Name: （TET-ON）与四环素诱导shRNA或cDNA表达生成稳定的人类细胞系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学习利用Tet-On系统生成稳定人类细胞系，实现四环素诱导的shRNA或cDNA可逆表达。该方法适用于难转染细胞，通过Western blot筛选克隆，为基因功能研究提供可靠工具。

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我们感谢实验室所有成员的有益讨论。感谢Joanna Lisztwan和Christina Gewinner对稿件的审阅。本工作由英国生物技术和生物科学研究所（BBSRC）资助项目BB/I021248/1以及惠康信托（Wellcome Trust）资助项目090090/Z/09/Z支持。A.H. 是伦敦大学学院（UCL）癌症研究所的惠康信托研究职业发展研究员。

1. pcDNA6_TetR_IRES_blast 的克隆
<ol>
	<li>如图3所示，使用限制性内切酶XbaI 和 NcoI 对 pcDNA6/TR 质粒（V1025-20，Invitrogen）进行部分消化，以去除 TetR 基因及杀稻瘟菌素抗性（BlastR）基因的启动子。分离出 4.6 kb 的载体片段。</li>
	<li>为去除 TetR 基因的多聚腺苷酸化序列，通过 PCR 在 TetR cDNA 的终止密码子后立即引入一个 XhoI 位点，同时保留 cDNA 5'端的 XbaI 位点。将所得片段通过限制性内切酶 XbaI 和 XhoI 亚克隆至 pMigR117 中，构建 pMigR1_TetR 质粒。</li>
	<li>使用限制性内切酶 XbaI 和 NcoI 消化 pMigR1_TetR 载体，释放 TetR_IRES 片段。分离出 1.25 kb 的插入片段。</li>
	<li>将 4.6 kb 的 pcDNA6/TR 片段与 1.25 kb 的 TetR_IRES 片段进行连接。将连接产物转化至感受态 E.coli 中，并利用标准分子生物学技术鉴定所需的 pcDNA6_TetR_IRES_blast 构建体。</li>
</ol>
2. 稳定表达 TetR 细胞系的构建
<ol>
	<li>第1天，接种1x10⁶细胞至每孔6 每10厘米组织培养皿使用标准培养基接种细胞（例如 DMEM 培养基中添加 10% FCS。接种两块培养板，一块用于转染 pcDNA6_TetR_IRES_blast，另一块作为杀稻瘟菌素筛选的阴性对照。应使用尽可能低的传代次数，并采用推荐的生长培养基。</li>
	<li>第2天，使用Fugene 6（E2691，Promega）按照制造商说明书，将2 μg pcDNA6_TetR_IRES_blast转染至其中一个培养板中。另一个培养板不进行转染。</li>
	<li>第3天，向两块培养板中加入含有5 μg/ml杀稻瘟菌素的标准生长培养基。请注意，不同细胞系的最佳筛选浓度可能有所不同，需预先确定。</li>
	<li>第4天，使用含5 mg/ml杀稻瘟菌素的完全培养基，将细胞按1/5、1/25、1/50和1/100的比例接种于10 cm培养皿中。务必正确标记含有未转染或转染细胞的培养皿。每个稀释比例准备两个培养皿。</li>
	<li>每天检查细胞，确保未转染的培养板中所有细胞在第一周内均已死亡。每2-3天更换一次筛选培养基。</li>
	<li>1至2周后，应开始出现抗杀稻瘟菌素的克隆。选择含有5至50个克隆的培养皿，以确保可挑取单个克隆。</li>
	<li>当菌落直径达到约5 mm（或更大）时，使用克隆环分离至少12个独立的克隆，挑取单个菌落。将每个克隆转移至24孔组织培养板中的单独孔内。待细胞长至融合后，将每孔中的细胞分种至6孔组织培养板中的一个单独孔内。</li>
	<li>继续在筛选培养基中培养克隆。当细胞长至融合时，将每个孔中的细胞分种到6孔组织培养板的两个单孔中。</li>
	<li>针对每个待检测的克隆，将一孔汇合的细胞冻存，另一孔细胞用于后续免疫印迹检测。</li>
	<li>使用小鼠单克隆 anti-TET02 抗体（MoBiTec GmbH）通过 Western 印迹检测 TetR。请务必以亲本细胞系的裂解液作为阴性对照。</li>
	<li>选择TetR表达水平最高的3个克隆，分别扩大培养。尽快冻存每个有潜力克隆的菌种。最后，通过比较亲本细胞系与表达TetR的克隆，检测目标分子和细胞生物学参数。从中选出TetR表达最高且目标分子和细胞生物学参数未发生任何改变的“最佳”克隆。</li>
</ol>
3. 表达shRNA或cDNA的pTER和pT-Rex DEST30载体的初步测试
<ol>
	<li>按照文献12所述方法构建含有shRNA插入片段的pTER质粒。利用Gateway技术（Invitrogen）构建含有目的cDNA的pT-Rex DEST30载体（12301-016，Invitrogen）。若进行cDNA表达，可在cDNA上添加标签，以便后续检测外源表达的蛋白质。</li>
	<li>使用所选转染试剂，将pTER或pT-Rex DEST30质粒（分别表达目标shRNA或cDNA）瞬时转染至亲本靶细胞系中。在测试shRNA表达质粒时，应确保实现较高的转染效率。</li>
	<li>收集转染后的细胞，并使用适当的抗体进行免疫印迹分析，预期可检测到目的基因的表达降低或过表达。</li>
</ol>
4. 使用 pTER 或 pT-Rex DEST30 载体构建可诱导型四环素（Tet-on）shRNA 或 cDNA 稳定表达细胞系
<ol>
	<li>第1天，使用添加了经认证的无四环素血清（例如 Invitrogen 的 FBS；货号 16000-014）的标准培养基，将“最佳”的 TetR 表达克隆细胞以每10 cm培养皿 1×106 个细胞的密度接种。接种一个培养皿用于 pTER（或 pT-Rex DEST30）转染，另一个培养皿作为双重筛选的阴性对照。务必使用尽可能低的传代次数。</li>
	<li>第2天，使用 Fugene 6 将 2 μg 的 pTER（或 pT-Rex DEST30）质粒转染至其中一个培养皿，另一个培养皿不进行转染。</li>
	<li>第3天，在标准培养基中加入 5 μg/ml 杀稻瘟菌素（blasticidin）和 500 μg/ml 博来霉素（zeocin）（或 1 mg/ml G418），并更换培养基。</li>
	<li>第4天，将细胞以 1/5、1/25、1/50 和 1/100 的比例传代至新的 10 cm 培养皿中，使用含 5 μg/ml blasticidin 和 500 μg/ml zeocin（或 1 mg/ml G418）的标准培养基。每个稀释梯度准备两个培养皿。</li>
	<li>每天观察细胞状态，确保在第一周内未转染的培养皿中所有细胞均已死亡。每 3–4 天更换一次含 blasticidin 和 zeocin（或 G418）的标准培养基。</li>
	<li>2–3 周后，应出现对 blasticidin/zeocin（或 blasticidin/G418）双重抗性的细胞克隆。选择每个培养皿中克隆数在 5 至 50 个之间的培养皿，用于挑取单克隆。</li>
	<li>当克隆直径达到约 5 mm（或更大）时，使用克隆环挑取单个克隆。至少分离 24 个独立的单克隆，并将每个克隆转移至 24 孔细胞培养板的一个独立孔中。</li>
	<li>在含维持浓度的 blasticidin（5 μg/ml）和 zeocin（250 μg/ml）[或 G418（0.5 mg/ml）] 的培养基中培养克隆。当细胞达到汇合状态时，将每孔细胞传代至 6 孔细胞培养板中的一个孔。</li>
	<li>对于每个待检测的克隆，将 6 孔板中一个汇合的孔细胞分至三个新的孔中。当细胞再次汇合后，冻存其中一个孔的细胞，其余两个孔用于检测四环素诱导表达。向其中一个孔加入浓度为 1 μg/ml 的四环素，另一个孔则不加四环素。</li>
	<li>四环素处理 24 至 96 小时后，收集细胞并使用适当的抗体进行免疫印迹分析。在筛选 cDNA 表达诱导时，建议采用较短的四环素处理时间；而在检测 shRNA 介导的内源蛋白耗竭时，则需更长的处理时间。</li>
	<li>选择至少两个具有理想蛋白耗竭或过表达效果的克隆进行扩增培养。尽快冻存每个有潜力克隆的细胞储备。在后续实验中培养 Tet-on 克隆时，务必始终使用添加了无四环素血清以及相应筛选抗生素（维持浓度）的培养基。</li>
</ol>

<ol><li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268, 1766-1769 (1995).</li>
<li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNAs+%28shRNAs%29+induce+sequence-specific+silencing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.</a> Genes Dev. 16, 948-958 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated%2C+inducible+small-interfering-RNA+vector%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li>
<li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li>
<li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NDR%2FLATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li>
<li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A%2FMST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li>
<li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们认为，Tet-on 系统极大地促进了基因功能的研究，特别是在难以操作的细胞体系中，或当目标基因对细胞存活至关重要时尤为适用。此外，利用高度特异性的 Tet-on 系统调控基因表达的能力，使得研究人员能够在不同发育阶段（例如细胞周期进程或明确的分化过程）研究基因功能。本文所介绍的方法将使研究人员能够在合理的时间范围内（通常为 3–6 个月，具体时长主要取决于对 TetR 阳性细胞系进行分子和细胞生物学表征所需的程度）建立所需的稳定 Tet-on 细胞系。然而，Tet-on 细胞系的成功构建与应用在很大程度上依赖于多个关键因素。
首先，需要筛选出 TetR 表达水平足够高的细胞，以确保在无四环素存在的情况下对转录产生严格抑制。同样重要的是，对表达 TetR 的目标细胞进行初始表征时，应涵盖所有将在长期研究中涉及的分子和细胞生物学参数。根据我们的经验，一个经过充分表征的 TetR 阳性细胞系是开展多项研究项目的良好起点。
第二，在测试和分析用于 shRNA/cDNA 表达的 Tet-on 克隆时，必须尽可能保持四环素浓度最低，以...

<table><tbody><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>经测试无四环素</td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素（Blasticidin）</td><td>Invivogen</td><td>ant-bl-1</td><td> </td></tr><tr><td>博莱霉素（Zeocin）</td><td>Invivogen</td><td>ant-zn-5</td><td> </td></tr><tr><td>G418</td><td>PAA laboratories</td><td>P31-011</td><td>培养基中浓度为 100 mg/ml</td></tr><tr><td>抗-TET02 抗体（anti-TET02）</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>TET02</td><td>用于 WB 时稀释比例为 1/1000 至 1/2000</td></tr><tr><td>pcDNA6/TR</td><td>Invitrogen</td><td>V1025-20</td><td> </td></tr><tr><td>pT-Rex DEST30</td><td>Invitrogen</td><td>12301-016</td><td> </td></tr><tr><td>四环素（Tetracycline）</td><td>Sigma</td><td>87128</td><td>乙醇中浓度为 2 mg/ml</td></tr><tr><td>多西环素（Doxycycline）</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>水中浓度为 2 mg/ml</td></tr><tr><td>克隆环（Cloning cylinders）</td><td>Bellco Glass Inc.</td><td>2090-00808</td><td>可重复使用</td></tr></tbody></table>

建立可稳定表达四环素诱导型（tet-on）shrna或cdna的人源细胞系

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

在哺乳动物细胞生物学领域，一种主要的研究方法是在特定细胞系中调控目的基因的表达水平，通过目的基因的瞬时/稳定过表达或表达敲低，以揭示其一种或多种功能。然而，当基因表达的调控导致细胞生长/增殖缺陷或非预期的细胞分化时，该方法在多种细胞生物学研究中并不适用。因此，研究人员借鉴了来自大肠杆菌（E. coli）四环素抗性操纵子1的四环素阻遏蛋白（TetR），构建出高效且严密的基因调控系统，用于在哺乳动物细胞中表达cDNA2,3。简而言之，TetR已被改造为两种形式：（1）在加入四环素后结合启动子区域的四环素操纵序列（TO），从而阻断转录起始（称为Tet-off系统）；或（2）在无四环素存在时结合TO（称为Tet-on系统）（图1）。由于Tet-off系统需要持续存在四环素（其在组织细胞培养基中的半衰期约为24小时），使用上较为不便，因此Tet-on系统得到了更广泛的优化，从而发展出如本研究所采用的极为严密且高效的cDNA表达载体系统。
在哺乳动物细胞中建立RNA干扰（RNAi）以实现基因敲低后不久4，即有研究报道了表达短发夹RNA（shRNA）的载体，其功能与siRNA非常相似5-11。然而，这些由shRNA介导的敲低方法与传统的基因敲除策略具有相同的局限性，因为当目的基因对细胞存活至关重要时，无法实现稳定的基因耗竭。为克服这一局限性，van de Wetering et al.12 对shRNA表达载体pSUPER5进行了改造，在其启动子区域插入了一个四环素操纵子（TO），从而能够构建出可诱导四环素调控的目标基因稳定敲低的细胞系。
本文介绍一种高效生成稳定的人源Tet-on细胞系的方法，该方法可可靠地诱导目的基因的过表达或敲低。利用该方法，我们已成功构建了多个Tet-on细胞系，显著促进了对中心体13,14和凋亡信号通路中MST/hMOB/NDR级联反应的分析15,16。在本报告中，我们除介绍所选用的载体外，还将详细描述高效构建人源Tet-on细胞系所需的两个连续操作步骤（图2）。此外，除了概述人源Tet-on细胞系的构建方案外，我们还将讨论与技术操作及Tet-on细胞鉴定相关的关键要点。

在图4中展示了稳定表达TetR的RPE-1细胞系的初步表征示例。请注意，所有RPE-1克隆均表达不同水平的TetR（比较泳道2和5），而亲本细胞系（作为阴性对照）不表达外源性TetR蛋白（图4，泳道1）。RPE-1 Tet-on细胞克隆间TetR表达水平的差异是预期之中的，因为表达TetR的质粒的表达水平高度依赖于质粒的整合位点。
对表达靶向MST3激酶shRNA的稳定RPE-1 Tet-on细胞克隆进行表征的结果表明，需要测试多个克隆，以确定目标基因敲低效率最高的细胞系（图5）。在本示例中（图5），选择克隆#1、#2和#3进行进一步分析。敲低效率存在差异是预期现象，因为shRNA的表达水平高度依赖于质粒的整合位点。
<img src="/files/ftp_upload/50171/50171fig1.jpg" al...

一种快速、简便的方法，可生成具有可诱导且可逆的cDNA过表达或shRNA介导的目标基因敲低的人源细胞系。该方法使研究人员能够可靠且高度可重复地操控那些难以通过瞬时转染方法或传统敲低/敲除策略进行改造的细胞系。

建立可稳定表达四环素诱导型（Tet-on）shRNA或cDNA的人源细胞系

哺乳动物细胞生物学领域的一个主要方法是在选定的细胞系中调控目的基因的表达，旨在……

本实验的总体目标是构建可由四环素诱导、稳定表达S-H-R-N-A或cDNA的人源细胞系。首先，将靶细胞转染tatar表达质粒，并通过博来霉素抗性进行筛选。随后挑取单克隆菌落，筛选能够稳定表达Tet阻遏蛋白的细胞株。接下来，将表达效果最佳的teta克隆与设计用于在Tet反应元件调控下调节目的基因表达的质粒进行转染。对转染后细胞施加双重筛选，挑取单克隆并通过对蛋白进行Western印迹分析来筛选理想的Teton克隆。最终，获得的Teton克隆可用于研究特定靶基因对选定生物学参数的影响。演示该实验步骤的将是一位实验室的博士后。Marty Gomez Martinez 生成一个表达载体，该载体利用同一 CMV 启动子在两个 10 厘米的组织培养皿中同时驱动 Tet 抑制蛋白和 Blain 抗性基因的表达，每个培养皿接种一次，六孔细胞置于标准生长培养基中，其中一个培养皿用于转染 tatar 表达质粒，另一个作为 Blain 筛选的阴性对照。第二天，使用 FUgene six 转染试剂，将 2 微克 TTA 表达质粒转染至其中一个培养皿中。根据制造商的说明，将培养物在两种培养皿旁边过夜孵育。24小时后，加入含有实验所用细胞系最佳浓度杀稻瘟菌素的标准生长培养基，收集细胞，然后标记10厘米培养皿用于系列稀释，并使用含有5微克/毫升杀稻瘟菌素的标准生长培养基进行系列稀释的重复接种。务必正确标记含有未转染或转染细胞的培养皿。观察细胞，特别注意未转染培养皿上的所有细胞在第一周内均已死亡。当抗筛选剂的菌落出现后，即接种后一至两周，每两到三天更换一次筛选培养基。选择含有5至50个菌落的培养皿，以确保在菌落直径达到约5毫米时能够挑取单个菌落。使用克隆环挑取单个菌落，分离至少12个独立的克隆。将每个克隆转移至24孔板的单独孔中，培养至细胞汇合。收获每个克隆的细胞，并将其转移至6孔组织培养板的各个孔中。当细胞培养至汇合时，继续在筛选培养基中培养这些克隆。将每个孔中的细胞分种到六孔组织培养板中的两个单独孔中。针对每个待检测的克隆，冻存其中一孔的汇合细胞，收集另一孔的细胞，用于评估靶蛋白的表达水平。使用亲本细胞系的裂解液作为阴性对照，通过蛋白质印迹检测克隆中的塔塔蛋白。使用小鼠单克隆抗 Tet zero two 抗体。继续扩增测试表达水平最高的三个克隆。尽快冻存每个有前景的克隆株。现在克隆细胞已准备好用于检测您感兴趣的分子和细胞参数。通过将亲本细胞系与表达tatar的克隆进行比较，筛选出tatar表达水平最高且在所关注的分子和细胞生物学参数方面未显示任何改变的最佳克隆。构建含有目标HRNA插入片段的PTER质粒。同时利用Gateway技术，将目标cDNA克隆至PT REX desk 30载体中。将PTER或P T-Rex S 30质粒瞬时转染至亲本靶细胞系中。使用选定的转染试剂进行转染。随后收集转染后的细胞，并通过免疫印迹法检测目的基因的表达。在第一天，用添加了经认证不含四环素的血清的标准生长培养基，将两个平板的最优四环素表达克隆置于培养箱中过夜培养。第二天，仅使用 FU gene six 转染一个培养板，加入两微克 A-S-H-R-N-A 或 cDNA 表达质粒。第三天，在标准生长培养基中加入终浓度为每毫升五微克的 blastin 和每毫升 500 微克的 eosin，或 blastin 和 G four 18。第四天，用标准生长培养基将细胞传代，制备用于双重筛选的重复稀释培养板。每天观察细胞对抗生素处理的细胞死亡反应，并每三到四天更换一次培养基。两到三周后，当在Zeocin或G418中出现双抗性克隆时。选择含有5至50个菌落的平板，挑取单菌落进行培养，直至菌落直径达到约5毫米或更大。使用克隆环挑取单菌落，并将其转移至24孔细胞培养板的不同孔中进行培养。在培养基中加入维持浓度的5微克/毫升杀稻瘟菌素（blaster）、soin以及50微克/毫升的相应试剂。伊红或爆破细胞处理及G四18。当细胞融合时，将每个孔中的细胞分种到六孔组织培养板的一个单孔中。当细胞融合时，将细胞分种至六孔板的三个孔中，培养至100%融合。冻存一个孔中的细胞以检测诱导型表达，在其中一个孔中加入每毫升一微克的四环素，另一个孔的细胞则不加四环素。在不含四环素的条件下孵育24至96小时，较短时间用于筛选CD NA表达的诱导效果，较长时间用于确定S-H-R-N-A介导的内源蛋白耗竭情况。随后收集细胞，并使用相应的抗体进行免疫印迹分析。选择至少两个具有目标敲低或过表达效果的克隆，并分别扩大培养。请尽快为每个有前景的克隆保存菌种。该人视网膜色素上皮细胞系用于稳定表达tatar的初步表征结果显示，所有RPE1克隆均表达了不同水平的tatar。正如预期，亲本RPE1细胞系不表达外源性tatar蛋白。RPE1 Tet-On细胞克隆间Tet R表达的差异反映了质粒整合位点的不同。本实验对稳定表达靶向MST3激酶的RNA的RPE1 Tet-On细胞克隆进行了表征，并选取了三个克隆用于进一步分析。观看本视频后，您将充分了解如何构建稳定的人源细胞系，以实现目标研究用RNA或cDNA的非调控性表达。

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（TET-ON）与四环素诱导shRNA或cDNA表达生成稳定的人类细胞系

检测了ACF染色质重塑因子在E4orf4诱导的细胞死亡中的作用。该实验方案包括筛选在强力霉素处理下可诱导性敲低ACF亚基Acf1和SNF2h的细胞克隆，并利用DAPI染色法测定在可诱导细胞系中E4orf4诱导的细胞死亡。...

为条件性敲低基因表达及检测其对E4orf4诱导细胞死亡的影响制备细胞系

本视频展示了在小鼠模型中使用四环素（Tet-On）基因表达系统。在多西环素（一种四环素衍生物）存在的情况下，Tet-On...

基于可诱导 Tet-On 调控系统的体内基因表达：小鼠模型中四环素诱导的目标基因转录激活系统

本视频介绍了通过将含有目的基因的质粒和调控质粒共转染培养细胞来调控基因表达的方法。该质粒的表达可由四环素或其合成类似物进行控制，因此该系统是研究可调控基因表达的有用模型。...

可诱导的 Tet-Off 调控系统：利用四环素-关闭系统在培养细胞中进行基因表达调控的体外方法

本实验利用逆转录病毒转导和串联转染技术，构建一种可在无四环素条件下表达慢病毒载体（LV）各组分的细胞系。该慢病毒载体编码绿色荧光蛋白（GFP），并假型化携带一种糖蛋白SVGmu，后者特异性识别树突状细胞表面的受体。...

一种受四环素调控的细胞系可产生高滴度慢病毒载体，特异性靶向树突状细胞

本文介绍一种通过将具有目标抗原特异性的现有T细胞受体（TCR）的TCRα或TCRβ链，与外周T细胞受体库中的互补半链配对，从而生成抗原特异性T细胞受体（TCR）的新方法。de...

生成中 从头合成 通过逆转录病毒转导中心半链获得抗原特异性人T细胞受体

通过异源表达系统研究离子通道已成为生物医学研究中的一项核心技术。在本论文中，我们介绍一种高效的时间控制方法，通过在可诱导启动子调控下进行瞬时转染，实现对离子通道表达的精确调控。...

通过可诱导瞬时转染实现离子通道表达的可控调控

本方案旨在介绍如何在癌细胞系中建立功能性Tet-ON系统，并进一步应用该系统，特别是用于研究肿瘤细胞来源的蛋白质在单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境募集过程中的作用。...

在癌细胞系中条件性敲低基因表达以研究单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境的募集

本文介绍了一种显性负性可诱导系统的构建方案，该系统可通过可逆地过表达目标蛋白的显性负性突变体，从而实现对任意蛋白的条件性失活。...

可诱导且可逆的显性负效应（DN）蛋白抑制

本文介绍了一种工具，可用于通过诱导型表达系统结合移液管电穿孔技术，研究转录后水平对原代肺泡上皮细胞中转录本的调控作用。...

用于研究原代肺泡上皮细胞中mRNA转录本稳定性的高效转录调控质粒表达系统

在本实验方案中，我们介绍了一种利用条件性敲低系统和改良的成球形成实验来研究簇集素（clusterin）对患者来源的胃癌干细胞（GCSCs）干性影响的研究设计。该方案可轻松调整，用于研究不同类型肿瘤干细胞（CSCs）中与干性相关基因的体外和体内功能。...

联合条件性敲低与改良的成球实验用于研究患者来源的胃癌干细胞中与干性相关基因的功能

学习利用Tet-On系统生成稳定人类细胞系，实现四环素诱导的shRNA或cDNA可逆表达。该方法适用于难转染细胞，通过Western blot筛选克隆，为基因功能研究提供可靠工具。

建立可稳定表达四环素诱导型（Tet-on）shRNA或cDNA的人源细胞系

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