触觉条件化与蜜蜂（Apis mellifera L.）触角采样策略的运动分析

本实验的总体目标是展示如何对蜜蜂进行触觉刺激的条件化训练，并介绍一种用于分析精细尺度运动学及10点采样模式的二维运动捕捉技术。实验开始时，需要在蜂巢前方捕捉自由飞行的蜜蜂。第二步是将蜜蜂固定在金属管中，并用白色涂料遮蔽其眼睛。

接下来，利用经典条件反射程序对蜜蜂进行触觉刺激训练。最后一步是使用数码摄像机记录已建立条件反射的蜜蜂的触角运动。最终，通过MATLAB进行二维运动捕捉，以分析蜜蜂在经历联想性和非联想性触觉学习范式后触角运动行为的变化。

该方法可用于研究多种可变物种中的触觉辨别与感知能力。它能够区分非联想性触觉学习所引起的变化与条件反射等联想性学习所产生的变化。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为蜜蜂需要被非常小心地操作，且触觉条件反射实验过程中的时间控制至关重要。

该方法有助于解答主动触觉感知领域中的关键问题。它利用一种自然的反射行为作为报告行为，使我们能够判断动物是否能够区分两种触觉刺激。首先，直接从蜂巢入口处采集蜜蜂。

用带有泡沫塞的玻璃小瓶捕捉每只蜜蜂，并立即将其带入实验室进行后续操作。简而言之，将蜜蜂置于4°C冰箱中冷却，直至其开始出现活动受限的迹象。首先，将每只蜜蜂固定在一根金属管上。

用胶带将蜜蜂的头部和胸部固定，并覆盖腹部。确认喙和一根触角可自由活动，以遮挡蜜蜂的视线。用白色颜料涂抹复眼和小眼。

在头部与胶带之间放置一小滴融化的石蜡，以防止头部移动。记录过程中，为便于识别，用数字标记每只蜜蜂的胶带，并将试管置于湿润环境中，以防脱水。

最后，使用装有30%蔗糖溶液的注射器对每只蜜蜂饲喂5秒钟，并让其恢复30分钟。在开始触觉条件化训练方案之前，即条件化前，测试每只蜜蜂的口器伸展反应（PER）。具体操作为：将30%蔗糖刺激物施加于触角，以观察是否出现正确的反应。

蜜蜂的吻尖必须越过上下颚之间的一条假想线。只有表现出正确PER反应的蜜蜂才用于本研究。在触觉条件化训练中，使用金属表面结构作为条件刺激（cs）。

其表面可以是光滑的或带有凹槽，以形成不同的质地。非条件刺激（US）为30%的蔗糖溶液。将黄铜立方体放入显微操作器上的支架中。

这将有助于在条件化过程中实现精确定位。安装触觉刺激装置后，将一只蜜蜂置于显微操作器前方。接着，缓慢调整条件刺激（Cs）的位置，使触觉刺激装置的表面与蜜蜂头部保持平行。

应让蜜蜂能够以舒适的姿势用两只触角扫描触觉刺激。开始条件化程序时，让珠子扫描触觉刺激5秒钟。前3秒过后，使用注射器在蜜蜂喙下呈现一滴30%蔗糖溶液。

用注射器的尖端轻轻抬起喙。这种刺激应能引发非条件性的口器伸展反射（PER）。让蜜蜂舔舐蔗糖。

奖励持续一秒钟。继续进行条件化程序，直到蜜蜂接受五次配对刺激。在首次获得奖励的配对刺激后，蜜蜂应开始在条件刺激（CS）呈现时伸展其吻部，表明它们预期即将到来的奖励。

在蔗糖呈现之前，触觉刺激呈现的前3秒内观察到任何一次完全伸展的喙反应（psis）均记为一次阳性反应。最后，为一组蜜蜂生成学习曲线。具体方法是，针对每次试验，绘制出在条件刺激（CS）呈现期间表现出喙伸展反应（PER）的蜜蜂所占的百分比。

条件化处理后，使用配备合适微距镜头的数码摄像机记录触角的运动。本实验采用巴斯勒 a 602 F 相机，配备 Tech Spec VZM 200 镜头，通过火线连接以每秒 50 帧的速度进行拍摄；调整相机位置，使固定住的蜜蜂和触觉刺激物清晰可见。接下来，通过从不同角度拍摄已校准的棋盘格图案的单张图像，对相机进行校准。

使用带有相机校准工具的专用软件来分析图像。校准完成后，在相机镜头下方放置一个固定的 B，并施加触觉刺激。如前所述。

在蜜蜂扫描物体时记录其触角的运动。数据采集完成后，使用 MATLAB 首先定义图像背景，计算每个像素随时间变化的灰度中值。通过从每帧图像中减去图像背景，蜜蜂固定的头部和触觉刺激等静态物体将被消除，从而凸显视频中的运动部分。

理想情况下，应将蜜蜂的触角分离出来，作为后续处理中唯一的非零值区域。具有非零像素值的两个最大区域被假定为触角。通过创建一个掩膜来定位触角的尖端，并对整幅图像进行处理，以减少误差量。

在这些技术降低了噪声水平后，应用图像腐蚀和膨胀工具的组合。使用二值掩膜函数对分离的区域进行聚类。计算其中两个最大聚类的质心，以区分左触角和右触角。

此处，它们分别以红色和绿色进行颜色标记。最后，每根触角的触角尖端可定义为在近端到远端方向上像素值最高的像素点，由此创建一个二维直方图，以显示触角尖端的空间分布情况。以下是采集花粉的蜜蜂在触觉PER训练中的学习曲线。

第一次配对后的阳性反应比例显著高于自发行为，且学习曲线在第三次奖励后趋于饱和。在本示例中，分别记录了条件化组与未训练组在有或无触觉刺激情况下的肛端运动，持续一分钟。以下是刺激呈现前的自发性肛端运动。

横轴显示神经隧道尖端的侧向位置，纵轴显示其远端位置。颜色标度表示神经尖端停留在某一特定位置的时间百分比。黄色表示非常频繁的位置，红色表示较少见的位置，黑色区域则为无法到达的位置。

这些数据表明，与自发行为相比，在存在触觉刺激的情况下，训练组和未训练组的蚂蚁均改变了其触角运动模式。注意，刺激物表面附近的黄色矩形区域表明，蚂蚁触角末端在该区域花费了较长时间进行表面采样。训练组蜜蜂的触角末端在刺激区域停留的时间显著长于未训练组蜜蜂。

通过该方法，可结合电生理学和药理学手段回答更多问题，例如蜜蜂在发育后主动触觉行为的神经生理学基础是什么？这种触觉条件化技术为研究主动触觉感知领域的科研人员铺平了道路，使其能够探索触觉刺激辨别、以及在Alpha Pots中触觉学习与记忆的各个方面。观看本视频后，您应能够充分理解如何分析昆虫的主动触觉搜寻与采样运动。

请注意，如果至少增加一台与第一台同步的摄像机，则运动分析可扩展为三维分析。