Name: 使用强迫振动技术在小鼠呼吸系统力学评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 了解使用强迫振动技术在小鼠呼吸系统力学评价的方法。本方案演示如何通过flexiVent系统评估气道对吸入乙酰甲胆碱的反应性，为呼吸生理学研究提供准确、可重复的肺功能测量工具。

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TKMcG 获得加拿大胸科学会研究生奖学金的支持。
作者贡献
 所有作者均参与了论文的构思。此外，TKMcG 发起了该项目，收集了实验结果，并参与了论文的撰写及其关键性审阅。AR 收集并分析了实验结果，起草了论文，并参与了其关键性审阅。LF 收集了实验结果，并参与了论文的关键性审阅。TFS 和 JGM 参与了论文的关键性审阅。

以下所述实验方案已获得麦吉尔大学机构动物护理委员会批准，符合加拿大动物护理委员会（CCAC）的指导方针。
1. 准备步骤
<ol>
 <li>溶液：
 <ol>
 <li>乙酰甲胆碱：配制50 mg/ml的储备液，并根据待测试的浓度进行连续倍比稀释（1:1）5。雾化前使溶液恢复至室温5。</li>
 <li>麻醉剂：文献中已报道在不同品系小鼠中使用不同的麻醉方案（表1）。注意：本实验方案采用方案1。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>设备：本实验方案适用于由flexiWare 7软件支持的任一代flexiVent系统。软件功能分为三个模块：研究设计与规划、实验会话和回顾与报告。
 <ol>
 <li>开启系统（仅适用于flexiVent FX）和/或启动软件。</li>
 <li>在首次实验会话或任何会话之前，打开研究设计与规划模块，预先定义研究结构。</li>
 <li>点击创建新研究按钮，并按照向导创建研究、规划实验方案以及定义实验分组和受试对象。</li>
 <li>通过打开实验会话模块并按照启动流程选择研究和模板，开始实验会话。</li>
 <li>将受试对象分配至测量位点，并确认其体重。</li>
 <li>按照操作软件中描述的步骤进行系统校准。在某一阶段，系统会提示您将用于校准的套管（步骤1.3.3）连接至Y型管。</li>
 <li>关键步骤。 若获得的校准值超出可接受范围，请重复步骤1.2.6。（具体可接受范围请参见flexiVent FX或flexiWare 7用户手册中对应模块的说明）。</li>
 <li>除非已准备好开始实验，否则取消启动通气和数据记录的提示。这些操作可在后续时间点启动。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>受试对象：
 <ol>
 <li>使用适当剂量的麻醉剂对受试对象进行麻醉（表1）。</li>
 <li>确认受试对象已达到外科手术深度的麻醉状态。受试对象应对脚趾夹捏无反应，且呼吸规律、无费力表现。</li>
 <li>行气管切开术并对气管插管。
 <ol>
 <li>将动物仰卧位固定，并提供热源（例如，温度可控的加热垫，或距离小鼠约45 cm、使用60瓦灯泡的照明灯，以避免过度加热）。</li>
 <li>用酒精清洁喉部区域，通过皮肤切口暴露气管，并轻轻分离下颌下腺及覆盖其上的肌层。</li>
 <li>使用一对显微镊子轻轻提起气管，并在其下方穿过缝合线。</li>
 <li>在靠近喉部的两个软骨环之间剪开，形成气管小切口，但不完全切断气管。</li>
 <li>将预先校准的套管插入切口，并轻柔推进气管内，深度约为5个软骨环的长度。注意：本实验使用长度为1.2 cm、18号金属套管。</li>
 <li>关键步骤。 使用缝合线固定套管，确保套管周围形成密闭的气密封。</li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. 机械通气
<ol>
 <li>将动物移近呼吸机。</li>
 <li>在呼吸机控制软件中选择预设或自定义的通气模式，启动机械通气。</li>
 <li>通过Y型管路将动物连接至呼吸机。</li>
 <li>关键步骤。 调整动物位置，使其与呼吸机对齐，并确保气管插管与呼吸机处于同一水平，以避免插管堵塞或气管扭曲。</li>
 <li>关键步骤。 通过双击扰动名称执行一次深部充气扰动，以验证插管插入和连接情况。若无漏气，系统应能在3秒内维持30 cmH2O的压力，且容积位移不过大（图1）。记录的容积和压力曲线应平滑，无偏移或变形迹象，否则可能提示插管阻塞或位置不当。</li>
 <li>必要时，连接用于监测心率和体温的生命体征传感器。数据记录可通过手动或脚本自动启动。</li>
</ol>
3. 肺功能测量
可使用预定义或自定义脚本自动执行测量或指令（例如 雾化器激活、事件标记），以实现高度受控且可重复的实验过程（图2）。可通过六类扰动及其产生的多个参数，用于描述受试者在基线状态及特定刺激后的呼吸系统力学特性（表2）。
<ol>
 <li>关键步骤。准备开始测量时，执行一次深部充气，以开放闭合的肺区域，并标准化肺容积历史。</li>
 <li>关键步骤。通过运行一次测试测量（例如 PVs-P 或 PVs-V）来确认不存在自发吸气努力。在选定数据集视图中观察压力信号曲线。对于分步式PV曲线，压力平台应清晰明确，无向下偏转。若压力出现向下波动，则提示动物存在吸气努力（图3）。</li>
 <li>通过双击脚本标题启动所选脚本。本研究中使用的脚本通常包括以下测量步骤：
 <ul>
 <li>进行三次重复的基线测量。</li>
 <li>启动雾化器，以评估气道对吸入乙酰甲胆碱的反应性。注意：当系统提示时，向雾化器中加入约100 μl生理盐水或乙酰甲胆碱溶液。雾化将自动开始和停止。</li>
 <li>在启动雾化器后，持续约3分钟，每隔10-15秒进行一次密集测量。</li>
 <li>系统将提示进行下一次激发，并重复一组测量。注意：两次激发之间，用棉签擦拭雾化器接口内部，有助于防止吸气管路中积聚液滴或冷凝水。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>实验结束时，停止通气并移除受试对象。</li>
 <li>在操作软件中切换至下一个受试对象，并确认其体重。</li>
 <li>关键步骤。在不同受试对象之间，清洗并干燥雾化器、适配器、Y型管和插管。</li>
 <li>重复步骤1.2.6至3.6。</li>
 <li>当日实验结束后，关闭实验会话。离开实验室前，请务必按照制造商说明清洗并干燥雾化器、适配器、Y型管和插管，并清洁系统呼气阀。</li>
</ol>
4. 数据分析
该软件会自动计算并显示与扰动相关的参数，同时提供一个决定系数（COD），用于反映数学模型对数据的拟合程度。任何决定系数不足的数据集均会被软件标记为已排除。实验环节的审查、数据的重新分析以及导出方案的创建均在软件的审查与报告模块中完成。
<ol>
 <li>打开审阅与报告模块，并创建导出方案，注意仅包含具有足够COD的数据集。</li>
 <li>根据需要将参数、压力-或流量-容积曲线、原始数据集信号或受试者信息导出至电子表格应用程序（参见表3）。</li>
 <li>计算每个参数的基线测量平均值，并将所有测量值随时间变化作图（参见图4）。随后可选择计算曲线下面积、分析曲线的整体形态，或进行统计学分析。</li>
 <li>为将气道反应性结果表示为乙酰甲胆碱浓度的函数，需针对每位受试者、每个参数和实验条件，确定每次乙酰甲胆碱激发后的特定时间点（例如峰值）或特定时间。计算各组平均值，并报告或绘制每种实验条件下的结果（表4，图5）。</li>
 <li>也可考虑计算使某一参数基线值增加一倍所需的乙酰甲胆碱浓度（PC200；图5C），或应用归一化处理（例如基线百分比）或进行统计学分析。</li>
</ol>

<ol><li>Bates, J. H. T., Irvin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lung+function+in+mice%3A+the+phenotyping+uncertainty+principle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle.</a> J. Appl. Physiol. 94, 1297-1306 (2003).</li>
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<li>Hantos, Z., Daroczy, B., Suki, B., Nagy, S., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input+impedance+and+peripheral+inhomogeneity+in+dog+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Input impedance and peripheral inhomogeneity in dog lungs.</a> J. Appl. Physiol. 72, 168-178 (1992).</li>
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</ol>

AR、LF 和 TFS 供职于 SCIREQ Scientific Respiratory Equipment Inc.，其中 TFS 还持有该公司股票。 本文的免费访问由 SCIREQ Scientific Respiratory Equipment, Inc. 赞助提供。

持续研究气道功能障碍与哮喘及其他肺部疾病的关系，对于理解疾病的潜在机制以及开发治疗方案至关重要。利用小鼠建立气道疾病模型，在揭示这些疾病机制方面发挥了关键作用。当研究对象仅为小鼠大小时，拥有可靠且准确的工具来测量肺功能显得尤为关键。此外，若工具还能提供有关气道功能障碍或治疗效应具体位置的信息，则更具价值。强迫振荡技术（FOT）结合了上述所有优势，为评估生理变化提供了一种强大、整合性强且具有转化意义的研究方法。
为了在小鼠中成功进行此类测量，需特别关注几个步骤，即系统的校准、气管插管的阻力、雾化器的类型（及其操作设置）、动物的体位以及肺容积历史的标准化。此外，为获得有效的数据集，必须确保受试动物的呼吸系统在测量过程中保持被动状态。这可以通过给予肌肉松弛剂、在较深的麻醉水平下操作，或通过过度通气诱导呼吸暂停来实现（见表1）。研究者可根据需要，先使用测试负载掌握系统及其操作软件，同时获取在小鼠中进行测量所必需的技术能力。随后，在转向疾病模型或经处理的小鼠之前，应先在健康动物中获得可重复的结果。由于呼吸系统研究中的大量疾病模型涉及将动物暴露于过敏原、毒素、污染物、香烟烟雾或气体等物质，因此本文所述测量技术所得结果的变异性可能受到所用暴露程序的影响。对关键实验过程进行标准化（例如，采用计算机控制的暴露和测量系统6, 13, 14）可能在显著降低变异性方面发挥重要作用。
本文展示的示例代表了来自未处理小鼠和氯气暴露小鼠实验中的一组典型结果，同时强调了该技术的优势与局限性。例如，从图中可以明显看出 图6该技术能够获得可重复的肺功能测量结果。尽管不同小鼠品系之间的基础阻力值相似，但在顺应性方面仍观察到差异。15幼鼠与成年小鼠之间也预期存在显著差异16. 至于其他 体内 生理学评估中，高精度结果（如由强迫振荡技术FOT所获得的结果）在一定程度上会牺牲受试对象自然状态的保持。这一原理被称为表型测定不确定性原理。1，适用于本方案，即测量需在麻醉、气管切开（或经口插管）并机械通气的受试者中进行。该技术的另一局限性体现在 图5D-5F 由于在中度以上支气管收缩水平时，恒定相位模型对氯暴露组数据的拟合效果较差，因此无法获得最高浓度下的数据。然而，可通过直接分析呼吸系统阻抗（Zrs）来评估严重支气管收缩的动物15，或使用第三方后期分析软件来拟合更复杂的数学模型， 例如 考虑到机械功能的异质性17如果动物气道不够松弛，或插管的阻力过高，则也可能观察到被排除的数据集。一般而言，插管的阻力不应超过动物在基线状态下的阻力。使用内径更大和/或长度更短的插管有助于降低插管阻力。最后，本研究中展示的小鼠FOT测量方法可能被认为耗时较长，因此相较于侵入性较小的技术，效率较低或在纵向研究中的适用性较差。然而，后者的结果基础存在较大不确定性，且被许多人认为存在缺陷。1经口插管动物可进行重复的有创测量，尽管技术上更具挑战性17.
根据所提供的示例，结果表明，在对小鼠进行氯气暴露后，新一代与上一代 flexiVent 系统在呼吸力学测量、气道高反应性以及对吸入性乙酰甲胆碱的敏感性方面具有等效性。当用于表征或理解生理变化或疾病模型时，该技术相关的详细测量能力有助于拓展当前的知识水平。

由于呼吸系统研究中鼠类模型的广泛应用，对小型动物肺部力学特性的充分表征已变得至关重要。采用强制振荡技术（FOT）——一种同样应用于人体研究的技术——进行测量，可为研究具有生理意义的变化提供一种强大、整体性且具转化价值的方法。FOT测量通常通过分析在受试者气道开口处施加预定义的、小幅度振荡气流波形（亦称为扰动或输入信号）后获得的压力和容积信号来实现。1最简单的情况下，FOT扰动是一个具有明确定义频率的单一正弦波形。更复杂的扰动通常由多个特定频率（互为质数）的波形叠加而成，覆盖较宽的频谱范围。利用傅里叶变换将多频输入和输出信号分解为其组成成分，可计算出呼吸系统输入阻抗（Zrs）。 即 输入与输出信号之间在扰动所包含的每个频率下的传递函数2因此，FOT 允许在单次操作中对一系列频率下的呼吸力学进行同步评估。2. 拟合高级数学模型（例如 恒定相位模型3) 对阻抗数据进行拟合，从而将响应分解为空气道（中央和外周）和肺实质组织相关的参数1, 3. 因为许多因素会影响生理反应（例如 呼吸频率、潮气量、肺容积、上气道、自主呼吸努力程度、测量时机等参数由测量系统和实验操作流程进行控制和标准化。1 该技术在正确操作的前提下，能够生成精确且可重复的测量结果。本文旨在提供在小鼠中实施此类测量所需的详细、按时间顺序排列的操作流程。该方案包括四个部分：准备步骤（试剂、设备和实验对象）、机械通气、肺功能测量以及数据分析。以下为使用计算机控制的活塞式呼吸机获得的呼吸系统力学典型结果示例flexiVent，SCIREQ公司，加拿大魁北克省蒙特利尔）提供。这些数据来自未处理小鼠，以及一种由氧化应激驱动的气道损伤模型，该模型表现为气道炎症、上皮细胞损伤以及对吸入性气溶胶化乙酰甲胆碱的气道反应性增强4尽管该方案常用于评估气道对吸入性乙酰甲胆碱的反应性，但其应用范围还涵盖其他多种病理情况，包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺气肿、肺纤维化、肺损伤，以及与人类疾病相似的转基因小鼠病理模型。利用该工具获得的研究结果有助于更深入地表征和理解生理变化或疾病模型，并推动研究向新的领域拓展。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>乙酰-&amp;#946;-甲基胆碱氯化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2251</td><td>甲胆碱</td></tr><tr><td>显微有齿Adson镊子，12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC31镊子，有齿弯头</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>直头虹膜剪，耐用型，11.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪，刀头2.5 mm，直头</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>非无菌钝针（18g × &amp;frac12;"）</td><td>Brico Medical Supplies Inc.</td><td>BN1805</td><td>气管插管导管</td></tr><tr><td>非无菌5-0丝线缝合线</td><td>Seraflex</td><td>IDI58000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Starstedt</td><td>SS-4001</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 结核菌素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l 滤芯吸头</td><td>Biosphere</td><td>70.760.211</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flexiVent&lt;/em&gt; FX</td><td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> SCIREQ Inc.</a></td><td>sales@scireq.com</td><td>&lt;a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"&gt;www.scireq.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Aerogen Aeroneb 雾化器</td><td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> SCIREQ Inc.</a></td><td>sales@scireq.com</td><td>&lt;a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"&gt;www.scireq.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

使用强制振荡技术评估小鼠呼吸系统力学

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

强迫振荡技术（FOT）是一种强大、整合且具有转化价值的工具，能够以全面、详细、精确且可重复的方式对小鼠肺功能进行实验性评估。该技术通过分析在受试者气道开口处施加预设的低振幅振荡气流波形后获得的压力和容积信号，从而测量呼吸系统力学参数。本实验方案详细说明了使用计算机控制的活塞式呼吸机（flexiVent；SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada）在小鼠中正确执行强迫振荡测量所需的操作步骤。描述分为四个部分：准备步骤、机械通气、肺功能测量和数据分析。此外还包括如何评估麻醉小鼠吸入乙酰甲胆碱后的气道反应性，这是该技术的常见应用之一，也可扩展至其他指标及多种肺部病理状态的研究。本文展示了在未经处理的正常小鼠以及氧化应激诱导的气道损伤模型小鼠中获得的测量结果，以说明该工具如何有助于更准确地表征和理解所研究的生理变化或疾病模型，并推动其在新兴研究领域的应用。

呼吸系统力学测量. 表4 显示了使用两种方法之一在基线水平及甲胆碱诱导支气管收缩（12.5 mg/ml）后获得的未经处理的A/J小鼠的典型结果 flexiVent 由...支持的世代 flexiWare 7 软件。呼吸系统的力学特性， 即 在闭合胸腔条件下，通过紧密间隔的单频和宽带频率强迫振荡系列交替扰动进行评估（分别为SnapShot-150和Quick Prime-3）。由于测量期间通气暂停，因此选择Quick Prime-3（其频率范围与Prime-8相似，但持续时间更短，为3秒 vs 8秒），以缩短窒息时间，最小化扰动对血气的影响，并提供更优的响应分辨率。各项扰动相关参数由操作软件自动计算。结果表明，这两代 flexiVent 该系统对呼吸力学的测量结果具有等效性。
 肺部反应部位区分肺部反应的部位可使研究者进一步精确定位受累区域，并识别潜在的药物干预靶点6例如，当测量时的呼气末压力从 3 增加到 9 cmH₂O 时， naive A/J 小鼠的基础阻力会升高。2O (图6A，SnapShot-150）。在本示例中，宽带频振荡技术（FOT）测量（Quick Prime-3）的使用提供了详细信息，用以阐明阻力变化的基础：呼气末压力的变化导致气道阻力（R）降低N）与较高肺容量及较大充气压力所产生的支气管扩张效应一致图6D) 以及组织阻尼（G； 图6E），一个与组织阻力密切相关的参数，可反映组织的黏弹性以及可能的小气道阻力7后者已知会随着肺容积的增加而增加。
 气道高反应性。与暴露于空气的 Balb/c 小鼠相比，暴露于氯气后，小鼠对吸入性乙酰甲胆碱的气道反应性增加，这是气道损伤的结果4（图2）。已知氯气可诱导氧化应激，导致气道结构细胞（尤其是上皮细胞）破坏，并促进炎症细胞募集。如图5所示，在逐步增加乙酰甲胆碱刺激浓度后，所有描述呼吸系统力学的参数均出现变化。与空气暴露组小鼠相比，氯气暴露组小鼠在所有强迫振荡技术（FOT）参数上均表现出更高的最大反应值（图5A、5B、5D-5F），并且浓度-反应曲线出现具有统计学意义的左移，表现为引起气道阻力和弹性升高一倍所需的乙酰甲胆碱浓度降低（PC200；图5C）。这些结果分别说明了氯气暴露后小鼠对吸入性乙酰甲胆碱产生气道高反应性和高敏感性。
 其他测量。除了强迫振荡技术（FOT）外，flexiVent 系统还可用于采集其他类型的肺功能8-10 或心血管11 测量数据。图7 展示了在基础状态下未经处理的 A/J 小鼠典型的逐步压力驱动的压力-容积曲线。该曲线呼气支的上部拟合至 Salazar-Knowles 方程12，相关参数由软件自动计算得出。
<img src="/files/ftp_upload/50172/50172table1.jpg" alt="麻醉方案表格，显示实验中的预处理用药、麻醉剂、处理方法及参考文献。" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table1highres.jpg" fo:content-width="6in" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 
表 1. 小鼠实验中使用的麻醉方案示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table2.jpg" alt="呼吸系统扰动方法表格；列出了操作、振荡和曲线分析的参数。" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table2highres.jpg" fo:content-width="5in" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 2"> 
表 2. 小鼠肺功能测量中使用的扰动方法。 *系统需进行扩展。测量期间受试动物还需置于密闭的体积描记室中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图表格</a>。
<img src="/files/ftp_upload/50172/50172table3.jpg" alt="电生理数据表，比较小鼠研究中单室模型与恒定相位模型。" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table3highres.jpg" fo:content-width="6in" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 3"> 
表 3. 来自单频段和宽带频率强迫振荡扰动系列的导出参数示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table4.jpg" alt="flexiVent 肺功能参数；比较基线与甲胆碱反应的表格；均值及标准差数据" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table4highres.jpg" fo:content-width="6in" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 4"> 
表 4. 系统比较。 使用两代 flexiVent 系统（由 flexiWare 7 软件操作）测得的肺力学参数比较。数据来自未经处理的 A/J 小鼠（n=5/组）在基线状态以及甲胆碱诱导支气管收缩后（Mch 12.5 mg/ml）的结果。*采用双因素重复测量方差分析对各组进行比较，并对个体反应值取 log10 以确保方差齐性（GraphPad Prism，版本 5.03；GraphPad Software，San Diego，USA）。
<img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1.jpg" alt="呼吸力学模拟中体积和压力随时间变化的流体动力学图。" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. 深部肺充气的截图。 上图显示呼吸机活塞位移的体积（红色曲线）和输送给受试者的体积（灰色曲线）。下图显示气缸压力在3秒内上升至设定值30 cmH2O，并在此水平维持相同时间。
 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig2.jpg" alt="小鼠通气脚本；默认CMV模式设置；基线测量过程；扰动循环。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 用于评估呼吸系统在基线状态下力学特性的典型脚本示例。
<img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig3.jpg" alt="时间序列分析，三幅图显示控制信号、阶跃响应和数据拟合结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 执行阶跃式压力-容积曲线过程中出现的自发吸气努力。
<img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4.jpg" alt="显示对乙酰甲胆碱激发随时间变化的肺阻力和顺应性曲线。" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 吸入乙酰甲胆碱剂量递增后的时间过程反应。 结果表示为 5 只未经处理的自发性高反应性 A/J 小鼠组成的组别数据均值（± 标准差）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig4large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。 
<img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5.jpg" alt="频率和乙酰甲胆碱曲线、气道反应性测量、统计数据分析、实验。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 氯气暴露和空气暴露的 Balb/c 小鼠在逐渐增加乙酰甲胆碱刺激后呼吸系统力学的变化。 对每个个体和实验条件下各参数的峰值进行识别，并计算组平均值（均值 ± 标准差；n=4–6）。采用单因素方差分析对组间差异进行评估，分析时对个体反应值取 log10 以保证方差齐性。引起基础值两倍增加的乙酰甲胆碱浓度（PC200）通过将二阶多项式拟合至个体剂量-反应曲线，并对拟合曲线进行插值计算获得。在氯气暴露小鼠中，D、E 和 F 图的两个最高乙酰甲胆碱浓度下缺少数据点，原因是决定系数过低，表明数学模型与数据的拟合效果较差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig5large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6.jpg" alt="强迫振荡技术图；显示气道阻力（R）、弹性（E）和顺应性（C）参数。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
 图 6. 将呼吸系统响应分解为空气道和肺组织力学参数。 来自未经处理的 A/J 小鼠的实验轨迹，展示了在两种不同的呼气末压力（3 和 9 cmH2O）下，对呼吸力学进行三次重复的单频（2.5 Hz）和宽带频率（1–20.5 Hz）强迫振荡测量结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig6large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7.jpg" alt="压力-容积曲线图，含统计表、数据分析、呼吸生理学。" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
 图7. 基线条件下未处理A/J小鼠的压力-容积曲线。 采用逐步压力驱动扰动法（PVs-P）生成压力-容积曲线，以确保每只小鼠的肺被充气至相同压力，而不受其状态影响。从个体压力-容积曲线中提取的Salazar-Knowles方程参数亦经平均后以表格形式报告。结果以均值±标准差表示（n=6）。

本方案详细描述了使用强迫振荡技术（flexiVent；SCIREQ Inc，蒙特利尔，魁北克，加拿大）在小鼠中进行呼吸系统力学测量以及评估吸入乙酰甲胆碱后气道反应性的逐步操作流程。

强迫振荡技术（FOT）是一种强大、整合且具有转化价值的工具，可用于实验评估小鼠肺功能……

本实验的总体目标是通过使用 flex event（一种商用计算机控制活塞式呼吸机），演示在小鼠中进行呼吸力学的强制振荡测量，并通过评估气道对吸入性甲基胆碱的反应性来实现该目标。第一步是准备所需的试剂、设备和实验对象。然后将受试对象连接至呼吸机，进行机械通气和呼吸力学测量。根据预设的程序，在基线水平及甲基胆碱激发后，进行一系列高度可控的自动化测量。结果分析可显示气道高反应性，表现为接触氯气的小鼠在气道阻力和弹性蛋白的最大反应上显著高于对照组受试对象。与现有方法相比，该技术的主要优势在于提供了一种准确的工具，能够以全面、详细且具有转化意义的方式测量肺功能。这是通过对受试者气道开口处施加预设的振荡气流波形后获取的压力和容积信号进行分析而实现的。此外，许多影响生理反应的因素均可被控制并标准化。使用此方法，打开 Flex event FX 系统并启动软件。本方案适用于 flexi 支持的两种 flex event 世代。在首次实验会话或在此之前任何时间，请安装七软件。打开研究定义与规划模块，以预先定义研究结构。单击“创建新研究”按钮，然后按照向导步骤创建研究。规划实验方案，并定义待研究的实验分组和受试对象。通过打开实验会话模块并按照启动流程操作，来启动一次实验会话。用于研究和模板选择。将受试者分配至测量部位，并确认其体重。按照操作软件中描述的步骤进行系统校准。系统会提示将用于校准的套管针连接到Y型管路。按照校准向导中的步骤完成套管针的校准，并确认获得的校准值在指定范围内。如有需要，可重复校准过程；若已准备就绪，可取消提示以开始通气和数据记录。这些步骤可在稍后阶段开始。使用适当剂量的麻醉剂对受试对象进行麻醉，并确认其已达到外科手术所需的麻醉水平。受试动物对脚趾夹捏应无反应，且呼吸应规律，无呼吸困难。将动物仰卧放置，并使用热源以维持其正常体温。在距离小鼠45厘米处放置一个60瓦的灯泡即可满足要求。然后用酒精清洁喉部区域以暴露气管。做一切口，并轻轻分离下颌下腺及覆盖其上的肌层。使用一对显微镊子轻轻提起气管。然后在其下方穿过缝线。在靠近喉部的两节软骨环之间剪开，从而在气管上形成一个小切口，但不将其完全切断。将校准后的套管插入切口，并轻柔地穿过五个气管环。本示例中使用的是1.2厘米长、18号的金属套管。必须使用缝线将套管固定牢固。附件应在套管周围形成密闭的气密封。将已插管的动物移近呼吸机。通过在通气控制面板中选择预设或自定义的通气模式，启动机械通气。现在通过Y型管将动物连接到呼吸机。仔细调整动物位置，使其与呼吸机对齐，并确保气管插管与呼吸机处于同一水平。这样可以避免软件中可能出现的插管阻塞或气管扭曲。通过双击扰动名称执行一次深部充气扰动，以验证套管插入和连接是否正确。除非存在泄漏，系统应在三秒内维持30厘米水柱的压力，且无过度的容积位移。记录的容积和压力曲线应平滑，无偏移或变形迹象。否则，此时可能存在导管堵塞或放置不当的情况。如有需要，可连接用于监测心率和体温的生命体征换能器。这些信号的数据记录可随时启动，可通过手动或脚本自动进行。可使用预定义或自定义脚本自动完成雾化器激活、事件标记等测量或指令，从而实现高度受控且可重复的实验过程。可通过六类扰动及其产生的多个参数，用于描述受试者在基线状态及特定刺激后的呼吸系统力学特性。在准备开始采集测量数据时，首先应执行深部吸气扰动，以招募闭合的肺区域并标准化肺容积历史。接下来，通过运行测试测量来确认不存在自发的吸气努力。在选定的数据集视图中观察压力信号曲线。采用逐步的PV曲线。压力平台应清晰明确，无向下偏转。压力向下波动表明动物存在吸气努力。现在通过双击其标题来启动脚本，以评估气道对吸入甲基胆碱的反应性。在此示例中，程序会以三份重复进行一系列基线测量。然后系统会提示将生理盐水加入雾化器中。或者在此示例中，将甲基胆碱溶液加入雾化器，大约加入100微升溶液。一旦在软件中输入信息，雾化将自动开始。雾化结束后不久，系统会启动一系列密集的测量，持续约三分钟。接下来，系统会提示执行。另一个挑战被提出，且可在不同挑战之间重复测量序列。使用棉签擦干雾化器接口内部有助于防止吸气管路中积聚液滴或冷凝物。随着数据的采集，软件会计算与扰动相关的参数，并根据数据对模型的拟合程度提供一个决定系数。之后，可通过软件的回顾与报告模块访问该实验，以导出或进一步分析数据。实验结束时，停止通气并移除受试对象。移除后应立即通过过量戊巴比妥钠对动物实施安乐死，随后可进行支气管肺泡灌洗，或分离肺组织以供进一步分析。在切换到下一位受试者之前，需冲洗并干燥雾化器适配器Y型管路和鼻导管。在操作软件中切换至下一位受试者，并确认其体重。然后按照建议的校准步骤进行操作，再继续实验。每天实验结束后，冲洗并干燥设备。请记住，在结束实验前，还需根据制造商的说明清洁系统的呼气阀，以维持系统性能。以下示例展示了来自未经处理的小鼠和氯气暴露小鼠实验的一组典型结果，以及未经处理的 aj 小鼠的等效结果。在基线水平以及使用 flexi wear seven 支持的两种 flex 事件生成方式之一诱导甲基胆碱支气管收缩后，获取小鼠数据。由于宽带强迫振荡技术（FOT）测量可将肺部反应分解为空气道和肺实质组织参数，因此提供了一种识别受累肺区的方法。例如，当末期呼气压从 3 厘米水柱升高至 9 厘米水柱时，未经处理的 AJ 小鼠显示出基础阻力增加。呼气末压力的改变导致气道阻力下降，这与较高肺容积和较大充气压力所产生的支气管扩张效应一致；同时组织阻尼增加，该参数与组织阻力密切相关，反映组织的黏弹性，可能还反映小气道的阻力。后者已知会随肺容积的增加而升高。该方案常用于评估吸入氯气暴露后对吸入性甲基胆碱的气道反应性。与暴露于空气的对照组相比，B.SEA小鼠表现出气道高反应性。在本示例中，暴露于氯气的小鼠在所有FOT参数上的最大反应均更为显著。这些小鼠还显示出对吸入性甲基胆碱的浓度-反应曲线显著左移，即出现超敏反应，表现为引起气道阻力和弹性蛋白增加一倍所需的甲基胆碱浓度降低。除了强迫振荡技术（FOT）外，呼吸系统弹性事件记录系统还可记录其他测量指标，例如压力-容积曲线。呼气支上段数据通过Salazar Knolls方程进行拟合，相关参数由软件自动计算。要成功实施该技术，需特别关注每一步操作，其中尤为关键的步骤包括系统的校准、气管插管的阻力、动物体位的摆放以及肺容积的标准化。如果严格遵循这些步骤，该方法将为您提供小鼠肺组织力学特性的准确表征。

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科研

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生物学

使用强迫振动技术在小鼠呼吸系统力学评价

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