Name: 米色/布里特细胞的间质血管细胞的分离和分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学习从小鼠脂肪组织中分离基质血管细胞并诱导其分化为米色/布里特细胞的方法。该技术通过胶原酶消化和体外培养，帮助研究人员研究脂肪细胞褐变的分子机制，为肥胖及相关代谢疾病的治疗提供重要实验模型。

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感谢Haruya Ohno、Kosaku Shinoda、Louis Sharp、Emi Tomoda和Lauren Ruiz在讨论、技术协助以及稿件编辑方面提供的帮助。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目号DK087853）、突破性生物医学研究计划以及Asubio Pharm Inc.向S.K.提供的资助。U.L.A.获得了哥本哈根大学SHARE博士奖学金以及欧盟第七框架计划DIABAT项目（HEALTH-F2-2011-278373）向Lise Madsen和Karsten Kristiansen提供的资助。同时，我们感谢DERC中心资助（NIH P30 DK063720）的支持。

1. 准备消化液
每5只小鼠每种组织制备5 ml（约每1 g脂肪组织1 ml）。
<ol>
 <li>称取消化酶：
 - 胶原酶 D：1.5 u/ml（1108874103，1 g，Roche，70334223）
 - 中性蛋白酶 II：2.4 u/ml（04942078001，0.980 mg/lyo，Roche，11466200）
 </li>
 <li>加入 25 ml PBS，充分混匀以溶解</li>
 <li>在组织消化前立即加入 CaCl2，终浓度为 10 mM</li>
</ol>
2. 从小鼠中解剖脂肪组织
<ol>
 <li>解剖操作应小心进行，并在小鼠（6-8周龄）处死后立即开展。打开小鼠前，先用乙醇喷洒其体表毛发以确保无菌操作。将组织直接放入洁净的PBS中，分离肩胛间棕色脂肪组织（BAT）和腹股沟皮下白色脂肪组织（WAT）。</li>
 <li>对于肩胛间BAT：将小鼠背部朝上放置，沿背部切开至颈部。棕色脂肪组织位于肩部之间皮肤下方浅层，肉眼可见两个叶状、形似蝴蝶的结构。应小心去除覆盖在BAT表面的一层薄薄的白色脂肪。</li>
 <li>对于皮下WAT（腹股沟WAT）：去除皮肤后，可在身体两侧皮肤下方发现腹股沟WAT，其位置自近背部起始，沿大腿内侧延伸，向下接近睾丸区域。</li>
</ol>
3. 切割并消化脂肪组织
<ol>
 <li>迅速清除组织切片上的所有污染物，如毛发、骨骼肌和结缔组织。</li>
 <li>用纸快速吸干组织，避免PBS稀释解剖液，并将组织置于干燥的培养皿上。</li>
 <li>加入消化液（消化前已添加CaCl2），并将组织切成小块。使用5 ml移液器反复吹打，充分混匀。将切碎的组织连同剩余消化液转移至50 ml离心管中，继续通过反复吹打进一步混匀。</li>
 <li>在37 °C、150 rpm持续振荡条件下消化40–50分钟。每10–15分钟检查一次，确保消化进展正常，并防止过度消化。</li>
</ol>
注意：正确的消化液和消化时间非常重要。组织需要充分消化，但过度消化可能会损伤细胞。
4. 过滤细胞悬液
<ol>
 <li>加入 5 ml 完全培养基（含 10% FPS 和 P/S 的 DMEM/F12）以终止消化。此时细胞应几乎完全均一。用移液器充分混匀。</li>
 <li>以 700 × g 离心 10 分钟。</li>
 <li>此时可见管底有棕褐色沉淀，即基质血管组分（SVF）。吸除上层油状成熟脂肪细胞层及大部分液体层，保留沉淀，并将其溶解于 10 ml 完全培养基中。充分混匀。</li>
 <li>将细胞滤网（50–70 μm 直径）置于新的 50 ml 管上，过滤细胞悬液。</li>
</ol>
5. 铺板细胞
<ol>
 <li>将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在700 × g条件下离心10分钟。</li>
 <li>吸除上清液，用10 ml完全培养基重悬沉淀，用移液器吹打混匀。</li>
 <li>估算所需培养皿数量，该数量可能因沉淀体积而异。一般经验为：每5只小鼠的腹股沟白色脂肪组织可接种2个10 cm培养皿，棕色脂肪组织可接种1个10 cm培养皿。</li>
 <li>在胶原蛋白包被的培养皿（R&amp;D）中，用完全培养基接种细胞。</li>
 <li>接种细胞后1–2小时，吸除培养基，用PBS洗涤两次，然后加入新鲜培养基。此步骤至关重要，可去除红细胞、免疫细胞及其他污染物。</li>
</ol>
6. 细胞分化
<ol>
 <li>制备维持培养基和诱导培养基。</li>
</ol>
维持培养基
添加成分后的完全培养基：
胰岛素，终浓度 5 μg/ml（5 mg/ml 储存液，***将 100 μl 乙酸加入 10 ml H2O 中配制 pH 2.5 的酸化水。将胰岛素溶解于酸化水中。储存液保存于 -20 °C）
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3），终浓度 1 nM（10 μM 储存液，***将 T3 溶于 1N NaOH 中，再加入培养基配制成 10 μM 储存液。Sigma 货号 T-2877）
4 °C 下保存，可稳定一周
诱导培养基
含有以下成分的维持培养基：
吲哚美辛，终浓度 125 μM（乙醇中 0.125 M 储存液，Sigma 货号 I-7378）。吲哚美辛需加热至 60 °C 方可溶解。
地塞米松，终浓度 2 μg/ml（乙醇中 2 mg/ml 储存液，Sigma 货号 D-1756） 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），终浓度 0.5 mM（DMSO 中 0.25 M 储存液，Sigma 货号 I-5879） 罗格列酮，终浓度 0.5 μM（DMSO 中 10 mM 储存液，Sigma 货号 R-2408）
注意：每次均需新鲜配制诱导培养基。
<ol start="2">
 <li>在完全培养基中培养原代脂肪细胞，直至细胞融合度达到95-97%（融合但不过于密集）</li>
 <li>将常规完全培养基更换为诱导培养基（第0天）</li>
 <li>48小时后（第2天），更换为含罗格列酮（0.5 μM）的维持培养基</li>
 <li>再过48小时后（第4天），更换为新鲜的含罗格列酮（1 μM）的维持培养基，继续培养2-3天。加入诱导培养基后6-7天，细胞完全分化为成熟的脂肪细胞，并充满脂滴。脂滴通常在诱导后3-4天开始出现</li>
</ol>
注意：每2-3天更换一次培养基，直至细胞完全分化。
现在可以收集细胞，并通过qRT-PCR检测Ucp1及其他棕色脂肪细胞特异性基因的mRNA表达水平。蛋白质检测将采用蛋白质印迹法（Western blot）进行。

<ol><li>Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%3A+genetic%2C+molecular%2C+and+environmental+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).</li>
<li>Rothwell, N. J., Stock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+cafeteria+and+tube-feeding+on+energy+balance+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A(1979).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).</li>
<li>Zingaretti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+UCP1+demonstrates+that+metabolically+active+adipose+tissue+in+the+neck+of+adult+humans+truly+represents+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+controls+a+brown+fat%2Fskeletal+muscle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454, 961-967 (2008).</li>
<li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+%28PPARgamma%29+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent%2C+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).</li>
<li>Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fat+interacts+with+QTLs+controlling+induction+of+Pgc-1+alpha+and+Ucp1+during+conversion+of+white+to+brown+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat.</a> Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).</li>
<li>Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-induced+recruitment+of+brown+adipose+tissue+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis.</a> Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins%2C+leukotrienes%2C+and+essential+fatty+acids%22%5BJournal%5D)">The adipose organ.</a> Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).</li>
<li>Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+brown+adipocytes+in+white+adipose+tissue+during+CL+316%2C243-induced+reversal+of+obesity+and+diabetes+in+Zucker+fa%2Ffa+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders%3A+Journal+of+the+International+Association+for+the+Study+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats.</a> International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).</li>
<li>Hansen, J. B., Kristiansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+circuits+controlling+white+versus+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation.</a> The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).</li>
<li>Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARy+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+properties+of+adipocytes+in+the+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).</li>
<li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).</li>
<li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+%28PPARgamma%29+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent%2C+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).</li>
<li>Rong, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+mitochondrial+biogenesis+is+suppressed+in+db%2Fdb+and+high-fat+diet-fed+mice+and+improved+by+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone.</a> Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).</li>
<li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).</li>
<li>Sell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonism+increases+the+capacity+for+sympathetically+mediated+thermogenesis+in+lean+and+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).</li>
<li>Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+thiazolidinedione%2C+NC-2100%2C+which+is+a+weak+PPAR-gamma+activator%2C+exhibits+potent+antidiabetic+effects+and+induces+uncoupling+protein+1+in+white+adipose+tissue+of+KKAy+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice.</a> Diabetes. 49, 759-767 (2000).</li>
<li>Vernochet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+and+the+corepressors+CtBP1+and+CtBP2+regulate+repression+of+select+visceral+white+adipose+genes+during+induction+of+the+brown+phenotype+in+white+adipocytes+by+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).</li>
<li>Tai, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+nuclear+receptor+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+promotes+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).</li>
<li>Sugii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARgamma+activation+in+adipocytes+is+sufficient+for+systemic+insulin+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

在此，我们介绍一种可靠的细胞体系，用于研究小鼠原代培养脂肪细胞中米色/棕色样（beige/brite）细胞的发育。与目前已有的多种永生化细胞系相比，该体系可能更贴近白色脂肪组织褐变的生理过程 体内.
尽管对这些原代脂肪细胞的研究具有一些优势，但也存在一些重要的局限性和需要注意的问题。首先，该体系高度依赖于细胞的分化潜能。例如，棕色脂肪特异性基因 Ucp1 和 Cidea 的表达尤其依赖于分化程度。以 PPARγ 激动剂和 BMP7 为例，它们也能促进脂肪生成，因此必须在分化程度相近的细胞中合理评估其“棕色化”效应。或者，如 图 1D 和 E 所示，将棕色脂肪特异性基因的表达水平与脂肪生成标志基因（如 Fabp4）的表达进行归一化处理，可能是一种有效的分析方法。其次，小鼠的年龄至关重要。尽管使用体型较大的小鼠可能有助于获得更多数量的细胞，但由于分化能力随年龄增长而下降，因此这种做法并不理想。利用该培养体系，研究冷暴露、肥胖、胰岛素抵抗或衰老等内外...

肥胖在全球范围内急剧增加，现已被视为公共卫生最严重的威胁之一1。该状况与能量摄入与消耗之间的失衡有关，导致多余能量以脂质形式储存在白色脂肪组织（WAT）中。WAT体积增大与体重和体质量增加相关，而棕色脂肪组织则具有将多余能量以热能形式耗散的能力。因此，棕色脂肪组织（BAT）可在抵御寒冷和肥胖方面发挥保护作用2,3。这一过程通过线粒体中解偶联蛋白1（UCP1）介导的电子传递链解偶联实现。该蛋白被认为是BAT中非颤抖性产热的标志性分子3。近年来多项研究表明，成年人体内存在有功能活性的BAT4-8，因此，调控人体BAT功能可能成为对抗肥胖及其相关疾病的一种潜在治疗策略。
现有证据表明，啮齿类动物体内存在两种类型的棕色脂肪细胞；“经典型”或“先天性”棕色脂肪在产前阶段发育形成，并在肩胛区及其他外周组织中构成专门的棕色脂肪库。另一方面，“可诱导型”棕色脂肪（即所谓的米色或 beige 细胞）在出生后阶段发育，散在分布于白色脂肪组织中。这两种棕色脂肪细胞还具有不同的发育起源。其中，先天性棕色脂肪细胞起源于类似成肌细胞的前体细胞。 Myf5 前体细胞，WAT中散在的可诱导的米色/褐色细胞来源于非-Myf5 谱系9,10 此外，该细胞类型的调控通路可能与 Myf5-来源的棕色脂肪细胞 11. 米色细胞的发育（即 白色脂肪的“褐变”可在成年人中因长期寒冷暴露以及β3-肾上腺素能受体激动剂或PPARγ激动剂而被激活12-14米色/棕色样细胞可能是调控整体能量平衡的一个有前景的治疗靶点，并有望成为肥胖治疗的一部分；因此，深入了解环境信号调控米色细胞发育的精确分子机制和信号通路具有重要意义。
为了理解白色脂肪褐变的分子调控机制， 体外 实验最适合用于前脂肪细胞的分化研究，因为其分化过程异步进行，难以检测到细胞 原位 15尽管迄今为止关于脂肪细胞发育的研究主要使用3T3-L1、3T3-F442A或HIB1等细胞系进行，但这些细胞系似乎缺乏米色脂肪细胞的分子特征。相比之下，从皮下白色脂肪组织（WAT）中分离得到的原代脂肪细胞更有可能以细胞自主的方式重现白色脂肪褐变的过程。本文提供了一种从脂肪组织中有效分离基质血管组分（stromal-vascular fraction）并诱导白色脂肪在PPARγ激动剂作用下发生褐变的实验方案。已有研究表明，罗格列酮（Rosiglitazone）在这些细胞中是尤为有效的褐变诱导剂。如先前研究所提示 16该细胞系统可用于构建可靠的细胞体系，以研究米色/褐脂样细胞的发育。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>罗氏</td><td>11088874103</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>罗氏</td><td>04942078001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Fisher</td><td>10017-CV</td><td>含 2,5 g/l 葡萄糖 &amp;以及不含丙酮酸钠的L-谷氨酰胺 </td></tr><tr><td>胰岛素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T3（3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸） </td><td>Sigma</td><td>T-2877</td><td></td></tr><tr><td>吲哚美辛 </td><td>Sigma</td><td>I-7378</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松 </td><td>Sigma</td><td>D-1756</td><td></td></tr><tr><td>IBMX </td><td>Sigma</td><td>I-5879</td><td></td></tr><tr><td>罗格列酮 </td><td>Sigma</td><td>R-2408</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>胶原蛋白包被培养皿</td><td>BD</td><td>354450</td><td>10 cm 培养皿</td></tr><tr><td> 70 &amp;mu;m 滤膜 </td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td>细胞滤网，70 &amp;mu;m 尼龙 1/个</td></tr></tbody></table>

基质血管细胞的分离与向米色/褐色样细胞的分化

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

棕色脂肪细胞具有解偶联线粒体呼吸链并将化学能以热能形式耗散的能力。在白色脂肪组织中（即所谓的米色或褐脂样细胞）出现表达UCP1的棕色脂肪细胞，可由多种环境刺激强烈诱导，例如长期寒冷暴露或PPARγ激动剂处理，因此这类细胞在肥胖治疗方面具有潜在的治疗靶点价值。尽管大多数永生化的脂肪细胞系无法在体外培养中重现白色脂肪“褐变”的过程，但从皮下白色脂肪组织（WAT）的基质血管组分中分离得到的原代脂肪细胞则为研究米色/褐脂样细胞发育的分子调控机制提供了可靠的细胞系统。本文介绍了一种有效分离原代前体脂肪细胞并在体外诱导其分化为米色/褐脂样细胞的实验方案。可通过检测棕色脂肪特异性标志物（如UCP1）的表达水平来评估褐变效果。

通过qRT-PCR检测Ucp1及其他棕色脂肪特异性或选择性基因的mRNA表达水平，可评估原代脂肪细胞的米色化程度。图1展示了来自腹股沟白色脂肪组织（WAT）的原代脂肪细胞的基因表达数据。细胞在两种不同浓度的罗格列酮（分别为50 nM和500 nM）存在下被诱导分化。部分细胞在收获前用10 μM的佛司可林处理4小时。该处理可诱导细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平升高，进而激活包括Ucp1表达在内的产热基因程序。
如图所示 图1A，罗格列酮显著诱导 Ucp1 mRNA表达。Forskolin处理（cAMP）进一步增强了罗格列酮诱导的UCP1表达。另一种棕色脂肪选择性基因， Cidea 表达也以剂量依赖性方式被罗格列酮强烈诱导（图1B). Fabp4 是 PPAR 的直接靶点&gamma; 以及棕色脂肪和白色脂肪的脂肪生成标志物。如图所示 图1C, Fabp4...

从小鼠白色脂肪组织中分离得到的原代白色前脂肪细胞可分化为米色/褐色样细胞。本文介绍了一种可靠的细胞模型系统，用于研究白色脂肪“褐变”的分子调控机制。

棕色脂肪细胞具有解偶联线粒体呼吸链并将化学能以热能形式耗散的能力。UCP1阳性细胞的发育……

本实验的总体目标是分离原代脂肪细胞，并在体外培养中诱导其分化为米色或亮色脂肪细胞。第一步是从小鼠中解剖获取脂肪组织。接下来，使用胶原酶对组织进行消化。一旦分离出基质血管组分，便将细胞接种培养。最后一步是诱导这些细胞分化为米色或亮色脂肪细胞。最终通过分析方法检测褐色脂肪细胞特异性基因表达水平的升高。该方法有助于解答棕色脂肪组织中的关键问题，即何种分子机制调控了明细胞（be细胞）的发育。该技术的应用前景涉及肥胖症及其他生活方式相关疾病的治疗。由于对人体棕色脂肪组织进行调控可作为一种潜在的治疗干预手段，因此第一步是制备消化液。安乐死后，取出脂肪组织。首先，沿动物背部直至颈部进行切割，分离肩胛间棕色脂肪组织（bat）。在肩部之间的皮肤下方，可找到两叶棕色脂肪组织。接下来，小心去除覆盖在蝙蝠体表的白色脂肪薄层。分离后，将组织直接放入干净的 PBS 中。腹股沟白色脂肪组织（wat）位于两侧皮肤下方。延伸至大腿内侧并向下靠近睾丸。去除组织并置于干净的PBS中。以下步骤同时适用于蝙蝠样本和湿样本。迅速清除组织切片上的所有污染物，如毛发、骨骼肌和结缔组织。接着，用纸巾快速吸干组织以防止 PBS 稀释解剖液，并将其放置于干燥的培养皿上。加入消化液，并将组织剪切成小块。接下来，将组织转移至含有剩余消化液的50毫升离心管中。将离心管置于37摄氏度的培养箱中，在持续振荡条件下消化40至50分钟。每10到15分钟检查一次，以确保消化顺利进行，并防止过度消化。组织充分消化后，终止消化反应。加入5 mL完全培养基并充分混匀，细胞应几乎完全呈均一状态。接下来，将样品以700 × g离心10分钟。此时，基质血管组分应可见为管底的棕褐色沉淀物，吸去顶部的油性成熟脂肪细胞层及大部分液体层。接着，将沉淀物溶解于10毫升完全培养基中，并充分混匀。混匀后，在一个新的50毫升管上放置细胞筛网，过滤细胞悬液。将过滤后的细胞悬液转移至15毫升离心管中，在700 × g条件下离心10分钟。随后吸除上清液并重悬细胞沉淀。根据需要，用10毫升完全培养基通过移液器吹打混匀后接种细胞。通常情况下，五只小鼠可获得两块10厘米的腹股沟白色脂肪组织培养板和一块棕色脂肪组织培养板。接种后一至两小时，吸去培养基，用PBS洗涤两次，然后加入新鲜培养基。此步骤非常重要，因为它可以去除红细胞、免疫细胞及其他污染物。提前准备好维持培养基和诱导培养基。当原代脂肪细胞生长至95%到97%融合时，用诱导培养基替换常规完全培养基。48小时后，更换为含有0.5微摩尔RO格列酮的维持培养基。再经过额外48小时后，更换为新鲜的维持培养基，其中含1微摩尔RO格列酮，继续培养额外的两到三天。诱导后大约三到四天会出现液滴，如图所示为首次添加诱导培养基后六到七天的情况。细胞应完全分化为成熟的脂肪细胞，并充满脂滴。现在可收集细胞并用于进一步分析。可通过定量逆转录聚合酶链反应（Q-R-T-P-C-R）检测棕色脂肪特异性或选择性基因的mRNA来评估原代脂肪细胞的米色化，如此处所示。RO格列酮显著诱导了UCP1 mRNA的表达，FORSKOLIN处理（此处指定为环磷酸腺苷）进一步增强了RO格列酮诱导的UCP1表达。Cdia是另一种棕色脂肪特异性基因，也以剂量依赖的方式显著上调。RO格列酮处理还增加了FABP4以及棕色和白色脂肪共同的脂肪生成标志物的表达。这种褐变效应并不仅仅归因于脂肪生成本身得到增强。由于即使将 mRNA 水平标准化至 FABP4 后，UCP1 和 CD36 表达的诱导仍然显著，因此该蛋白印迹实验确认了 UCP1 蛋白水平的升高。观看本视频后，您应能很好地掌握如何分离前脂肪细胞，以及如何在体外培养中将这些细胞分化为米色或褐色脂肪细胞。

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科研

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Biology

生物学

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