测量离子转运的Na，K，H，K-ATP酶活性的爪蟾

该程序使用青蛙细胞作为体内表达系统。为了量化钾计数器转运 P 型 A、TP、ais 或其他微量元素膜转运蛋白的转运活性，首先在 zap lavis 中表达转运蛋白。然后，细胞通过在含有一定浓度的转运阳离子的通量溶液中孵育固定时间和温度来诱导阳离子摄取。

或者，使用双电极电压钳技术在膜电位控制下进行摄取实验。洗涤细胞后匀浆，单个卵母细胞在 1 毫升 Millipore 水中。接下来，在配备有横向加热石墨雾化炉的原子吸收分光光度计上测量样品。

最终通过原子吸收进行示踪剂通量分析。光谱法可用于确定转运或抑制剂动力学、转运和转运的电压依赖性、斯多葛几何，并最终可用于药理学筛选。这种技术的主要优点是它是使用放射性同位素进行的传统示踪剂通量实验的准确、廉价和安全的替代方案。

它还提供膜电位对转运蛋白功能影响的精确测量。虽然这种方法可以深入了解 P 型 A 型 TPA 的结构功能关系，但它也可以应用于对铜汇或其他微量元素具有特异性的其他膜转运蛋白。按照 Richards 和 Demsky 的描述准备眼细胞并进行 CRNA 注射，以提高细胞内钠浓度以进行钠钾的功能测量。

在 TPA。首先，将细胞转移到钠上样缓冲液中，并在冰上孵育 45 分钟。然后将要恢复的细胞置于上样后缓冲液中，在冰上放置至少 30 分钟。

现在，为了阻断 TPA 的内源性钠钾，将细胞在含有 100 微摩尔裂片的上样后缓冲液中孵育 15 分钟。在室温下，通过使用两步微量移液器拉拔器拉动 Bos 硅质毛细管来制备微电极。从背面用三摩尔氯化钾填充玻璃电极，并将其安装在设置的两个电极电压夹的微电极座的银、氯化银丝上。

接下来，将玻璃微电极和两个氯化钠琼脂桥插入预先填充有测量缓冲液的记录室中。将电压钳位放大器切换到关闭模式。分别检查每个玻璃电极的电阻。

此外，在相应的 TEVC 放大器显示屏上检查电压和电流电极的偏移电位。如果与零相差，则使用放大器的相应偏置稳压器调整偏置。现在将卵母细胞放在腔室的中间，用电流和电压电极轻轻穿透膜。

检查放大器的电位读数以了解电池的静息电位。使用 P clamp 软件将放大器切换到 VC 模式。将细胞夹在预定义的膜电位。

监测泄漏电流的幅度和稳定性，用含铷溶液灌注卵母细胞一段规定的时间。并使用 p clamp 软件记录泵电流。之后用不含铷的溶液灌注细胞 30 秒，确保完全停止铷的摄取。

现在停止双电极电压钳实验。从记录室中取出卵母细胞并继续洗涤。步骤 4.4 分析铷的吸收和原子吸收。

光谱法与数据。执行偏移电流减法，并使用 P clamp 封装的 clamp fit 程序计算泵电流的时间积分。为防止卵母细胞损伤，将 200 μL 移液器吸头切割并熔化至直径约 2 毫米。

然后，对于每个要测量的卵母细胞，准备一个装满 1 毫升 millipore 水的 1.5 毫升 einor管。用不含铷的洗涤缓冲液排列三个培养皿，用 millipore 水排列一个培养皿。现在将 5 个预孵育的细胞同时转移到一个 3.5 厘米的培养皿中，培养皿中装满了铷助焊剂缓冲液，并在温度控制下孵育。

接下来，在第一个培养皿中，用不含铷的洗涤缓冲液同时冲洗细胞。进行第二次和第三次洗涤，然后用 millipore 水轻轻冲洗。现在将每个卵母细胞单独转移到装有 1 毫升 Molpore 水的准备好的 eph 管中 使用 200 μL 移液器吸头对每个卵母细胞进行匀浆，直到溶液均匀浑浊。

打开阀门 Argonne gas supply。将合适的空心阴极灯插入任意插座位置，并平衡仪器 15 分钟。然后启动 wind lab 32 控制软件，并等待 15 分钟来平衡灯。

验证横向加热的石墨雾化器管是否完好。然后在风实验室 32 中选择 THGA 炉技术。制备校准样品，其中至少有 5 种铷锂浓度在 10 至 50 μg/L 之间，溶于毫孔水中，并且仅制备一个毫孔水空白探针。

现在选择合适的初始化文件，称为 method file。输入校准样品和空白探针的位置和浓度。选择适当的 autos 采样器。

测量校准探头。现在将每个卵母细胞匀浆转移到单独的 1.2 毫升聚丙烯样品杯中，然后将这些试管放入 autos 进样器托盘中。创建样本信息文件以识别 autos 采样器位置中的探针。

然后将样品量调整至 20 微升，并在运行完成后启动仪器。检查测得的铷含量超过校准曲线最大值的探针。适当稀释这些样品，并再次测量它们的电生钠钾。

A TPA 的铷通量可以在两个电极电压拍打实验中确定，该实验旨在研究净电荷传输和铷传输之间的相关性。在这里，电流信号的积分产生了 7， 840 nku 的总传输电荷。总电荷与铷通量之间的比率为 0.47，该值与钠钾 APA 的 3 钠对 2 钾传输化学计量一致。

这种 A a s 技术在单细胞实验中的可重复性通过重复实验的结果显示，该实验在总电荷和铷传输之间产生线性相关性，电中性作质子钾的斜率因子为 0.49。A TPAs：可以确定铷摄取的浓度依赖性及其对特异性抑制剂 S CH 2 8 0 8 0 的敏感性。不同批次卵母细胞的这些测量显示，未注射的卵母细胞的背景摄取量不到最大检测到的铷摄取量的 10%，这对添加 SCH 2 8 0 8 0 不敏感。

相比之下，表达质子钾 atpa 的细胞中的通量降低到背景水平。在添加 10 微摩尔 s CH 2 8 0 8 0 绘制比摄取值后，可以计算质子钾的表观亲和力，ATP 对铷、细胞外钠的周转转运导致对铷的表观亲和力降低，这与运输过程中面向细胞外的阳离子结合口袋的竞争一致。在双电极电压钳的膜电位控制下，铷吸收实验与 a s 测定的组合也可用于确定质子钾 APA 对铷传输的电压依赖性。

在不同的 pH 条件下，铷通量实验可用于研究质子钾 APAs 突变的功能影响。例如，对具有不同 C 末端缺失的质子钾 APAs 突变体的铷转运活性的分析表明，铷摄取活性随着缺失氨基酸的数量而逐渐降低。有趣的是，delta Y 构建体的 10 微摩尔 SC 2 8 0 8 0 对铷摄取的抑制程度显着降低，而 delta YY 和 delta Q-E-L-Y-Y 对所有 SDS 页面分析的 10 微摩尔 S CH 2 8 0 8 0 不再敏感，表明各种缺失构建体的膜级分中的蛋白质总量相似。

然而，质膜组分中蛋白质的相对量随着 C 末端缺失和药物抑制结果的出现而降低。这些数据对反应循环中间体的稳态分布有影响，如随文所述，铷通量也可用于测量活化能等热力学参数。质子钾 atpa 对铷的摄取 卵母细胞 在很大程度上取决于温度。

aous 图产生数据的良好线性相关性，导致活化能为每摩尔 96 千焦耳。锂摄取的初步结果表明，细胞中的非特异性锂摄取较低，而质子钾 atpa 的摄取以剂量依赖性方式增加，并且似乎对 SC 2 8 0 8 0 具有抗性。这些数据揭示了稳态质子锂循环过程中的酶状态。

在尝试此程序时，请务必记住选择大小均匀的细胞，并且目前要遵守每个通量实验的孵育时间和温度。遵循此 S 程序。可以进行其他方法，如药物筛选，以确定治疗人类疾病（如气体整骨疗法或高血压）的新型药物。