Name: 优化系统的脑灌注监测在中风模型大鼠的大脑中动脉闭塞腔内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学习优化的大鼠脑灌注监测系统，通过激光多普勒技术实现单点和多点脑血流动力学监测。该方法利用定制探头固定装置，在大脑中动脉闭塞模型中准确测量脑微血管灌注，为脑缺血研究提供可靠数据。

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感谢Caroline Robertson女士提供画外音，Elena Pirovano女士在视频制作过程中的协助。本研究由米兰比可卡大学“2011年校级基金”（Fondo di Ateneo 2011）资助。

1. 如何制作探针固定器（单点位或多位点）
<ol>
 <li>所需材料包括天然橡胶、小型塑料管和金属探针导引针。探针固定器可根据动物大小、激光多普勒探针的数量与尺寸以及需要监测的脑血管区域进行个性化定制。</li>
 <li>裁剪适当尺寸的天然橡胶（对于300 g大鼠，约为10 mm × 10 mm）。</li>
 <li>根据所需的立体定位坐标，在天然橡胶上标记探针和前囟的位置；对于大脑中动脉阻塞，缺血核心区的典型坐标通常位于前囟后1 mm、中线外侧5 mm处；对于外周缺血边缘带区域，预期坐标可位于前囟前2 mm、中线外侧2 mm处。</li>
 <li>用“X”清晰标记前囟位置，此标记将作为将探针固定器附着于颅骨时的定位参考点。</li>
 <li>将导引针插入小型塑料管中（塑料管尺寸需与探针匹配）。</li>
 <li>将带有塑料管的导引针插入天然橡胶中探针所需位置处，继续推进导引针，直至塑料管也完全插入橡胶中。</li>
 <li>抽出导引针。</li>
 <li>若需使用多个探针，则对其他探针位置重复步骤1.5–1.7。</li>
 <li>（可选，适用于多探针）用胶带缠绕塑料管，以增强探针的稳定性。</li>
 <li>（可选）对多个探针固定器进行化学灭菌，以备后续使用。</li>
</ol>
2. 术前准备
<ol>
 <li>大脑中动脉阻塞（MCAO）卒中模型通常作为存活手术进行。如本视频所示（术后存活时间为24小时），手术过程中外科医生需使用无菌技术，并采用已消毒的器械和材料。</li>
 <li>使用异氟烷麻醉大鼠（诱导阶段3%，维持阶段1.5%）。</li>
 <li>将大鼠俯卧位固定于手术台上。</li>
 <li>轻柔地剃除大鼠头部毛发。</li>
 <li>将消毒液涂抹于纱布垫上，对皮肤进行消毒。</li>
 <li>在颅部区域皮下注射2%利多卡因，剂量为5 mg/kg。</li>
</ol>
3. 探针在完整颅骨上的定位与固定
<ol>
 <li>进行右侧旁正中皮肤切口（用于右侧大脑中动脉阻塞模型），并分离皮下组织以暴露颅筋膜（galea aponeurotica）。</li>
 <li>在颅筋膜上做右侧旁正中切口，钝性分离至颅骨表面；准备足够大的颅骨区域以便安装探头支架。</li>
 <li>请注意：无需钻孔或磨薄颅骨。</li>
 <li>使用汞溴红溶液对颅骨表面进行消毒并使其干燥。</li>
 <li>使用吹风机（冷风档）加速颅骨表面干燥。</li>
 <li>此时，颅骨缝线和前囟点应清晰可见。</li>
 <li>使用无菌剪刀修剪探头支架边缘，以适配头型。</li>
 <li>在探头支架下方表面涂抹少量外科胶水（氰基丙烯酸酯，兽医批准使用），注意避免胶水进入塑料管的下端开口处（请注意：若胶水大量残留在探头光学面与颅骨之间，可能导致信号减弱，并在多次使用后损坏探头）。</li>
 <li>将探头支架置于颅骨表面，仔细对准前囟点与X标记线，并轻压固定探头支架。</li>
 <li>使用吹风机（冷风档）加速外科胶水干燥。</li>
 <li>用手术缝线围绕探头支架和动物头部进行结扎以固定支架；注意将缝线置于下颌骨区域，避开下颌下区和颈部。</li>
 <li>可选步骤：在探头支架的塑料管内填充光学凝胶（例如常用的超声波或心电图凝胶）；这将提高激光多普勒（LD）信号质量。</li>
 <li>将探头插入探头支架，并检查激光多普勒血流仪的实际读数；按照制造商说明操作激光多普勒血流仪。</li>
 <li>用手术缝线将探头围绕动物头部固定；注意将缝线置于下颌骨区域，避开下颌下区和颈部。</li>
</ol>
4. 大脑中动脉阻塞期间的脑灌注监测
<ol>
 <li>将大鼠置于仰卧位，注意避免对探头或探头支架施加牵拉力。</li>
 <li>开始在大脑中动脉闭塞（MCAO）期间进行脑灌注监测。</li>
</ol>
5. 移除探针及探针架
<ol>
 <li>剪断探针、探针固定装置及动物头部周围的缝合线。</li>
 <li>使用钝性解剖法轻轻分离探针固定装置天然橡胶基部周围的颅部软组织和皮肤。</li>
 <li>移除探针固定装置。</li>
 <li>在颅骨表面涂抹消毒液。</li>
 <li>缝合颅部皮肤。</li>
</ol>
6. 术后护理
<ol>
 <li>停止气体麻醉后，皮下注射 2.5 ml 生理盐水以防止脱水，并使用加热垫保持动物体温。</li>
 <li>对于存活手术：术前给予酮洛芬（Ketoprofen）4 mg/kg 皮下注射以进行预先镇痛，并在术后 12 小时重复相同剂量。</li>
 <li>在我们的实验条件下，术后 24 小时通过吸入 CO2 实施安乐死。</li>
</ol>

<ol><li>Sutherland, B. A., Papadakis, M., Chen, R. L., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+blood+flow+alteration+in+neuroprotection+following+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebral blood flow alteration in neuroprotection following cerebral ischemia.</a> J. Physiol. 589, 4105-4114 (2011).</li>
<li>Prinz, V., Endres, M. Chapter 3 Modeling focal cerebral ischemia in rodents: Introduction and overview. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPrinz%2C+V+%22Rodent+models+of+stroke%22">Rodent models of stroke</a>. Dirnagl, U. , Human Press. (2010).</li>
<li>Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+reevaluation+of+the+intraluminal+thread+model+of+focal+cerebral+ischemia%3A+evidence+of+inadvertent+premature+reperfusion+and+subarachnoid+hemorrhage+in+rats+by+laser-Doppler+flowmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry.</a> Stroke. 29, 2162-2170 (1998).</li>
<li>Riva, M., Pappadà, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+monitoring+of+intracranial+collateral+flow+predicts+tissue+and+functional+outcome+in+experimental+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic monitoring of intracranial collateral flow predicts tissue and functional outcome in experimental ischemic stroke.</a> Exp. Neurol. 233, 815-820 (2012).</li>
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<li>Bang, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+flow+predicts+response+to+endovascular+therapy+for+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Collateral flow predicts response to endovascular therapy for acute ischemic stroke.</a> Stroke. 42, 693-699 (2011).</li>
<li>Shuaib, A., Butcher, K., Mohammad, A. A., Saqqur, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+blood+vessels+in+acute+ischaemic+stroke%3A+a+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Collateral blood vessels in acute ischaemic stroke: a potential therapeutic target.</a> Lancet Neurol. 10, 909-921 (2011).</li>
<li>Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+Stroke+Model+Guidelines+for+preclinical+stroke+trials+%281st+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Stroke+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent Stroke Model Guidelines for preclinical stroke trials (1st edition).</a> J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).</li>
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<li>Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+Cerebral+Ischemia+Model+by+Endovascular+Suture+Occlusion+of+the+Middle+Cerebral+Artery+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat.</a> J. Vis. Exp. (48), e1978(2011).</li>
<li>Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+deficit+and+extent+of+neuronal+necrosis+attributable+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats.+Statistical+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation.</a> Stroke. 26, 627-634 (1995).</li>
</ol>

本视频文章的制作资金由英国德文郡艾克斯特市的 Moor Instruments Ltd 提供，该公司生产了本实验研究中展示的激光多普勒仪器。
本实验方案已获得米兰比可卡大学动物护理委员会批准，符合意大利关于实验动物使用的国家指南（D.L. 116/1992）以及欧盟动物实验指令（2010/63/EU），并依据意大利卫生部项目许可（编号：219/2011-B）进行。

我们自主研发了一种简单且低成本的系统，可在大鼠MCAO手术过程中将一个或多个双光纤（深部穿透）激光多普勒（LD）探头牢固地固定在完整的颅骨上。尽管这一问题看似微不足道，但在该实验条件下，探头与颅骨之间的可靠固定实际上是一个关键难题，因为这是实现平稳信号检测和成功监测脑部灌注的前提条件。
侵入性操作（如钻孔和骨螺钉固定）通常会延长手术时间，并引入更多与开颅相关的实验变量，这可能会使研究人员望而却步，从而避免使用激光多普勒（LD）监测。另一方面，单光纤（穿透深度低）探头虽然更细、相对更容易直接粘附于颅骨表面，但其信号质量较低，若不进行颅骨钻孔或减薄处理，则无法在成年大鼠中可靠地使用。
我们使用了简单且低成本的材料，例如天然橡胶、塑料管和金属穿刺针。定制的探针固定器可在几分钟内制作完成，并可根据实验条件进行调整。这些探针固定器可容纳一个或多个深部穿透式激光多普勒（LD）探针，用于对缺血核心区域进行传统的单点监测，或在同一半球或双侧半球的不同动脉供血区域进行多点监测。可批量制作多个探针固定器，经化学灭菌后储存，以备后续使用。根据所需颅骨坐标，使用兽医批准的外科胶水（氰基丙烯酸酯）并以冷空气加速固化，将探针固定器粘附于大鼠颅骨完整的表面。最后，通过常规缝合线进一步固定探针装置。
掌握该技术后，此LD探针设置的总时间约为10分钟。
如本视频所示，我们常规监测大脑中动脉主干区域（LD探头1：缺血核心区）和大脑中动脉远端区域（LD探头2：主要为半暗带区域）的脑灌注情况。在我们最近的研究中发现，LD探头2的血流变化变异性较高（与基线相比，平均为52% ± 16% SD），而LD探头1的变异性较低（与基线相比，平均为31% ± 6% SD），该差异可用于预测卒中预后4。
对于希望使用我们自主开发系统的科研人员，我们可提供一些故障排除建议。实验开始时，在将探头固定器粘附到颅骨表面之前，务必仔细彻底干燥颅骨表面（使用汞溴红和冷空气），以防止固定过早脱落。此外，务必仅将胶水涂抹在天然橡胶部分，避免接触塑料管的开口端以及激光多普勒（LD）探头的光学表面，以防信号质量下降或探头受损。在动物头部打结缝合线时需小心操作，避免阻塞气道（可通过将缝合线置于下颌骨上方来预防）。在放置并固定探头后，当将动物翻转至仰卧位进行颈部手术时，注意不要牵拉探头线缆；此步骤通常需要两人配合，一人固定动物，另一人手持探头线缆并轻柔地将其调整至合适位置。最后，若双光纤LD探头受到血液污染，可按照制造商提供的清洁说明轻松处理。
如本视频所示，我们优化的脑灌注监测系统可为目前商业公司在此领域销售的探头装置系统提供一种更简便、更快速且更可靠的替代方案。此外，我们认为其他研究人员使用该系统将有助于推动实验性卒中领域内脑血流动力学的研究，从而促进新一代脑侧支循环治疗药物的开发。

关于影响中风病理生理学和治疗的血流动力学因素的转化研究亟需开展，因为这一重要问题常常被基础研究意外地忽视1。
脑灌注监测是一种重要但尚未被充分使用的工具，可用于精确的缺血性卒中建模2。除了确认动脉血管闭塞并排除蛛网膜下腔出血3外，持续的脑灌注监测还可提供有关灌注缺损程度和稳定性的有用数据，颅内侧支血管的功能状态，以及新型治疗方法的血流动力学效应。
我们团队最近的一项研究表明，多部位血流动力学监测可用于评估颅内侧支循环，并能够预测梗死体积和功能缺损4。这些实验结果与临床研究一致，后者表明脑侧支循环的功能状态可预测缺血性卒中患者的临床预后5, 6。因此，脑侧支循环已被提倡作为缺血性卒中急性期潜在的治疗靶点7。
激光多普勒（LD）仪器是实验性缺血性卒中研究中测量脑灌注最常用的工具，近期相关指南也推荐使用该技术8。LD仪器可测量小范围皮层区域的微血管灌注，其信号记录深度取决于光纤间距的大小，其中双光纤LD探头相比单光纤探头可实现更深层的组织穿透9。血流值以任意灌注单位（P.U.）表示，反映的是相对脑血流量而非绝对值。P.U.的校准通常依据制造商说明，使用运动标准物质进行。LD血流测定技术可在同一实验过程中实现连续动态监测，并生成定量数据。
在目前限制激光多普勒（LD）应用的技术问题中，一个主要问题是难以将深部穿透的激光多普勒探头牢固且持久地固定在动物颅骨上。这对于长期监测至关重要，尤其是在我们实验室所采用的、针对不同脑动脉区域使用多个探头的情况下。 
特别是，如果使用颅骨钻孔或颅骨螺钉将探头固定在颅骨上，则需要较长的手术时间；而如果使用普通外科胶水将单光纤（低穿透性）激光多普勒探头简单地粘附在颅骨上，则会出现信号弱且固定不牢的问题。双光纤（高穿透性）激光多普勒探头可提供更高且更稳定的信号，但其体积大于单光纤探头，无法仅依靠外科胶水固定在颅骨上。
在本视频中，我们展示了在大鼠通过血管内细丝暂时性闭塞大脑中动脉期间，用于监测脑灌注的优化系统。我们介绍了一种简单的方法，用于制备高效、定制化、低成本的单个或多个双光纤（深部穿透）激光多普勒探头固定装置，可用于经完整颅骨进行长时间的脑灌注监测。
大鼠短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）的手术操作可参见Uluç及其同事的视频文章10，本视频中未予展示。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MoorVMS-LDF 2通道激光多普勒血流监测仪</td><td><a href="http://gb.moor.co.uk/product/moorvms-ldf-laser-doppler-monitor/1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Moor Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VP12探头</td><td><a href="http://gb.moor.co.uk/product/vp12-vp12/47" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Moor Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Doccol硅涂层4-0规格缝合丝线，带涂层直径0.39 mm</td><td>Doccol Corporation</td><td>403956PK10</td><td></td></tr><tr><td>天然橡胶，&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;新生儿常用安抚奶嘴</td><td></td><td></td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>金属导丝，&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;18号×90 mm脊髓穿刺针导丝</td><td></td><td></td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>塑料导管，&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;25号×20 mm静脉输液套件中的导管</td><td></td><td></td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>不可吸收缝线，带涂层，编织丝线</td><td></td><td></td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯外科粘合剂</td><td></td><td></td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>兽用异氟烷（100% v/v）</td><td></td><td></td><td>多个供应商</td></tr></tbody></table>

改良的大鼠大脑中动脉内栓塞卒中模型脑灌注监测系统

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

临床前卒中研究的转化潜力取决于实验建模的准确性。在急性缺血性卒中动物模型中进行脑灌注监测，可确认动脉阻塞是否成功，并排除蛛网膜下腔出血。脑灌注监测还可用于研究颅内侧支循环，后者正成为决定卒中预后的关键因素以及潜在的治疗靶点。尽管激光多普勒灌注监测已被公认为实验性脑缺血研究现行指南的重要组成部分，但仍存在若干技术难题，限制了其广泛应用。其中主要问题之一是如何将深部穿透型激光多普勒探头稳固且持久地固定在动物颅骨上。在本视频中，我们展示了在大鼠经腔线栓法实现短暂性大脑中动脉阻塞期间，用于脑灌注监测的优化系统。我们自行开发了一种简便的方法，可制备适用于双光纤（深部穿透型）激光多普勒探头的定制化固定装置，必要时可实现多部位监测。该方法可在完整的颅骨上实现连续且持久的脑灌注监测。

通过将硅胶包被的线栓插入颈外动脉诱导短暂性大脑中动脉阻塞（60 分钟）。在激光多普勒（LD）监测下，将线栓经颈内动脉末端推进至大脑中动脉（MCA）起始处。在手术插入线栓期间，颈总动脉和翼腭动脉被短暂阻断。手术操作的示意图见图 1A。
根据潜在的动脉供血区域，选择两个激光多普勒（LD）探头放置位置的颅骨坐标。明胶-墨水灌注的初步实验（图1B）显示，缺血核心区预期位于大脑中动脉（MCA）中央区域（前囟后1 mm，距中线5 mm；探头1），而侧支血流预期位于大脑中动脉与大脑前动脉皮层支之间的边缘带区域（前囟前2 mm，距中线2 mm；探头2）。
在整个手术过程中（即MCAO前、期间和之后）（图2），采用多部位激光多普勒探针研究脑血流动力学。在MCAO期间，探针2所显示的脑灌注缺损程度较小，且变异性更高，相较于探针1，提示在缺血条件下个体间颅内侧支循环功能表现存在差异。多部位激光多普勒监测还可用于研究近端颅外脑动脉（颈总动脉、颈内动脉、翼腭动脉）阻塞期间的脑血流动力学变化。
再灌注24小时后，通过计算经焦油紫染色的19个连续脑切片的梗死体积（图3）以及Garcia神经功能评分11来评估卒中结局。为获得神经元丢失（微管相关蛋白2，MAP2）和缺血半暗带（热休克蛋白70，Hsp70）在脑内分布的空间定位，开展了针对缺血性脑损伤相关特异性标志物的免疫组织化学染色，并结合颅内循环的多部位血流动力学监测进行分析（图4）。
<img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig1.jpg" alt="颈动脉与Doccol线栓示意图；以bregma为参考的小鼠脑部探针装置。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 大鼠经腔内大脑中动脉阻塞（MCAO）期间的脑灌注监测。A. 暂时性MCAO手术操作的示意图。将硅胶包被的线栓从颈外动脉插入，经颈内动脉推进，以阻塞大脑中动脉（MCA）起始部。手术过程中，近端颈部动脉或被结扎（颈外动脉），或被暂时性阻塞（翼腭动脉和颈总动脉）。B. 显示缺血60分钟后、未进行再灌注时，经明胶-墨汁灌注染色后的一个代表性脑组织图像。正常灌注的脑组织被明胶-墨汁染成灰色，血管呈黑色，而缺血（无灌注）区域未被染色，呈粉红色。图中显示了两个激光多普勒（LD）探头定位的颅骨坐标：探头1位于bregma后方1 mm、中线外侧5 mm处；探头2位于bregma前方2 mm、中线外侧2 mm处。
<img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig2.jpg" alt="血流分析图；使用探针检测脑动脉阻塞对血流的影响，时间 vs. P.U." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用多部位激光多普勒探针记录脑血流动力学。 图示一种典型的血流动力学模式，提示在缺血条件下存在功能活跃的颅内侧支循环。在此动物模型中，无论是颈总动脉阻塞还是大脑中动脉阻塞期间，探针 2 通道的激光多普勒（LD）记录显示其灌注缺损均小于探针 1 通道。MCA-O=大脑中动脉阻塞。CCA-O=颈总动脉阻塞。P.U.=灌注单位。
<img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig3.jpg" alt="组织学脑切片对比，显微镜图像系列显示用于分析的分割区域。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 用于计算梗死体积的代表性脑切片。 组织学冠状切片（50 μm；n = 19，间隔250 μm；前囟+2.5 mm至−3.0 mm）经4%多聚甲醛固定，并用0.1%焦油紫染色。使用ImageJ图像处理软件计算梗死体积，校正因脑水肿引起的半球间不对称性，并以mm3表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50214/50214fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>
<img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig4.jpg" alt="脑组织染色结果：焦油紫、MAP-2、HSP-70；组织学比较，显微镜观察。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 神经元丢失及缺血半暗带分子标志物的免疫染色。 展示了代表性连续脑切片，分别使用0.1%焦油紫染色（A），或使用神经元丢失标志物（微管相关蛋白2，MAP2；B）和缺血半暗带标志物（热休克蛋白70，Hsp70；C）进行免疫染色。

脑灌注监测已被证明可提高缺血性卒中模型的准确性。技术难题常常限制了这一脑血管研究重要工具的应用。本视频展示了一种优化的系统，可在大鼠大脑中动脉内栓塞过程中实现单部位或多部位的血流动力学监测。

临床前卒中研究的转化潜力取决于实验建模的准确性。动物模型中的脑灌注监测……

脑灌注监测对于提高实验性脑卒中模型的准确性和降低变异性具有重要意义。激光多普勒技术能够通过小鼠和大鼠完整的颅骨轻松检测脑微血管灌注情况，特别是使用深部穿透探头时。此处的关键问题在于，如何在手术过程中找到一种可靠的系统，将激光多普勒探头固定在颅骨的特定坐标位置。在本视频中，我们将向您展示我们自主研发的系统，该系统可用于单部位和多部位脑血流动力学监测。本视频所示的脑卒中模型是通过将一根血管内尼龙线插入颈外动脉而建立的。随后将丝线经颈内动脉推进，以阻塞大脑中动脉的起始部，从而造成短暂性局灶性脑缺血。有关该操作的更多细节，请访问下方链接。单点及多点监测的颅内坐标系是基于明胶墨水灌注的预实验结果确定的，该预实验清晰地描绘了大脑中动脉阻塞期间单点监测时的高灌注区域。将激光多普勒探头一放置于大脑中动脉供血的中央区域，用于多点监测。将激光多普勒探头二放置于大脑中动脉与大脑前动脉供血区域交界的周边部位。为研究颅内侧支血流，激光多普勒探头的放置位置可根据每位研究人员的具体实验需求进行调整。所需的材料包括天然橡胶、小型塑料管和金属探针。可根据动物的大小、激光多普勒探头的数量与尺寸，以及需要监测的稳定血管区域，对探针固定装置进行定制。标记探头和制动隆起的位置。根据大脑中动脉阻塞所需的立体定位坐标，缺血核心的典型坐标位于Bregma后1毫米、中线外侧5毫米处。对于外周缺血边缘带区域，预期坐标可设定在Bregma前2毫米、中线外侧2毫米处。用“X”清晰标记Bregma的位置，此标记将作为将固定架安装至颅骨的定位标志。将导丝插入一个小的塑料管中。塑料管的尺寸需与探针的尺寸相匹配。在探针需要定位的位置处，将导丝插入天然橡胶中。将探针推入橡胶塞，直至塑料管也完全插入橡胶塞内。若需插入多个探针，则取出内芯。对其他探针位置重复相同步骤，以确保探针保持稳定。将胶带快速缠绕在塑料管上，仅使用一根管子即可按照相同步骤制备单个探针固定器。多个探针固定器可进行化学灭菌，以备后续使用。轻轻剃除大鼠头部的毛发，将碘伏涂抹于纱布垫上，并对皮肤进行消毒。应在 ISO 氯胺酮麻醉下将大鼠置于手术台上的仰卧位，在颅部区域皮下注射 2% 利多卡因，剂量为 5 毫克/千克。在右侧做旁正中皮肤切口以闭塞右颈动脉，解剖皮下组织以暴露颅筋膜。在颅筋膜上做右侧旁正中切口，并进行钝性分离。为了到达颅骨技能区，需准备一个足够大的颅骨区域，以便安装探针固定装置。请注意，无需进行钻孔或磨薄颅骨，使用碘伏消毒并干燥颅骨表面。可使用设置为冷风的吹风机加速颅骨表面干燥。此时，颅缝和脑背侧中线区（bgma）清晰可见。使用无菌剪刀修剪探针固定器的边缘以进行定制。将少量经兽医批准的外科用氰基丙烯酸酯胶水小心地涂抹在探针固定器下方的表面，注意避免胶水进入塑料管的下端开口。请注意，如果探头光学表面与颅骨之间残留大量胶水，可能会导致信号减弱，并可能损坏探头。多次使用时，应小心地将探头支架贴合到颅骨表面，确保BMA与S地雷精确对齐。在假肢固定器上施加轻柔压力。使用冷风模式的吹风机加速手术胶水的干燥。用手术缝线将假肢固定器与动物头部绑扎固定。小心将手术线置于下颌骨上方，避免接触下颌下区和颈部。用光学凝胶填充探头架的塑料管，例如常用的超声耦合凝胶。这将提高激光多普勒信号的质量。将探头放入探头架中，并确认激光多普勒血流仪的实际读数。将探头固定在动物头部周围。注意将手术缝线置于下颌骨上方，避免接触下颌下区域，多部位CBR灌注监测系统现已安装完毕。将大鼠小心放置于供体位置，避免对探头或探头支架施加牵拉力。在进行大脑中动脉阻塞手术时，当血管内缝合丝到达大脑中动脉起始处，开始灌注监测。在激光多普勒监测过程中可观察到脑部灌注的下降。若使用多个脑部探针，根据其动脉供血区域的不同，可能会观察到脑血流灌注的差异。这些具有代表性的灌注图显示了如何利用多部位激光多普勒探针研究脑血流动力学。在颈总动脉闭塞和大脑中动脉闭塞期间，探针二通道相较于探针一通道均出现轻度的灌注不足。这种血流动力学模式提示在缺血条件下存在功能上活跃的颅内侧支循环。梗死体积通过19个连续的冠状切面进行计算，组织经4%多聚甲醛固定，MAGA染色，并用0.1%的氯化紫进行改良染色，校正因脑水肿引起的半球间不对称性，结果以立方毫米表示。可通过免疫组织化学染色研究神经元丢失和缺血半暗带的分子标志物，如微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2）和热休克蛋白70（heat shock protein 70），并将其与颅内循环的多部位血流动力学监测结果进行关联分析。本视频展示的用于可销售灌注监测的优化系统，可为研究实验性卒中领域的可销售血流动力学变化提供一种简便而有效的方法，从而推动新一代脑侧支循环治疗药物的开发。感谢您的关注，祝您的实验顺利成功。

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来源：Larpthaveesarp, A.，等．P10大鼠新生期卒中短暂性大脑中动脉闭塞模型．J. Vis. Exp.

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一种改良的中动脉闭塞再灌注模型制备方法

学习优化的大鼠脑灌注监测系统，通过激光多普勒技术实现单点和多点脑血流动力学监测。该方法利用定制探头固定装置，在大脑中动脉闭塞模型中准确测量脑微血管灌注，为脑缺血研究提供可靠数据。

改良的大鼠大脑中动脉内栓塞卒中模型脑灌注监测系统

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