Name: Optogenetic激活斑马鱼的体感神经元使用厨师tdTomato的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 了解光遗传学激活斑马鱼体感神经元的方法，使用ChEF-tdTomato标记和蓝光刺激技术。该方法可在单细胞水平研究神经活动与行为反应的关系，适用于发育神经科学研究。

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我们感谢 Fumi Kubo、Tod Thiele 和 Herwig Baier（UCSF/马克斯·普朗克研究所）在行为实验和 DPSS 激光装置方面的建议；感谢 MBL 神经生物学课程的 Heesoo Kim 和 Chiara Cerri 协助完成 ChEF-tdTomato 实验；感谢 Petronella Kettunen（哥德堡大学）在光遗传学实验初期的合作；感谢 Baljit Khakh、Eric Hudson、Mike Baca 和 John Milligan（加州大学洛杉矶分校）提供的技术建议；并感谢 Roger Tsien（加州大学圣地亚哥分校）提供 ChEF-tdTomato 载体。本研究得到了美国国家卫生研究院培训基金（NRSA：5F31NS064817）对 AMSP 的资助，以及美国国家科学基金会（NSF：RIG:0819010）对 AS 的项目资助。

提前准备好以下物品。
1. 准备光纤线缆
<ol>
 <li>通过在本生灯上熔化玻璃巴斯德移液管的锥形颈部，制成一个用于存放光纤的储存装置，使其形成约150°的夹角。</li>
 <li>使用金属丝切割器或剃刀片，小心地将光纤切割为两段，每段应保留一端带有FC/PC接头，另一端为裸露的光纤端。将其中一段作为备用光纤妥善保存。</li>
 <li>从光纤切割端起，剥离5.0 cm长的光纤护套和增强纤维，使光纤包层暴露（图1A）。</li>
 <li>将光纤插入已准备好的巴斯德移液管中，确保光纤可在移液管尖端自由进出。</li>
 <li>使光纤从巴斯德移液管尖端伸出，小心剥离玻璃纤维周围约2 mm处的包层。</li>
 <li>使用金刚石笔或玻璃切割刀在玻璃纤维上刻痕，然后折断末端，以在光纤末端形成平整的切面（图1B）。</li>
 <li>将光纤缩回巴斯德移液管中以储存。若光纤尖端出现崩裂或断裂不平整，需重复步骤（1.6）。</li>
 <li>使用显微操作器将光纤在巴斯德移液管中进行精确定位（图1C）。</li>
</ol>
步骤2-8描述了一种将转基因注入胚胎的方法，该方法通常适用于多种斑马鱼实验。该方法的多种改良版本，如其他JoVE视频中所述6, 7, 8, 9, 22，同样有效。
2. 拉制注射针头
<ol>
 <li>使用拉针仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成两根具有逐渐变细尖端的注射针。拉针仪的参数设置因设备而异。（在Sutter Instruments拉针仪上，我们使用的参数为：P = 500，Heat = 720，Pull = 50，Velocity = 70，Time = 150）。不同拉针仪的性能存在差异，因此需通过实验经验优化拉针参数。若需获得更细长的锥形针尖，可提高加热值和/或拉力；若需较短粗的锥形针尖，可延长拉制时间和/或降低拉力。</li>
 <li>将针头存放于安全容器中（即 带有胶带卷、胶面朝外的培养皿</li>
</ol>
3. 倒模
<ol>
 <li>将0.5 g琼脂糖溶于30 ml胚胎蓝水（embryo/blue water）中，加热至琼脂糖完全溶解。</li>
 <li>倒入培养皿的下半部分。</li>
 <li>将带有固定孔的矩形模具（图2）放入琼脂糖中，注意尽量减少孔周围气泡的形成。</li>
 <li>静置使琼脂糖凝固。</li>
 <li>取出模具，并用蓝水/胚胎水填充培养皿。</li>
 <li>直立存放，加入洁净水，当日使用可置于室温，如需后续使用则存放于4 °C。</li>
</ol>
4. 制备用于注射的质粒 DNA 混合物
<ol>
 <li>用1:10的酚红溶液将质粒DNA稀释至50 ng/μl的浓度，溶剂为ddH2O。例如：
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>1.0 ml</td>
 <td>质粒DNA（250 ng/ml）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 ml</td>
 <td>酚红</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3.5 ml</td>
 <td>ddH2O</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>若立即使用，DNA混合液可置于室温保存；若需短期存放，可在4 °C保存数天。</li>
</ol>
5. 设置交配对
应在计划进行注射的前一天晚上完成此步骤。
<ol>
 <li>用系统水填充繁殖缸，并将雄鱼和雌鱼放在一起。如果无法在设施灯光开启后立即进行注射，则使用隔板将雄鱼和雌鱼分开。</li>
</ol>
6. 准备注射（可在等待胚胎期间进行）
<ol>
 <li>打开压力注射装置。确保系统设置为脉冲模式。将脉冲持续时间（PULSE DURATION）初始设置为1。</li>
 <li>打开空气（AIR）阀门，并将压力注射器调节至约20 psi。</li>
 <li>在体视显微镜下使用最高放大倍数，用镊子或针具轻触针尖使其断裂，形成约2 μm的开口（图3，视频1）。</li>
 <li>通过以下方法将DNA混合液注入针头：1. 将针头尖端朝上放入DNA混合液中，利用毛细作用使液体自动吸入；或2. 使用长头移液器直接将1–2 μl DNA混合液注入针头内。</li>
 <li>将装有液体的针头放置于安全位置，待准备注射时使用。</li>
</ol>
7. 收集胚胎
<ol>
 <li>设施灯光开启后，移除隔板（如适用）。用滤网/小筛子收集胚胎，并将其转移至含有新鲜蓝色/胚胎水的培养皿中。</li>
</ol>
8. 在1-2细胞期注射胚胎
<ol>
 <li>使用塑料移液管将收获的胚胎转移至注射模具中。</li>
 <li>在解剖显微镜下，用镊子或钝头针轻轻将胚胎推入孔穴中（图4，视频2）。</li>
 <li>将装有样品的针头放入显微操作仪，并调整至胚胎上方位置。</li>
 <li>通过以单步递增方式调节脉冲持续时间来校准注射体积，直至达到所需体积（约1 nl）。可使用微米载玻片进行校准，方法如先前JoVE视频中所述8, 22，但本实验无需精确校准，因为较宽范围的注射体积均可获得足够的表达效果。</li>
 <li>将约1 nl的DNA混合液直接注射入细胞，并对所有胚胎重复此操作。DNA也可注射至卵黄中，但效率通常较低（图5，视频3）。</li>
 <li>用轻柔的蓝色胚胎培养液流将已注射的胚胎从模具中冲出。</li>
 <li>将已注射的胚胎置于28.5 °C避光条件下培养。</li>
 <li>定期清除未受精、受损或死亡的胚胎。</li>
 <li>在受精后18–24小时（hpf）期间用PTU处理胚胎，以防止色素形成。</li>
</ol>
9. 筛选转基因表达
<ol>
 <li>使用镊子手动去除24-48小时胚胎的绒毛膜。</li>
 <li>使用0.02%三卡因麻醉幼鱼。</li>
 <li>在荧光解剖显微镜下，识别具有RB或三叉神经元表达的幼鱼，并将其转移至含有新鲜PTU蓝/胚胎水的新培养皿中。表达稀疏且细胞易于识别的胚胎最为理想，但由于将使用光纤电缆靶向激活单个神经元，因此较宽范围的表达密度均可接受。</li>
 <li>将胚胎在28.5 °C避光条件下保存，直至达到所需的实验阶段。</li>
</ol>
10. 为行为实验安装幼虫
<ol>
 <li>制备1.5%低熔点琼脂糖溶液于ddH₂O中2O，并置于42 °C加热块中以防止凝固。</li>
 <li>使用玻璃巴斯德移液管，将一条预先筛选的幼虫转移至含有1.5%低熔点琼脂糖的离心管中，尽量减少蓝色/胚胎水的带入。</li>
 <li>将幼虫连同一滴琼脂糖转移至一个小培养皿中。</li>
 <li>在解剖显微镜下，将幼虫背侧朝上放置。</li>
 <li>琼脂糖凝固后，用锋利的剃刀刀片（#11 手术刀）切去琼脂糖，仅在幼虫周围保留一圈楔形琼脂糖。</li>
 <li>在卵黄两侧各做两个对角线切口；注意不要切伤幼虫。</li>
 <li>在琼脂糖周围加入胚胎/蓝色水。</li>
 <li>将琼脂糖从幼虫的躯干和尾部拉开（图6).</li>
</ol>
11. 准备高速相机和成像软件
<ol>
 <li>将高速摄像机安装到解剖显微镜上。</li>
 <li>将相机连接到计算机。</li>
 <li>打开计算机。</li>
 <li>打开高速摄像机。</li>
 <li>打开视频/成像软件（我们使用 AOS 成像软件，并在此描述其操作步骤，但也可使用其他成像软件）。</li>
 <li>根据需要调整相机设置（即 每秒1,000帧（fps），50%触发缓冲或其他首选设置。</li>
 <li>开始记录。</li>
</ol>
12. 使用473 nm激光激活单个神经元
<ol>
 <li>连接刺激器、激光器和光纤电缆。</li>
 <li>打开刺激器电源。</li>
 <li>将刺激器设置为最大5伏电压，脉冲持续时间为5毫秒。</li>
 <li>根据制造商说明打开激光器。</li>
 <li>使用解剖显微镜将光纤电缆的尖端定位在表达ChEF-tdTomato的神经元细胞体附近（图6）。</li>
 <li>施加蓝光脉冲以激活感觉神经元。</li>
 <li>使用设置为每秒500或1,000帧的高速相机记录行为。</li>
 <li>根据需要重复实验，每次激活之间间隔1分钟，以避免习惯化。（我们对每个神经元至少记录三次反应。）</li>
 <li>为释放幼虫，用镊子小心撬开琼脂糖，注意不要损伤动物。该动物可继续培养，也可在更晚的发育阶段重复此操作，以表征行为的发育过程。此外，可将胚胎重新装片，进行高分辨率共聚焦成像，以关联行为与细胞结构，如下文所述。</li>
 <li>将幼虫转移至含有新鲜蓝水/胚胎水的培养板中。我们使用24孔板来分别标记个体幼虫。</li>
</ol>
13. 使用共聚焦显微镜成像神经元
<ol>
 <li>用 0.02% 三卡因麻醉幼虫。</li>
 <li>将幼虫背侧朝上固定在 1.2% 低熔点琼脂糖中或背侧模具中。</li>
 <li>使用 543 nm 激光配合适当的滤光片和物镜对 ChEF-tdTomato 神经元进行成像。我们使用 20 倍物镜。</li>
 <li>从琼脂糖中取出幼虫，并放回含有蓝色/胚胎水的单独孔中。</li>
 <li>在 28.5 °C 黑暗条件下保存，用于后续分析。</li>
</ol>

<ol><li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li>
<li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li>
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<li>Liu, K. S., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablations+reveal+functional+relationships+of+segmental+hindbrain+neurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish.</a> Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).</li>
<li>Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+startle+motor+patterns+and+behaviors+in+the+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A.+Neuroethol.+Sens+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).</li>
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<li>Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+birth+order+identifies+a+dimorphic+sensorineural+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map.</a> J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).</li>
<li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li>
<li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li>
<li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li>
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<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们介绍了一种在活体斑马鱼中对单个 RB 神经元进行光遗传学激活的方法。本方法采用瞬时转基因技术，在特定的体感神经元中表达一种带荧光标记的通道视紫红质变体 ChEF-tdTomato13。该方法可轻松适用于其他斑马鱼幼体细胞群体。
采用该方法，我们能够持续诱导表达 ChEF-tdTomato 的 34–48 小时受精后（hpf）幼鱼产生行为反应。使用持续 5 毫秒、5 伏的蓝光脉冲，可成功激活单个 RB 神经元（图 7）。通过将光纤置于动物体的不同位置，我们发现必须将蓝光直接对准细胞体才能引发行为反应。在不表达 ChEF 的幼鱼中，光脉冲无法引发任何反应。此外，即使在幼龄幼鱼中，沿中枢轴突或外周轴突施加光脉冲也从未引发反应（数据未显示）。这一特性具有优势，使得我们能够可靠地激活多个神经元被标记动物中的单个神经元，即使其他神经元的中枢轴突经过目标神经元细胞体附近时亦如此（视频 4–6）。
为了检验该方法在评估运动学参数方面的可靠性，我们测定...

利用特定波长的光来促进或抑制神经元兴奋性的光遗传学方法的发展，使得研究控制行为的神经回路中不同神经元群体的功能成为可能1, 19, 21。该技术常用于激活神经元群体，但也可用于激活单个神经元。斑马鱼幼体特别适用于这些方法，因为它们身体透明、神经系统发育迅速，且制备转基因动物快速且常规化。然而，要可靠地实现单个神经元的激活，仍需克服重大的技术难题。
为了优化对单个斑马鱼神经元进行光遗传学激活的实验流程，我们聚焦于体感神经元。斑马鱼幼体通过两类神经元群体来感知多种体感刺激：三叉神经元支配头部，而罗氏-比德（Rohon-Beard, RB）神经元则支配身体其余部分。每个三叉神经元和RB神经元均发出一条外周轴突，其在皮肤中广泛分支以感知刺激，同时还发出一条中枢轴突，连接至下游神经环路。动物在受精后21小时（hpf）即能对触觉刺激产生反应，表明功能协调的体感神经环路已经形成5, 18。在幼体发育过程中，至少部分三叉神经元和RB神经元会与Mauthner细胞形成突触，从而触发典型的逃避反应；但越来越多的证据表明，存在多种类型的体感神经元，其连接模式各不相同，可能引发多样化的逃避行为变体2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17。我们开发该方法的初衷是表征不同类型体感神经元的行为功能，但原则上，该方法也可用于研究斑马鱼幼体中几乎任何单个神经元或神经元群体的功能。
Douglass et al. 之前描述了一种利用蓝光激活表达 Channelrhodopsin-2 的体感神经元以诱发逃避行为的方法3。该方法使用来自 isl1 基因的增强子元件驱动 ChR2-EYFP 在体感神经元中的表达。然而，据报道，该转基因表现出相对较弱的荧光信号，需共注射第二个报告基因 UAS::GFP 才能实现对表达 ChR2-EYFP 的细胞的可视化。该方法可用于诱导 24–48 hpf 之间的行为反应，但始终无法在 72 hpf 之后诱导出反应。因此，尽管该方法适用于研究极早期幼虫阶段（24–48 hpf）的神经环路，但在较年长的幼虫中则不适用，因为在这些阶段更丰富的行为反应变得明显，且神经环路更为成熟，需要更可靠的技术手段来表征神经环路和行为反应。
为了表征幼体 RB 神经元亚群的功能，我们试图提高该技术的灵敏度。为增强表达，我们采用了一种躯体感觉特异性增强子（CREST3）20 来驱动 LexA-VP16 的表达，并使用一段 LexA 操纵序列（4xLexAop）11 来扩增荧光标记的光敏通道蛋白的表达。该配置增强了通道蛋白的表达水平，无需共表达第二个报告基因，即可直接确定每个神经元中通道蛋白的相对丰度。使用 LexA/LexAop 序列的额外优势在于，可将转基因引入使用 Gal4/UAS 系统的斑马鱼报告品系中。该转基因的瞬时表达导致表达水平存在差异，但通常足够强，可在数天内清晰观察到单个神经元的胞体及轴突投射。为优化对光的敏感性，我们采用了光敏通道 ChEF，这是一种通道视紫红质变体，由通道视紫红质-1（Chop1）和通道视紫红质-2（Chop2）组成的嵌合体，其交界位于螺旋环 E-F 处13。该通道与 ChR2 在相同波长下被激活，但激活所需光强度更低，因此比包括 ChR2 在内的其他常用通道更为敏感。ChEF 蛋白与红色荧光蛋白 tdTomato 融合，使我们能够在不激活通道的情况下筛选蛋白表达。作为光源，我们使用了二极管泵浦固态（DPSS）激光器，并通过光纤电缆将精确且高功率的蓝光脉冲传递至幼体的特定区域。该方法使我们能够将激光聚焦于单个神经元，从而无需寻找仅在单个神经元中表达该通道的稀有转基因个体。利用该方法，我们能够激活单个 RB 神经元，使用高速摄像机记录行为反应，并通过共聚焦显微镜对激活的神经元进行高分辨率成像。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管</td><td>Fisher</td><td>1367820B</td><td>或等效产品（直径10-15 mm）</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;m 光纤</td><td>ThorLabs</td><td>AFS200/220Y-CUSTOM</td><td>跳线，长度：3 m，端A：FC/PC，端B：FC/PC，护套：FT030</td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m 光纤</td><td>ThorLabs</td><td>AFS50/125Y-CUSTOM</td><td>跳线，长度：3 m，端A：FC/PC，端B：FC/PC，护套：FT030</td></tr><tr><td>可调式剥线工具</td><td>ThorLabs</td><td>AFS900</td><td>或三孔剥线工具（FTS4）</td></tr><tr><td>金刚石楔形刻划笔</td><td>ThorLabs</td><td>S90W</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液管拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>含丝硼硅酸盐玻璃管</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF-100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>注塑模具</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>图5</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>任意</td><td>任意</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100×15 mm）</td><td>任意</td><td>任意</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60×15 mm）</td><td>任意</td><td>任意</td><td></td></tr><tr><td>压力注射仪</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>显微操作器及金属支架</td><td>Narashige</td><td>M152</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>一次性塑料移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>探针（针夹和昆虫针）</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>26018-17 和 26000-70</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11255-20</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>微量移液器加样头（Microloader）</td><td>Eppendorf</td><td>9300001007</td><td></td></tr><tr><td>28.5 &amp;deg;C 培养箱</td><td>任意</td><td>任意</td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;C 加热块</td><td>任意</td><td>任意</td><td></td></tr><tr><td>非无菌手术刀片 #11</td><td>Fine Scientific Tools, Inc.</td><td>10011-00</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>带标准滤光片的荧光解剖显微镜</td><td>任意</td><td>任意</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 </td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 或 710</td><td>或等效设备，配备GFP和RFP激光器，以及10x、20x和40x物镜 </td></tr><tr><td>高速相机</td><td>AOS Technologies, Inc.</td><td>X-PRI (130025-10)</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>473 nm 便携式激光器</td><td>Crystal lasers</td><td>CL-473-050</td><td>或更高功率，带TTL选项</td></tr><tr><td>S48 刺激器</td><td>Astro-Med, Inc. Grass Instrument division</td><td>S48K</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>FC/PC 至 FC/PC 连接套筒</td><td>ThorLabs</td><td>ADAFC1</td><td>可能需要用于光纤连接</td></tr><tr><td>激光防护眼镜</td><td>ThorLabs</td><td>LG10</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>24孔培养板</td><td>Genesee</td><td>25-102</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>单凹载玻片</td><td>Fisher</td><td>S175201</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Aquatic Ecosystems</td><td>IS50</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Fisher</td><td>S71325</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma</td><td>P4758</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>EMD</td><td>2125</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>三卡因（Tricaine）</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>蓝色/胚胎用水</td><td></td><td></td><td>10 L ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 0.6 g Instant Ocean&lt;br/&gt; 6滴亚甲蓝</td></tr><tr><td>酚红 </td><td></td><td></td><td>(5 mg/ml 溶于 0.2 M KCl)</td></tr><tr><td>100x PTU</td><td></td><td></td><td>0.150 g PTU&lt;br/&gt; 50 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 70 &amp;deg;C下溶解，频繁振荡&lt;br/&gt; 分装并储存在 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1x PTU</td><td></td><td></td><td>1 ml 100x PTU&lt;br/&gt; 99 ml 蓝色/鱼用水</td></tr><tr><td>三卡因（Tricaine）储备液</td><td></td><td></td><td>400 mg 三卡因&lt;br/&gt; 97.9 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>约2.1 ml 1M Tris，pH9.0</td><td></td><td></td><td>调节pH至约7.0&lt;br/&gt; 短期储存于4 &amp;deg;C，长期储存于-20 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

使用chef-tdtomato对斑马鱼体感神经元进行光遗传学激活

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

幼年斑马鱼正逐渐成为描述简单神经回路发育与功能的模型。由于其体外受精、发育迅速且身体透明，斑马鱼特别适用于采用光遗传学方法来研究神经回路的功能。在该方法中，特定神经元中表达光敏感离子通道，使研究者能够随意激活或抑制这些神经元，从而评估它们对特定行为的贡献。在幼年斑马鱼中应用这些方法在概念上较为简单，但需要对技术细节进行优化。本文演示了一种在幼年斑马鱼体感神经元中表达一种通道视紫红质变体、光激活单个细胞并记录其行为反应的实验流程。通过在先前建立的方法基础上进行若干改进，该方法可用于诱导激活受精后至少4天内（dpf）单个神经元所引发的行为反应。具体而言，我们构建了一种转基因载体，利用体感神经元增强子CREST3驱动标记的通道视紫红质变体ChEF-tdTomato的表达。将该转基因注入单细胞期胚胎后，可在体感神经元中实现嵌合表达，并可通过共聚焦显微镜进行成像。利用473 nm的DPSS激光器发出的光，经由光纤导引，照射这些动物中已识别的细胞，可诱发可被高速摄像机记录并进行定量分析的行为反应。该技术可被调整用于研究激活任意斑马鱼神经元所引发的行为。将此方法与遗传学或药理学干预相结合，将是研究神经回路形成与功能的有力手段。

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="光纤电缆横截面图、镊子比例尺、用于光学检测的显微镜装置。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. 光纤电缆装置。 (A) 光纤电缆的分层结构。(B) 置于巴斯德移液管中的去皮光纤电缆。(C) 使用显微操作器定位的置于巴斯德移液管中的光纤电缆。
<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="薄层色谱图；5道板；尺寸；1.0 mm厚度用于化合物分离。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
 图2. 注射模具模板。
<p class="jove_con...

光遗传学技术使得研究特定神经元对行为的贡献成为可能。本文描述了一种在幼年斑马鱼中激活表达通道视紫红质变体（ChEF）的单个躯体感觉神经元的方法，该方法采用半导体泵浦固体（DPSS）激光器进行激活，并使用高速摄像机记录所引发的行为反应。

使用ChEF-tdTomato对斑马鱼体感神经元进行光遗传学激活

幼年斑马鱼正逐渐成为研究简单神经回路发育与功能的模型。由于其体外受精的特性，……

本实验的总体目标是激活幼年斑马鱼中的单个体感神经元。首先需要制备一根光纤并将其连接至A-D-P-S-S蓝光激光器，以实现这一目标。第二步是在单细胞至两细胞期的胚胎中注射转基因片段。接下来，筛选在体感神经元中表达C-H-E-F-T-D番茄荧光蛋白的脂肪胚胎，并将其固定于显微载物台上。最后一步是给予短暂的蓝光脉冲以激活单个神经元，并记录由此产生的行为反应。该技术相较于现有使用通道根部选项二的方法，其主要优势在于，本方法可用于诱导单个神经元激活后最多至少四天内的行为反应。尽管该方法目前被用于研究特定体感神经元在斑马鱼幼虫中的功能，但该方法也可加以改进，用于研究由任何斑马鱼神经元群体（如中间神经元或运动神经元）所引发的行为。这种遗传学方法可用于在活体中激活特定神经元，表征其功能发育过程，评估基因突变或对特定蛋白质进行现象学阻断对行为的影响，并绘制导致不同行为反应的下游神经网络。开始此操作时，通过在本生灯上加热玻璃制意大利面移液管的锥形颈部，制成一个用于存放光纤的储存装置，使其形成150度的夹角。接下来，使用金属丝剪刀或剃刀刀片，小心地将光纤切割成两段。每段光纤应一端裸露，另一端带有FC PC接头。然后从光缆的切割端去除5.0厘米长的光纤护套、加强纤维和涂层，使光纤仅保留包层。随后，将处理好的光纤插入已准备好的意大利面移液管中。使用钻石玻璃切割器或尖头镊子，确保光纤能够轻松地进出移液管尖端。在玻璃纤维上做一划痕，折断末端，以在纤维末端形成整齐的切口。接下来，将光纤缩回意大利面移液管中。然后在显微镜下使用显微操作器手动将光纤置于巴氏吸管中，随后用镊子对受精后24至48小时的胚胎进行COATE处理，再使用0.02%三卡因麻醉幼虫，并在荧光解剖显微镜下观察。筛选出表达Ron Beard神经元或三叉神经元的幼虫。表达稀疏且细胞易于识别的胚胎最为理想，但由于将使用光纤靶向激活单个神经元，因此较宽范围的表达密度均可接受。将幼虫转移至新的培养皿中，加入新鲜的PTU蓝色胚胎水。将胚胎置于28.5摄氏度、避光条件下培养，直至达到所需的实验阶段。在本步骤中，配制1.5%低熔点琼脂糖溶液，并加入双蒸水，置于42摄氏度的加热块中，以防止其凝固。使用玻璃巴斯德吸管，将一条预筛的幼鱼转移至含有1.5%低熔点琼脂糖的离心管中，尽量减少蓝色胚胎水的带入。然后将幼虫转移至一小滴琼脂糖中，并置于小型培养皿上。在解剖显微镜下，当琼脂糖凝固后，将幼虫 dorsal 侧朝上放置。使用一把细剃刀从幼虫两侧切去琼脂糖。用胚胎蓝水填充卵黄周围的区域。接着，在卵黄两侧各做两个对角切割，注意不要切到胚胎。然后，将卵黄从胚胎的躯干和尾部轻轻剥离。现在将高速相机安装到解剖显微镜上，并将相机连接至计算机。然后打开计算机和高速相机。启动视频成像软件并调整相机设置。接下来，将光纤、激光器和刺激器连接在一起。然后打开刺激器，将其电压设置为最大5伏，脉冲持续时间为5毫秒。随后打开激光器。接下来，使用荧光解剖显微镜将光纤的尖端定位在表达 C-H-E-F-T-D 番茄的神经元胞体附近。给予一束蓝光脉冲以激活该感觉神经元，随后使用高速相机记录其反应。设置为每秒500或1000帧，并在每次激活之间间隔至少一分钟，以避免习惯化，用镊子小心释放前部的火山物质，注意不要损伤动物。然后将其转移至新鲜的蓝色胚胎水中。可让动物继续发育，并可在更晚的发育阶段重复该操作。也可将胚胎重新安装，以便对激活的细胞进行高分辨率共聚焦成像，从而将细胞行为与细胞结构相关联。此处所示的斑马鱼幼鱼部分固定于1.5%低熔点琼脂糖中，其头部周围由虚线表示。三叉神经元和罗汉须神经元以红色显示，口部细胞在图示中由虚线勾勒。以下是一段视频，显示在约35小时受精后（HPF）的幼鱼中，单个表达C-H-E-F-T-D番茄的罗汉须神经元被激活，可引发行为反应。该视频展示了在60小时受精后（HPF）的幼鱼中，表达C-H-E-F-T-D番茄的罗汉须神经元被激活的情况，而另一段视频则展示了在4天受精后（DPF）的幼鱼中，表达C-H-E-F-T-D番茄的罗汉须神经元被激活的情况。一旦掌握该技术，这种基因操作方法可在一小时之内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何在不同时间点激活单个神经元以及幼年 Libra 鱼。请务必注意，使用激光可能存在极高风险，在进行该操作时应始终采取适当的安全防护措施。

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科研

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