基质血管细胞的分离与向米色/褐色样细胞的分化

本实验的总体目标是分离原代脂肪细胞，并在体外培养中诱导其分化为米色或亮色脂肪细胞。第一步是从小鼠中解剖获取脂肪组织。接下来，使用胶原酶对组织进行消化。

一旦分离出基质血管组分，便将细胞接种培养。最后一步是诱导这些细胞分化为米色或亮色脂肪细胞。最终通过分析方法检测褐色脂肪细胞特异性基因表达水平的升高。

该方法有助于解答棕色脂肪组织中的关键问题，即何种分子机制调控了明细胞（be细胞）的发育。该技术的应用前景涉及肥胖症及其他生活方式相关疾病的治疗。由于对人体棕色脂肪组织进行调控可作为一种潜在的治疗干预手段，因此第一步是制备消化液。

安乐死后，取出脂肪组织。首先，沿动物背部直至颈部进行切割，分离肩胛间棕色脂肪组织（bat）。在肩部之间的皮肤下方，可找到两叶棕色脂肪组织。

接下来，小心去除覆盖在蝙蝠体表的白色脂肪薄层。分离后，将组织直接放入干净的 PBS 中。腹股沟白色脂肪组织（wat）位于两侧皮肤下方。

延伸至大腿内侧并向下靠近睾丸。去除组织并置于干净的PBS中。以下步骤同时适用于蝙蝠样本和湿样本。

迅速清除组织切片上的所有污染物，如毛发、骨骼肌和结缔组织。接着，用纸巾快速吸干组织以防止 PBS 稀释解剖液，并将其放置于干燥的培养皿上。加入消化液，并将组织剪切成小块。

接下来，将组织转移至含有剩余消化液的50毫升离心管中。将离心管置于37摄氏度的培养箱中，在持续振荡条件下消化40至50分钟。每10到15分钟检查一次，以确保消化顺利进行，并防止过度消化。

组织充分消化后，终止消化反应。加入5 mL完全培养基并充分混匀，细胞应几乎完全呈均一状态。接下来，将样品以700 × g离心10分钟。

此时，基质血管组分应可见为管底的棕褐色沉淀物，吸去顶部的油性成熟脂肪细胞层及大部分液体层。接着，将沉淀物溶解于10毫升完全培养基中，并充分混匀。混匀后，在一个新的50毫升管上放置细胞筛网，过滤细胞悬液。

将过滤后的细胞悬液转移至15毫升离心管中，在700 × g条件下离心10分钟。随后吸除上清液并重悬细胞沉淀。根据需要，用10毫升完全培养基通过移液器吹打混匀后接种细胞。

通常情况下，五只小鼠可获得两块10厘米的腹股沟白色脂肪组织培养板和一块棕色脂肪组织培养板。接种后一至两小时，吸去培养基，用PBS洗涤两次，然后加入新鲜培养基。

此步骤非常重要，因为它可以去除红细胞、免疫细胞及其他污染物。提前准备好维持培养基和诱导培养基。当原代脂肪细胞生长至95%到97%融合时，用诱导培养基替换常规完全培养基。

48小时后，更换为含有0.5微摩尔RO格列酮的维持培养基。再经过额外48小时后，更换为新鲜的维持培养基，其中含1微摩尔RO格列酮，继续培养额外的两到三天。诱导后大约三到四天会出现液滴，如图所示为首次添加诱导培养基后六到七天的情况。

细胞应完全分化为成熟的脂肪细胞，并充满脂滴。现在可收集细胞并用于进一步分析。可通过定量逆转录聚合酶链反应（Q-R-T-P-C-R）检测棕色脂肪特异性或选择性基因的mRNA来评估原代脂肪细胞的米色化，如此处所示。

RO格列酮显著诱导了UCP1 mRNA的表达，FORSKOLIN处理（此处指定为环磷酸腺苷）进一步增强了RO格列酮诱导的UCP1表达。Cdia是另一种棕色脂肪特异性基因，也以剂量依赖的方式显著上调。RO格列酮处理还增加了FABP4以及棕色和白色脂肪共同的脂肪生成标志物的表达。

这种褐变效应并不仅仅归因于脂肪生成本身得到增强。由于即使将 mRNA 水平标准化至 FABP4 后，UCP1 和 CD36 表达的诱导仍然显著，因此该蛋白印迹实验确认了 UCP1 蛋白水平的升高。观看本视频后，您应能很好地掌握如何分离前脂肪细胞，以及如何在体外培养中将这些细胞分化为米色或褐色脂肪细胞。