使用ChEF-tdTomato对斑马鱼体感神经元进行光遗传学激活

本实验的总体目标是激活幼年斑马鱼中的单个体感神经元。首先需要制备一根光纤并将其连接至A-D-P-S-S蓝光激光器，以实现这一目标。第二步是在单细胞至两细胞期的胚胎中注射转基因片段。

接下来，筛选在体感神经元中表达C-H-E-F-T-D番茄荧光蛋白的脂肪胚胎，并将其固定于显微载物台上。最后一步是给予短暂的蓝光脉冲以激活单个神经元，并记录由此产生的行为反应。该技术相较于现有使用通道根部选项二的方法，其主要优势在于，本方法可用于诱导单个神经元激活后最多至少四天内的行为反应。

尽管该方法目前被用于研究特定体感神经元在斑马鱼幼虫中的功能，但该方法也可加以改进，用于研究由任何斑马鱼神经元群体（如中间神经元或运动神经元）所引发的行为。这种遗传学方法可用于在活体中激活特定神经元，表征其功能发育过程，评估基因突变或对特定蛋白质进行现象学阻断对行为的影响，并绘制导致不同行为反应的下游神经网络。

开始此操作时，通过在本生灯上加热玻璃制意大利面移液管的锥形颈部，制成一个用于存放光纤的储存装置，使其形成150度的夹角。接下来，使用金属丝剪刀或剃刀刀片，小心地将光纤切割成两段。

每段光纤应一端裸露，另一端带有FC PC接头。然后从光缆的切割端去除5.0厘米长的光纤护套、加强纤维和涂层，使光纤仅保留包层。随后，将处理好的光纤插入已准备好的意大利面移液管中。

使用钻石玻璃切割器或尖头镊子，确保光纤能够轻松地进出移液管尖端。在玻璃纤维上做一划痕，折断末端，以在纤维末端形成整齐的切口。接下来，将光纤缩回意大利面移液管中。

然后在显微镜下使用显微操作器手动将光纤置于巴氏吸管中，随后用镊子对受精后24至48小时的胚胎进行COATE处理，再使用0.02%三卡因麻醉幼虫，并在荧光解剖显微镜下观察。筛选出表达Ron Beard神经元或三叉神经元的幼虫。表达稀疏且细胞易于识别的胚胎最为理想，但由于将使用光纤靶向激活单个神经元，因此较宽范围的表达密度均可接受。将幼虫转移至新的培养皿中，加入新鲜的PTU蓝色胚胎水。

将胚胎置于28.5摄氏度、避光条件下培养，直至达到所需的实验阶段。在本步骤中，配制1.5%低熔点琼脂糖溶液，并加入双蒸水，置于42摄氏度的加热块中，以防止其凝固。使用玻璃巴斯德吸管，将一条预筛的幼鱼转移至含有1.5%低熔点琼脂糖的离心管中，尽量减少蓝色胚胎水的带入。

然后将幼虫转移至一小滴琼脂糖中，并置于小型培养皿上。在解剖显微镜下，当琼脂糖凝固后，将幼虫 dorsal 侧朝上放置。使用一把细剃刀从幼虫两侧切去琼脂糖。

用胚胎蓝水填充卵黄周围的区域。接着，在卵黄两侧各做两个对角切割，注意不要切到胚胎。然后，将卵黄从胚胎的躯干和尾部轻轻剥离。

现在将高速相机安装到解剖显微镜上，并将相机连接至计算机。然后打开计算机和高速相机。启动视频成像软件并调整相机设置。

接下来，将光纤、激光器和刺激器连接在一起。然后打开刺激器，将其电压设置为最大5伏，脉冲持续时间为5毫秒。随后打开激光器。

接下来，使用荧光解剖显微镜将光纤的尖端定位在表达 C-H-E-F-T-D 番茄的神经元胞体附近。给予一束蓝光脉冲以激活该感觉神经元，随后使用高速相机记录其反应。

设置为每秒500或1000帧，并在每次激活之间间隔至少一分钟，以避免习惯化，用镊子小心释放前部的火山物质，注意不要损伤动物。然后将其转移至新鲜的蓝色胚胎水中。可让动物继续发育，并可在更晚的发育阶段重复该操作。

也可将胚胎重新安装，以便对激活的细胞进行高分辨率共聚焦成像，从而将细胞行为与细胞结构相关联。此处所示的斑马鱼幼鱼部分固定于1.5%低熔点琼脂糖中，其头部周围由虚线表示。三叉神经元和罗汉须神经元以红色显示，口部细胞在图示中由虚线勾勒。

以下是一段视频，显示在约35小时受精后（HPF）的幼鱼中，单个表达C-H-E-F-T-D番茄的罗汉须神经元被激活，可引发行为反应。该视频展示了在60小时受精后（HPF）的幼鱼中，表达C-H-E-F-T-D番茄的罗汉须神经元被激活的情况，而另一段视频则展示了在4天受精后（DPF）的幼鱼中，表达C-H-E-F-T-D番茄的罗汉须神经元被激活的情况。一旦掌握该技术，这种基因操作方法可在一小时之内完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在不同时间点激活单个神经元以及幼年 Libra 鱼。请务必注意，使用激光可能存在极高风险，在进行该操作时应始终采取适当的安全防护措施。