Name: 天真成人干细胞的分离从初级人类成纤维细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学习从原代人成纤维细胞培养中分离天真多能皮肤来源前体细胞的方法。该技术利用细胞抗应激特性筛选SKP细胞，可形成球体并扩增培养，表达nestin、OCT4和Nanog等干细胞标志物，具有向平滑肌细胞分化的潜能，为再生医学研究提供新工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由亚历山大·冯·洪堡基金会（5090371）、克里斯廷·屈内过敏研究与教育中心（CK-CARE）以及巴伐利亚州立部（资助给 K.D.）提供支持。

1. 从原代成纤维细胞培养物中分离SKP
<ol>
 <li>成纤维细胞培养物，无论是来自细胞库还是直接从皮肤活检获得，均在含有15%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、10 mg/ml青霉素和10 mg/ml链霉素的DMEM成纤维细胞生长培养基中进行培养。</li>
</ol>
人成纤维细胞系GMO3349C和GMO8398A购自科里尔医学研究所（美国新泽西州卡姆登），并用于本研究。
<ol start="2">
 <li>使用群体倍增数（PPDs）20至35的细胞进行SKP培养，细胞融合度为80%。一个10 cm组织培养皿（BD Falcon）约含有1.5×106个细胞。</li>
 <li>用PBS洗涤细胞，并加入2 ml胰蛋白酶溶液（0.25%，Invitrogen），在37 °C孵育1小时。</li>
 <li>用5 ml PBS从培养皿中收集细胞，并将细胞悬液转移至15 ml Falcon管中。</li>
 <li>将细胞在4 °C孵育24小时。</li>
 <li>配制SKP生长培养基：DMEM-F12（3:1，V/V）、40 ng/ml FGF2（BD Biosciences）、20 ng/ml EGF（BD Biosciences）、B27无血清添加剂2%（Invitrogen）、1 μg/ml Fungizone（Invitrogen）和25 μg/ml庆大霉素（Gentamycin，Invitrogen）。</li>
 <li>在1,200 rpm离心5分钟收集细胞，直接将细胞沉淀重悬于4 ml SKP生长培养基中。将细胞悬液转移至25 cm2组织培养瓶（BD Falcon）中。</li>
 <li>将培养瓶置于37 °C培养，并每日观察培养物，持续3至4周，监测球体形成情况。</li>
</ol>
2. 球体培养条件
<ol>
 <li>在 37 °C、5% CO2 条件下，将细胞培养于 25 cm2 培养瓶（BD Falcon）中。</li>
 <li>每天剧烈振摇培养瓶，防止细胞贴壁附着于瓶底。如有必要，使用 2 ml 无菌移液器反复吹打，使贴壁细胞脱落，并将培养物转移至新的培养瓶中。</li>
 <li>最初形成的球状体通常在 3 至 4 天内开始出现。</li>
 <li>让球状体沉降至培养瓶底部，每 3 天更换一半培养基。为维持生长因子的终浓度，需将 2 倍浓度的生长因子加入新配制的 SKP 生长培养基中。</li>
 <li>培养体积应保持恒定，最大不超过 4 ml。</li>
 <li>当球状体直径达到约 200 mm 时，应通过使用 2 ml 移液器剧烈反复吹打，将球状体破碎为较小体积进行传代。</li>
 <li>将培养物分至两个 25 cm2 培养瓶（BD Falcon）中，并按照步骤 2.4 所述方法继续培养球状体。</li>
 <li>在培养第 16 至 21 天收集球状体，用于干细胞标志物的检测。</li>
</ol>
步骤 2.6) 和 2.7) 描述了球体的传代过程，其目的为：(1) 使 SKP 培养基中的营养物质和生长因子能够进入每个球体内的所有细胞；(2) 在使用前扩增 SKP 球体培养物。
在我们的培养条件下，球体培养物通常能够维持生长达三个月，并传代3至4次。
3. 干细胞标志物的免疫细胞化学检测
<ol>
 <li>在第16至21天用PBS收集球状培养物。以1,000 rpm离心5分钟使培养物沉淀。</li>
 <li>将球状体重悬于少量 PBS 中。</li>
 <li>用DAKO笔在显微镜载玻片（Fisher品牌）上画两个直径约为0.5 μm的圆圈。</li>
 <li>加入50 μl球形悬浮液至各圆圈内。</li>
 <li>通过光学显微镜检查每滴液滴中是否存在球状结构。</li>
 <li>在通风橱下让液滴自然干燥。</li>
 <li>可将载玻片在 -80 °C 冰箱中冷冻保存，或直接进行免疫荧光染色实验。</li>
 <li>免疫荧光染色时，将载玻片置于 -20 °C 的预冷甲醇（100%）中固定 10 分钟。</li>
 <li>用 PBS 洗涤载玻片。</li>
 <li>用 PBS/10% 胎牛血清 / 0.02% Triton X-100 封闭载玻片，至少 1 小时。</li>
 <li>孵育一抗（例如 抗Nestin、抗Oct4、抗TG30、抗Nanog抗体， 表3在封闭缓冲液（PBS/10% FBS）中稀释，室温孵育2小时或4 °C过夜。</li>
 <li>用封闭缓冲液洗涤3次，室温下与二抗孵育1小时。</li>
 <li>用封闭缓冲液洗涤3次，再用PBS洗涤3次。</li>
 <li>使用 Vectashield 封片剂（Vector Inc.）封片。</li>
 <li>通过免疫荧光显微镜分析样品中干细胞标志物的表达。</li>
</ol>
4. 干细胞标志物表达水平的实时 PCR 分析
<ol>
 <li>取第18至21天的球体培养物约2-3 ml。</li>
 <li>在1,200 rpm下离心5分钟以沉淀球体，并吸除全部培养基。</li>
 <li>使用RNeasy Minikit（Qiagen，Valencia，CA）从球体中提取RNA。</li>
 <li>通过分光光度法和琼脂糖凝胶电泳评估RNA纯度。</li>
 <li>以总细胞RNA为模板，使用Omniscript逆转录酶（Qiagen）合成cDNA。</li>
 <li>采用Realtime-PCR验证干细胞标志物，使用针对干细胞标志物的引物（见表1），在Power SYBR Green PCR Mastermix（Applied Biosystems）中进行反应，每种引物终浓度为375 nM，模板量为50 ng，反应体系为20 μl。以内源性对照GAPDH进行标准化。</li>
 <li>扩增程序为：95 °C预变性2.5分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性5秒和60 °C退火延伸20秒。</li>
 <li>采用2(ΔΔCt)法8分析实验结果。</li>
</ol>
5. 定向分化为平滑肌细胞
<ol>
 <li>将第21至26天的球体接种到6孔培养板（BD Falcon）中的SKP培养基中。</li>
 <li>在SKP培养基中孵育72小时，使细胞从球体中贴壁并迁移生长。</li>
 <li>通过更换为平滑肌细胞（SMC）分化培养基启动SMC分化，该培养基包含高糖Dulbecco改良Eagle培养基（Invitrogen）、5%胎牛血清（FBS）、5 ng/ml PDGF-BB（Invitrogen）和2.5 ng/ml TGF-β1（Invitrogen）。</li>
 <li>在培养期间，每隔3天更换一次新鲜配制的SMC分化培养基，持续3至4周。</li>
 <li>培养3至4周后，通过免疫组织化学方法检测SMC标志物的表达。</li>
 <li>细胞用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定10分钟。</li>
 <li>用含0.3% Triton X-100的PBS溶液对细胞进行通透处理，持续30分钟。</li>
 <li>室温下用抗αSMA抗体（MO851, Dako, 1:100）或抗calponin抗体（M3556, Dako, 1:100）孵育细胞1小时，随后按步骤3.12）至3.15）所述方法进一步处理。</li>
</ol>

<ol><li>Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+dermal+cells+differentiate+into+adipogenic+and+osteogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages.</a> Exp. Dermatol. 12, 849(2003).</li>
<li>Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518(2006).</li>
<li>Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells%3A+turning+over+new+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells: turning over new leaves.</a> Cell. 128, 445(2007).</li>
<li>Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+skin-derived+precursors%3A+from+biology+to+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Vurr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation.</a> Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522(2009).</li>
<li>Toma, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+dermis+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.</a> Nat. Cell Biol. 3, 778(2001).</li>
<li>Fernandes, K. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dermal+niche+for+multipotent+adult+skin-derived+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells.</a> Nat. Cell Biol. 6, 1082(2004).</li>
<li>Wenzel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+adult+stem+cells+from+patients+with+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+express+low+levels+of+progerin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Bio.+Open%22%5BJournal%5D)">Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo.</a> Bio. Open. 1, (2012).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402(2001).</li>
<li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skin-derived+precursors+%28SKPs%29+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocol. 1, 2803(2006).</li>
<li>Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+multipotent+skin-derived+precursors+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin.</a> Stem Cells. 23, 727(2005).</li>
<li>Fernandes, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+neurogenic+potential+of+multipotent+skin-derived+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors.</a> Electrophoresis. 201, 32(2006).</li>
<li>Hill, lK. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+vascular+progenitor+cells+capable+of+endothelial+and+smooth+muscle+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function.</a> Exp. Hematol. 38, 246(2010).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

采用本文所述方法，可从原代真皮成纤维细胞培养物中分离出未分化的真皮干细胞。利用该方法，我们近期报道了从罕见遗传病——Hutchinson-Gilford 早衰综合征患者来源的成纤维细胞培养物中分离并鉴定成体干细胞的研究结果7。如本文所示，这些前体细胞表达干细胞标志物，具有自我更新能力，并可被诱导分化为包括成纤维细胞和平滑肌细胞在内的多种细胞谱系（详见 Wenzel et al.，2012 年的图4）7。与先前报道的从哺乳动物皮肤样本中分离 SKPs 的方法相比，本方法具有多项优势10。SKP 可从 freshly 建立的皮肤活检来源的原代成纤维细胞培养物中分离，也可从全球细胞库中已有的原代成纤维细胞培养物中获取。这一新方法为研究成体干细胞在各种遗传性和罕见疾病发病机制中的作用提供了可能，尤其适用于皮肤样本难以获得的情况。最后，该方法为进一步探索成体干细胞生物学特性及其在生理和疾病状态下的作用机制提供了契机。综上所述，该方法提供了一种新颖且快速的途径，用于分离皮肤来源的前体细胞。

<table><tbody><tr><td>DMEM 高糖</td><td>Invitrogen</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 低糖</td><td>Invitrogen</td><td>21885-108</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td>终浓度：200 mM</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>终浓度：10 mg/ml / 10 mg/ml</td></tr><tr><td>胰蛋白酶溶液（0.25%）</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>F-12 培养基（Ham 配方）</td><td>Invitrogen</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>BD Biosciences</td><td>4114-TC-01M</td><td>终浓度：40 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>BD Biosciences</td><td>236-EG-200</td><td>终浓度：20 ng/ml</td></tr><tr><td>PDGFBB</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0043</td><td>终浓度：5 ng/ml</td></tr><tr><td>TGF-β1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9204</td><td>终浓度：2.5 ng/ml</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>Omnilab</td><td>FALC353109</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Roth</td><td>8388.2</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂</td><td>Vector Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 小量试剂盒</td><td>Qiagen, Valencia, CA</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript 逆转录酶</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen 超级混合液</td><td>BioRad</td><td>172-5201</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B（Fungizone）</td><td>Invitrogen</td><td>15290-018</td><td>终浓度：1 mg/ml</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表2. 特异性试剂与仪器。&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

从原代人成纤维细胞培养物中分离未分化的成体干细胞

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

在过去十年中，已在人类皮肤中鉴定出多种成体干细胞群体1-4。多能性成体真皮前体细胞的分离最初由 Miller F. D 实验室首次报道5, 6。这些早期研究描述了一类来源于成年哺乳动物真皮的多能前体细胞群体5。这些细胞被称为SKPs（皮肤来源前体细胞），可从啮齿类动物和人类皮肤中分离并扩增，并可分化为神经源性和中胚层来源的子代细胞，包括一些在皮肤中从未发现过的细胞类型，例如神经元5。对培养的SKPs进行的免疫细胞化学研究表明，这些细胞表达波形蛋白（vimentin）和巢蛋白（nestin）——后者是一种在神经和骨骼肌前体细胞中表达的中间丝蛋白，此外还表达纤维连接蛋白以及多能干细胞标志物6。迄今为止，成体干细胞群体SKPs均是从新鲜采集的哺乳动物皮肤活检样本中分离获得的。
近期，我们已建立并报道了一种来源于皮肤的前体细胞群体，可能存在于从皮肤活检样本建立的成纤维细胞原代培养物中7。我们认为，在早期群体倍增阶段的成纤维细胞原代培养物中可能存在少量体细胞干细胞，这一假设基于以下观察结果：（1）皮肤来源的前体细胞（SKPs）与成纤维细胞原代培养物均来源于真皮层，因此在成纤维细胞原代培养物中可能残留少量SKP细胞；（2）由冻存 aliquots 建立的成纤维细胞原代培养物，若在储存或转运过程中经历了不利温度条件，则其中仍可存活少量细胞7。这些稀有细胞能够扩增，并可连续传代数次。该现象提示，在人成纤维细胞培养物中存在少量具有高增殖潜能且对压力具有抵抗能力的细胞7。
我们利用这些发现建立了一种从原代成纤维细胞培养物中快速分离成体干细胞的方案，而这类培养物可从全球各地的组织库中 readily 获得（图1）。该方法具有重要意义，因为它能够在无法获取皮肤样本的情况下，利用组织库中可能存在的成纤维细胞培养物来分离前体细胞，从而为解析罕见遗传性疾病的分子机制以及在体外建立疾病模型开辟了新的途径。

我们最近报道过，在原代真皮成纤维细胞培养物中存在一类细胞群体，这类细胞在含有EGF和FGF2的受控培养条件下可选择性扩增并形成SKP球体（图1）7。
本研究使用了来自妊娠后第15至25天（PPD 15–25）的成纤维细胞培养物，这些培养物通常对应于细胞库中可获得的原代成纤维细胞株。按照本方法所述，将成纤维细胞培养物进行低温处理联合营养剥夺的双重处理24小时后，可重复地获得含有悬浮球体（也称为类胚体EB）的培养物，这些球体的生长特性与先前报道的直接从皮肤样本中获得的SKP相似7, 9。
本文展示了我们近期报道的一种方法7，可从原代成纤维细胞培养物中分离出一群细胞，其特性与多能性神经干细胞/前体细胞相似。后者是在人和小鼠真皮中利用神经球培养条件分离并鉴定的5, 10, 11。这些来源于原代人成纤维细胞培养物的SKP具有自我更新能力，可在体外（in vitro）持续扩增和传代至少三个月（详见方法...

我们报道了一种从原代人成纤维细胞培养物中分离出原始多能皮肤来源前体（SKP）细胞的方法。我们证明，这些源自成纤维细胞培养物的SKP细胞与直接从人皮肤活检组织中获得的SKP细胞具有相似的干细胞特性。这些细胞表达神经嵴标志物nestin，以及OCT4和Nanog等多能性标志物。

在过去十年中，已在人类皮肤中鉴定出多个成体干细胞群体1-4。多能性成体真皮前体细胞的分离……

本实验的总体目标是从原代人成纤维细胞培养物中分离出原始的多能性皮肤来源前体细胞。首先，建立原代成纤维细胞培养体系，并根据细胞对温度变化和营养耗竭等应激条件的耐受性，筛选出原始的皮肤来源前体细胞。随后，在受控的生长条件下培养这些细胞，使其形成球形结构，并持续培养数周以促进球形结构的生长与扩增，从而证明这些前体细胞具有与成体干细胞相似的特性。最终，SKP 细胞可被诱导分化为平滑肌细胞。我最初产生这一方法的想法，是在观察经历储存或运输过程中因温度变化而受到应激的原代成纤维细胞结构的冷冻 OTs 时，发现仍有少数细胞保持增殖能力。这提示少量细胞对胁迫具有抗性，可能是皮肤来源的干细胞，表明该操作方法具有相关性。我实验室中一名参与从人成纤维细胞培养物中分离SKP方法开发的研究生。对于SKP分离培养，将成纤维细胞培养至群体倍增数为20至35，汇合度达80%。用PBS洗涤细胞一次，加入2毫升胰蛋白酶溶液，在37摄氏度下孵育1小时。用5毫升PBS收集细胞，将细胞悬液转移至15毫升Falcon管中，然后在4摄氏度下孵育24小时。以1200 RRP M离心5分钟。将细胞沉淀直接重悬于4 mL SKP生长培养基中，置于37°C、5% CO₂条件下每日培养。必要时剧烈摇晃培养瓶，以防止细胞贴壁。使用2 mL无菌移液管吹打贴壁细胞使其脱落，并将培养物转移至新的培养瓶中。当最初类球体在三到四天后开始形成时，让类球体沉降，并用新配制的含有两倍生长因子的 SKP 增殖培养基更换一半培养液。每三天补充一次培养基，并传代直径约 200 微米的类球体。通过剧烈吹打使类球体解离，然后将培养物分至两个 25 平方厘米的培养瓶中，并在第 16 至 21 天补充培养基。收集球体用于干细胞标志物的筛选。通过离心将培养物沉淀，然后用去笔将球体重悬于少量 PBS 中。在载玻片上画两个直径约为0.5微米的圆，将50微升微球悬浮液加入每个圆内。通过显微镜检查每滴液体中微球的存在。然后将样品放置干燥，用于免疫荧光染色。用预冷的100%甲醇固定载玻片10分钟。用PBS洗涤一次。接下来，封闭样品至少一小时。在室温下用一抗溶液孵育两小时。用封闭缓冲液洗涤三次后，在室温下用二抗孵育一小时。然后用封闭缓冲液洗涤三次，再用PBS洗涤三次。用Fecta Shield封片剂封片。随后通过免疫荧光显微镜分析样品中干细胞标志物的表达。首先，通过离心收集第18至21天的球形培养物，约两到三毫升，形成沉淀，并吸去所有培养基。使用RN easy mini试剂盒分离RNA。然后通过分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度。接下来，以总细胞RNA为模板合成CD NA。现在通过实时PCR验证干细胞标志物，使用Power Cyber Green PCR预混液，每种引物浓度为375纳摩尔，模板量为50纳克。在20微升的反应体系中，需包含gapDH检测作

nave-adult-stem-cells-isolation-from-primary-human-fibroblast-cultures

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

天真成人干细胞的分离从初级人类成纤维细胞培养

本文介绍了一种从野生啮齿类动物皮肤和肺组织中分离并维持原代成纤维细胞培养物的实验方案。...

建立来自啮齿类动物的原代成纤维细胞培养物

介绍了一种从人皮肤中快速、高效分离活体成年上皮干细胞的方法。该方法利用酶消化皮肤胶原基质，随后拔取毛囊，并分离单细胞悬液或组织碎片用于细胞培养。...

从成人皮肤中分离和培养表皮干细胞

本文介绍了一种从人类毛囊中分离和培养神经嵴干细胞的可靠方案。...

从人毛囊中分离和培养神经嵴干细胞

尽管目前仍在持续努力将细胞培养体系转向无饲养层条件，人类胚胎干细胞（hESC）的分离与培养在很大程度上仍依赖于与小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的共培养。本文中，我们展示了一种在实验前快速去除hESC培养物中饲养层细胞的新型方法。...

高密度人胚胎干细胞培养中快速去除成纤维细胞

本视频演示了一种分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞（iNPCs）的技术。该方法概述了分离iNPC克隆并将其培养于经层粘连蛋白包被的多孔板孔中的步骤，同时使用适宜的培养基，以促进iNPC群体的持续增殖与扩增。...

分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞克隆

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

成纤维细胞的行为涉及一系列临床疾病实体，但由于其内在的异质性，这些行为仍缺乏充分表征。传统的成纤维细胞研究依赖于体外（in vitro）操作，掩盖了其在体（in...

通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

通过使用非整合型仙台病毒（SeV）载体介导的皮肤成纤维细胞重编程，成功实现了人诱导性多能干细胞（hiPS细胞）的高效获得。hiPS细胞的维持和克隆扩增采用无异源成分且化学成分明确的培养条件，使用重组人源层粘连蛋白521（LN-521）基质和Essential...

使用层粘连蛋白521基质无整合方法建立人诱导多能干细胞

本文介绍一种具有临床相关性、高效且无需饲养层的重编程方法，利用编码重编程因子的修饰mRNA以及成熟的microRNA-367/302模拟物，将人原代成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。文中还包括评估重编程效率、扩增单克隆iPSC集落以及验证多能性标志物TRA-1-60表达的方法。...

基于RNA的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

我们介绍一种简单、快速且可靠的原代成年成纤维细胞分离方案，初学者（例如学生）也可操作。该方法结合了酶消化组织与超声波机械振荡，以获取原代成纤维细胞。本方案可轻松根据特定实验需求进行调整（例如用于人体组织）。...

超声增强的成年成人原代成纤维细胞分离

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

学习从原代人成纤维细胞培养中分离天真多能皮肤来源前体细胞的方法。该技术利用细胞抗应激特性筛选SKP细胞，可形成球体并扩增培养，表达nestin、OCT4和Nanog等干细胞标志物，具有向平滑肌细胞分化的潜能，为再生医学研究提供新工具。

从原代人成纤维细胞培养物中分离未分化的成体干细胞

探索更多视频