC+(Ecell-EGC)(Pzn/(1+Pzn+Qz))；公式说明。" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 4"> 
其中 EGC 为糖萼的模量，Ecell 为细胞体的模量，P、Q 和 n 为通过聚合物拟合经验确定的常数，z 由以下方程给出：
<img alt="化学电解中 z 的方程，包含 EGC 和 Ecell 的符号。" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 5"> 
其中 t 为糖萼层的厚度。图 3 展示了这些参数的示意图。该模型已被证明是测定较硬基底上薄膜模量和厚度的准确方法1。此方程可用于拟合对细胞进行压痕实验所获得的曲线，以确定内皮糖萼的模量和厚度，如图 4所示。

<ol><li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoindentation+measurement+of+young%27s+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson%27s+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li>
<li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li>
<li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li>
<li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li>
<li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv.+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li>
<li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们利用双层模型和赫兹理论计算得到的数值，模拟了在血液中循环的白细胞与内皮壁之间的相互作用。计算结果表明，在10 pN载荷下，直径为50 nm的白细胞微绒毛会陷入糖萼约150 nm，仅为糖萼总厚度的一小部分。这表明，根据本实验测得的特性，糖萼是细胞间相互作用的重要屏障，在白细胞黏附级联过程中可构成显著的空间位阻，细胞必须克服这一障碍才能完成黏附过程。
在本研究采用的模型中，我们将糖萼近似为各向同性的弹性结构。尽管目前尚无任何力学测量结果表明这一假设不成立，但关于糖萼分子结构的已知信息提示，这种简化可能过于粗略。事实上，糖萼是细胞表面一种复杂且具有异质性的结构。它包含具有取向性的分子结构，缺乏明确界定的外边界，并且在靠近细胞表面处的密度可能更高。因此，尽管本研究中使用的双层弹性模型有助于理解循环细胞所观测到的糖萼相对刚度，未来的研究可进一步探索其他力学描述方法，以考虑其可能存在的各向异性以及厚度方向上密度的变化。此外，糖萼在细胞表面不同区域的分布也可能并不均匀。这一点在当前数据集中未能体现，因为本文所有数据均采集自细胞中央核周区域。
<p class="jove_cont...

<table><tbody><tr><td>McCoy培养基</td><td>Gibco</td><td>16600-082</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30070</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基</td><td>Vec Technologies</td><td>MCDB-131</td><td></td></tr><tr><td>混合人脐静脉内皮细胞</td><td>Vec Technologies</td><td>PHUVEC/T-25</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>JT Baker</td><td>9681-02</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>VWR</td><td>BDH3742-1</td><td></td></tr><tr><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷</td><td>Aldrich</td><td>440140-100ML</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>VWR</td><td>BDH8999-4</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Cellgro</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>Hank's平衡盐溶液</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>磺基-NHS-LC-生物素</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠</td><td>Dynabeads</td><td>112.06D</td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D原子力显微镜</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无针尖悬臂梁</td><td>Nanoworld</td><td>ARROW-TL1-50</td><td></td></tr><tr><td>Silhouette SD切割仪</td><td>Quickutz</td><td>Silhouette-SD</td><td></td></tr><tr><td>硅橡胶</td><td>Stockwell Elastomerics</td><td>SE50-RS</td><td></td></tr><tr><td>30 ml注射器</td><td>Benton Dickinson</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>18号针头</td><td>Benton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>延长管组</td><td>Hospira</td><td>4429-48</td><td></td></tr><tr><td>四通阀</td><td>Teleflex</td><td>W21372</td><td></td></tr><tr><td>公/母端帽</td><td>Smith&amp;#8217;s Medical</td><td>MX491B</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Watson-Marlow</td><td>401U/D</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵管</td><td>Watson-Marlow</td><td>903.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>无菌滤器</td><td>Pall Life Science</td><td>4652</td><td></td></tr></tbody></table>

利用原子力显微镜量化内皮糖萼的机械特性

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

我们对白细胞捕获过程中白细胞与血管壁相互作用的理解，受限于对内皮表面层力学特性的认识尚不完整。已知白细胞上的黏附分子相对于表面形貌呈非均匀分布。 3，这种形貌限制了与其他表面形成粘附键 9，以及生理接触力（&asymp; 5.0 − 10.0 pN 每微绒毛）的力可将微绒毛压缩至其静息长度的三分之一左右，从而增加分子对对面表面的可及性 3, 7我们将内皮视为一种双层结构，包括相对刚性的细胞体和位于管腔表面的柔软保护性糖被 6研究表明，糖萼可作为屏障，减少白细胞与内皮表面的黏附 4在本报告中，我们开始探讨内皮表面的可变形性，以理解内皮机械刚度如何影响键合形成。在静态培养条件下生长的内皮细胞不表达完整的糖萼结构，而在生理流动条件下培养的细胞则开始接近观察到的糖萼状态 体内 2内皮细胞体的模量已通过原子力显微镜（AFM）测得，约为5至20 kPa 5糖萼的厚度和结构已通过电子显微镜进行研究 8，且糖萼的模量已通过间接方法进行估算，但据我们所知，目前尚无关于活细胞中糖萼模量直接测量的已发表报告。在本研究中，我们采用一种新型原子力显微镜探针，在细胞培养条件下最大化其糖萼表达，开展压痕实验，以直接测量内皮糖萼的模量和厚度。

在典型实验中，从细胞的特定区域（通常为核周区域，靠近细胞核但不在其上，距离约在 2 μm 范围内）获取 20 条力-距离曲线。为消除测量期间样品漂移的影响，对这些曲线进行对齐处理，并通过平均化以去除悬臂梁噪声，如图 4所示。采用为测定薄聚合物膜模量和厚度而开发的双层模型对曲线进行分析和拟合1。通过对 25 个细胞的曲线拟合结果分析，我们确定腔层的模量为 0.7 ± 0.5 kPa，厚度为 380 ± 50 nm，如图 5所示。细胞体的模量为 16 ± 6 kPa。这些数值与先前对细胞体模量及糖萼厚度的测量结果高度一致5, 8。
<img alt="色谱装置示意图；流体流动动力学；蛋白质纯化系统；实验室分析。" src="/files/ftp_upload/50163/50163fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"><b...

通过使用原子力显微镜悬臂上的微米级小球进行压痕实验，测量了内皮糖萼的力学特性。内皮细胞在定制腔室中于生理流动条件下培养，以诱导糖萼表达。采用薄膜模型分析数据，以确定糖萼的厚度和模量。

我们对白细胞捕获过程中白细胞与血管壁相互作用的理解，受限于对……的不完全认识

以下实验的总体目标是利用原子力显微镜或磁性镊子测量内皮糖萼的力学特性。首先，在生物反应器中于生理流动条件下培养一层内皮细胞，以形成糖萼层，此为第二步。将微米级小球连接到磁性镊子悬臂上，作为探针用于测量压痕过程中细胞本体及糖萼的阻力。随后，采用双层模型对压痕曲线进行拟合，以确定糖萼的模量和厚度。通过双层分析获得的结果显示，内皮糖萼的模量为0.7千帕，厚度为380纳米。大家好，我是罗切斯特大学生物医学工程系主任 Rick Wa。近年来，关于内皮糖萼在炎症过程中可能发挥的作用存在大量讨论，特别是它是否可能作为一种保护性屏障，防止在炎症期间发生不必要的细胞黏附。要解决围绕这一问题的争议，关键在于能够测量该结构的物理特性，即其在正常状态以及炎症反应过程中的厚度和刚度。我是格雷厄姆·马什（Graham Marsh），罗切斯特大学生物医学工程系的一名研究生。在表征内皮糖萼时面临的主要难题在于，它极其柔软。我们提出的方法是在原子力显微镜（AFM）悬臂末端附着一个较大的微珠，以便所测得的力能够通过原子力显微镜（AFM）清晰分辨。开始此操作前，构建一个如图所示的流动腔室，该腔室能够使细胞在1.0帕斯卡的剪切应力条件下生长。首先用“piranha”溶液清洗载玻片15分钟，以清洁流动腔室，然后用蒸馏水冲洗三次，并在70摄氏度下干燥30分钟，完成实验前的腔室准备工作。接下来，通过气相沉积法用氨基丙基三甲氧基硅烷（amino propyl triethoxysilane）、氯丙基三乙氧基硅烷（cy lane）或 APTES 对载玻片进行包被。将 1 毫升 APTES 加入与真空室相连并含有样品的烧瓶中。然后密封烧瓶，并在 0.7 巴的真空度下抽气 1 小时。在此期间，重复刷新真空三次。接下来，使用Silhouette SD切割工具从厚度为0.4毫米的硅胶片上切割出一个新的流室垫圈。通道尺寸为6.4毫米宽、19毫米长，外径切割为35毫米，以便能够适配于Asylum培养皿中。根据这些参数，利用此处所示公式计算产生一帕斯卡剪切应力所需的流速。Q 表示流速，Tau 表示剪切应力。μ 是介质的黏度。H 是通道高度，W 是流动室的宽度。下一步是将流动室的上部与细胞培养皿中的垫圈对齐，并用磁环固定。将细胞培养皿中的流路接口通过管路连接至三个波浪阀，并连接到30毫升注射器。然后用异丙醇冲洗整个装置五分钟，进行灭菌。随后移除异丙醇，并在组织环境中静置晾干。在培养罩中将含4%胎牛血清的McCoy's培养基预热至37摄氏度。静置干燥5到10分钟后，用30毫升预热的胎牛血清冲洗残留的酒精。然后用20毫升veek MCDB 131生长培养基填充注射器。接下来，盖上注射器帽以防止污染。当将系统移出无菌操作台时，将收集储液罐的帽盖安装好，并连接可伸入液体中的针头，以将培养基回抽至上游储液罐。最后，在下次收获人脐静脉时，将0.2微米的无菌滤器连接到帽盖的进气口上。在T 25培养瓶中生长至融合的内皮细胞。用培养基将沉淀的细胞重悬至100,000个细胞/毫升，吸入注射器中，然后通过三通阀将细胞悬液注入流动室。让细胞沉降并贴附在玻璃基质上，持续两小时。在开始流动之前，将生物反应器和细胞移入培养箱，使细胞在培养箱中继续沉降并贴附两小时。连接储液器与蠕动泵的管路从培养箱背部穿过。待细胞贴附后，将蠕动泵设定至所需的流速。培养基在储液器之间流动，形成压力差，使流体通过生物反应器，从而产生一帕斯卡的壁面剪切应力。在37摄氏度下持续灌注培养细胞一至五天，直至腔室内的细胞达到汇合状态。开始制备悬臂梁时，先将探针和FM悬臂梁在硝酸中清洗五分钟，随后用蒸馏水冲洗。干燥后，将悬臂梁置于气相沉积室中，用 apdi 进行功能化处理，方法与之前处理玻片的方法相同。然后，用汉克平衡盐溶液配制每毫升含五毫克 NHS Sulf O lc、生物素的溶液。将悬臂梁浸入该溶液中 15 分钟。该反应将CY与末端羟基氧化物连接，并在悬臂表面呈现生物素分子。实验前一天，通过将含有20%血清的20毫升Vexcel培养基与200微升链霉亲和素包被的磁珠混合，开始制备无生物素培养基溶液，并在旋转条件下孵育12小时。实验当天。将磁珠用磁铁吸附至管底，静置两分钟，然后将含有无生物素培养基的上清液转移至新管中。使用0.22微米滤膜过滤培养基以实现灭菌，并将其转移至新管中。下一步是将流室从细胞培养皿中取出，然后用两毫升37摄氏度的无生物素培养基洗涤细胞三次。然后向培养皿中加入一微克直径为2.4微米的去涂层腺病毒包被微珠，终浓度为每毫升10微克，并轻轻混匀。接下来，通过将原子力显微镜（AFM）探针尖端连接至一个去涂层微珠，并将其压入普通玻璃表面，以校准AFM探针。为了实现这一目标，先将探针尖端置于玻璃表面靠近微珠的位置，随后收回探针，再将悬臂的顶端定位至微珠上方，向下按压数秒。最后，使用已校准的悬臂对样品进行压痕测试。2.4 微米的微珠可提供更大的接触面积，与细胞表面接触时能更有效地检测柔软糖萼层的力学特性。为实现此定位，将悬臂置于细胞核附近的细胞上方，使探针以较轻柔的方式接触细胞表面，从而将悬臂高度设定在细胞表面以上约三微米处。随后以每秒一微米的速度对表面进行20次压痕，最大作用力为七纳牛，在连续两次接触之间间隔六秒。使用与赫兹理论相关的公式计算糖萼层的厚度。压痕力 F 由该公式描述，其中 delta 为压痕深度，R 为球体半径，estar 为受力材料的组合模量。为了将综合弹性模量 estar 分离为细胞和糖萼组分，可将糖萼层视为细胞体表面一层均匀的薄而柔软的膜，并采用 Clifford 和 C 提出的双层模型。在该方程中，PQ 和 N 是通过聚合物拟合经验确定的常数。M 是聚合物模型中的一个常数，Z 则与薄层或糖萼层的厚度通过此处所示方程相关联。原子力显微镜（A FM）以纳牛顿（nano Newtons）测得的力在接触表面后开始增加，初始阶段主要由糖萼层组分主导。当糖萼层被压缩后，细胞体成为变形的主要组成部分。通过拟合四个自由参数，计算出蓝色的双层拟合线，使其与红色所示的压痕数据相匹配，所用方程可确定细胞模量、糖萼层模量以及糖萼层厚度。来自25个细胞的特性数据被汇总成此处所示的直方图。糖萼层的平均模量确定为 0.7 ± 0.5 kPa，糖萼层厚度确定为 380 ± 50 纳米。该方法为我们提供了回答关于糖萼在炎症过程中调控细胞黏附作用这一基本问题所需的工具。我们现在能够探究糖萼的特性在炎症期间如何发生变化。 通过何种方式实现这些变化。该方法可以通过多种方式加以扩展。例如，可以利用该方法来检验关于糖萼特性的新颖且更为复杂的理论描述。或者从更实际的角度来看，人们或许可以利用这种方法来测试仿生表面涂层，这些涂层旨在保护可植入设备免受宿主免疫反应的影响。非常感谢您对我们工作的关注。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

量化的内皮细胞糖复合物的力学性能，用原子力显微镜

细胞外基质的刚度显著影响黏附细胞的多种行为。基质刚度在组织内存在空间上的差异，并在多种疾病状态下发生改变。本文中，我们建立了利用原子力显微镜微压痕技术来表征正常及纤维化小鼠肺组织中刚度空间变化的方法。...

利用原子力显微镜对肺组织进行微机械特性表征

本文展示了一种利用原子力显微镜（AFM）通过微压痕法表征活细胞力学特性的实验方案。...

利用原子力显微镜测量活细胞的机械特性

本文介绍了一种将多种单分子共价偶联到原子力显微镜（AFM）探针尖端的实验方案，并提供了测定这些分子在固体载体及生物界面黏附力和自由能的步骤与实例。...

通过原子力谱学研究单分子粘附

我们报告一种 体外 一种可定量内皮细胞单层中实际黏附细胞数量的方法。...

体外内皮细胞黏附性的定量分析 In Vitro

我们提供了从小鼠分离主动脉并利用原子力显微镜测量其弹性模量的详细实验方案。...

测量刚度 离体 利用原子力显微镜检测小鼠主动脉

我们提出了一种用于免疫学研究的原子力显微镜（AFM）悬臂梁功能化方案，可在其上固定单个T细胞和微粒。本文展示了利用AFM探测单对T细胞-树突状细胞结合的步骤，以及结合荧光成像技术，利用AFM实时监测巨噬细胞对单个固体微粒的细胞反应的方法。...

原子力显微镜悬臂的功能化：负载单个T细胞或单颗粒用于免疫学单细胞力谱分析

近紫外光刻技术与牵引力显微镜相结合，用于测量细胞在微图案化水凝胶上的作用力。通过靶向光诱导单个细胞释放，可在同一样本上进行大量测量。...

利用水凝胶图案化技术调控细胞黏附在牵引力显微镜中的应用

本方案介绍了一种用于软材料纳米压痕实验的完整工作流程，包括水凝胶和细胞。首先，详细阐述了获取力谱数据的实验步骤；随后，通过一款新开发的开源 Python 软件对这类数据进行分析，该软件可从 GitHub...

软物质纳米压痕的实验与数据分析流程

量化原子力显微镜（AFM）探针尖端与样品表面之间的接触面积及施加的力，可实现纳米尺度力学性能的测定。本文讨论了在空气或液体环境中，对软质和硬质样品实施基于AFM悬臂梁的纳米压痕技术以测量弹性模量或其他纳米力学性能的最佳实践方法。...

基于原子力显微镜悬臂的纳米压痕技术：在空气与液体环境中进行纳米尺度力学性能测量

我们近期发现视网膜毛细血管硬化是糖尿病相关视网膜功能障碍的一种新范式。本实验方案详细阐述了从小鼠视网膜毛细血管及视网膜内皮细胞培养物中分离视网膜毛细血管及其内皮下基质的步骤，随后介绍了利用原子力显微镜测量其硬度的技术方法。...

使用原子力显微镜测量小鼠视网膜毛细血管及其内皮下基质硬度的分离方法

本实验方案演示了如何制备小鼠肺组织的冷冻切片，进行原子力显微镜力图实验，并分析数据以测定天然小鼠肺基底膜的杨氏模量。...

从原子力显微镜力图中提取天然小鼠肺基底膜的杨氏模量

了解如何使用原子力显微镜直接测量内皮细胞糖复合物的力学性能，包括模量和厚度。该方法采用微米级珠粒探针和双层力学模型，为研究白细胞粘附与炎症机制提供定量数据。

利用原子力显微镜量化内皮糖萼的机械特性

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