Name: 在缺血大鼠肺的血管生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学习在大鼠肺缺血模型中诱导支气管血管新生的手术方法。通过荧光测量和组织学分析评估左肺血管生成，为研究肺部血管病理机制提供可靠的实验技术。

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我们感谢 Adlah Sukkar 博士（医学博士）在肺部灌注模型制备过程中提供的帮助。本研究由美国国家心肺血液研究所（NHLBI）资助，项目编号 HL088005。

所有在大鼠上进行的实验方案均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则。在条件允许的情况下，应于手术区域以外的独立区域对动物进行外科术前准备，以尽量减少手术部位的污染。
1. 麻醉/镇痛
<ol>
	<li>将大鼠（Sprague Dawley 雄性大鼠，125–150 g；Harlan，Indianapolis，IN）放入充满 3% 异氟烷的诱导室中。</li>
	<li>将麻醉后的大鼠置于手术板上，连接鼻罩和呼吸机，持续给予 3% 异氟烷麻醉。所有操作均采用无菌技术。用无菌布单覆盖大鼠，确保形成无菌手术区域。</li>
</ol>
2. 插管
<ol>
	<li>使用手术胶带将四肢固定于仰卧位。</li>
	<li>将大鼠从鼻罩中取出，用带垫镊子拉出舌头。</li>
	<li>使用14号套管针（内含钝化金属导丝）作为引导，从舌后方滑入气管。</li>
	<li>取出金属导丝，保留白色塑料套管在气管内。确保大鼠正常呼吸且气体可通过导管。</li>
	<li>将鼻罩更换为与导管直接连接的适配器，将大鼠连接至呼吸机（呼吸频率90次/分钟，潮气量8 ml/kg；Rodent Ventilator Model 683，Harvard Apparatus，Holliston，Massachusetts）。</li>
	<li>在眼睛上涂抹Puralube（Butler Schein，Dublin，OH）兽用眼膏。</li>
</ol>
3. 开胸术
<ol>
	<li>将大鼠右侧卧位放置，使用手术胶带固定四肢。</li>
	<li>剃除左侧肋骨区域的毛发</li>
	<li>使用小型真空吸尘器去除多余毛发。</li>
	<li>用酒精擦拭以建立无菌区域，随后使用聚维酮碘棉签（Dynarex Corporation, Orangebur, NY）。重复此过程两次，共进行三次消毒。</li>
	<li>在手术区域中央使用无菌解剖剪或无菌手术刀做横向切口。</li>
	<li>钝性分离各层组织和脂肪，直至肋骨（最深层为覆盖肋骨的薄层膜状结构）。</li>
	<li>数肋骨以确定第3肋rd 肋间隙</li>
	<li>使用无菌45° Graefe镊子，在3之间进行钝性切开rd 和 4th 肋</li>
	<li>插入肋骨撑开器，轻柔牵拉，充分暴露胸腔并清晰显示肺组织，用胶带固定缝线以保持切口开放。</li>
</ol>
4. 左肺动脉结扎
<ol>
	<li>用90° Graefe镊子，右手将左肺向后移动。</li>
	<li>使用Dumont #5直镊，左手夹住左肺动脉和气道。左肺动脉位于气道上方。确保镊子与操作台面完全垂直。此外，最有效的操作是在最远端位置（最靠近肺实质处）夹起左肺动脉/左主支气管。通过左手操作将正在通气的左肺推开。</li>
	<li>使用Dumont #5 45°弯镊，在左肺动脉与左主支气管的自然分界处将其分离。此分界线在两者之间呈现为一条细而白色的线。</li>
	<li>直接在血管下方进行分离，不要穿透血管；将合拢的镊尖沿分离线平稳滑动。</li>
	<li>持续操作，直至镊尖明显将左肺动脉与左主支气管分开。仅需镊尖一小部分完全穿过即可。若在镊尖上可见血液，则表示尚未完全穿过，不应进行结扎。一旦穿过间隙，左肺动脉将位于镊子的弯曲部上。保持此位置不动。</li>
	<li>轻轻松开左手的直钝镊夹持力，用左手夹取一段预先剪好的缝线（约2-3英寸；6-0规格聚丙烯缝线；Myco Medical, Cary, NC）。</li>
	<li>打开夹持左肺动脉的弯镊，夹住缝线，沿弯镊弧度方向，轻柔地将缝线向上拉过左肺动脉与左主支气管之间的间隙。</li>
	<li>以方结结扎，阻断左肺血流，仔细剪除多余缝线。</li>
	<li>使用钝镊夹住肋骨，用带19 mm、3/8圆弧反向切割针（Myco Medical, Cary, NC）的4-0聚丙烯缝线（蓝色单丝）在止血钳中对肋骨缝合两针，注意避免缝合皮肤（仅缝肋骨）。</li>
	<li>先打一个松散的方结，充气使肺膨胀，施加呼气末正压（PEEP；2-5 cmH2O），再次扩张肺后收紧结，并再打一个完整结，然后剪除多余缝线。撤除PEEP，观察30秒，确保肺不塌陷。局部滴加5滴布比卡因（APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL）。</li>
	<li>在切口处涂抹组织胶水，用棉签棒的尾端将皮肤对合压紧以闭合皮肤。在切口部位皮下注射布比卡因（2.0 mg/kg），术后每8小时一次，持续24小时，或直至动物恢复正常活动。由于该区域皮下组织极薄，单独缝合较为困难。当使用组织胶并压合皮肤时，皮下层也随之闭合。</li>
	<li>关闭异氟烷气体，但继续用空气对大鼠通气1-2分钟，直至出现自主运动。将气管插管从呼吸机上断开，并确认大鼠能够自主呼吸后再将其移除。</li>
	<li>用棉签擦拭眼睛上的Puralube，监测动物活动及恢复情况。腹腔注射盐酸丁丙诺啡（0.05 mg/kg，Butler Schein, Dublin OH）。术后每12小时给予镇痛药一次，持续48小时。</li>
</ol>
5. 左颈总动脉插管
为了在左肺动脉结扎后于预定时间点评估缺血左肺支气管灌注的程度，通过左颈总动脉向主动脉弓内注射标记的微球。大鼠的准备步骤同上1-2。
<ol>
	<li>沿颈部正中线剪开，钝性分离以暴露气管和左侧颈总动脉（微球注射部位）。</li>
	<li>插入充满肝素化生理盐水的导管，将PE20导管（Becton Dickinson，Sparks MD）的钝端插入血管，并连接至25 g针头、四通阀和1 ml注射器。</li>
	<li>将微球试剂瓶（15 μm 红色荧光聚苯乙烯微球，1 × 106 个微球/ml；Invitrogen，Eugene, OR）放入水浴超声仪中处理30秒。</li>
	<li>取出试剂瓶，涡旋混匀后通过20 g针头将0.5 ml（500,000个微球）吸入1 ml Hamilton玻璃注射器（Hamilton Company，Reno, NV）中。</li>
	<li>将Hamilton注射器连接至四通阀，并使用注射泵（流速：500 μl/min；Genie Plus，Kent Scientific，Torrington, CT）注入微球。</li>
	<li>取下Hamilton注射器，以500 μl/min流速用1 ml肝素化生理盐水冲洗装置。</li>
	<li>行全胸廓切开术，通过切断下腔静脉放血处死大鼠。</li>
	<li>取出左侧肺脏及其他目标组织。</li>
	<li>为从组织中提取微球，在放血后取完整的大鼠左侧肺组织，置于2M KOH溶液（4–6 ml）中。放入55 °C水浴中过夜以消化组织。加入Tween 80（0.25%）洗涤微球，涡旋振荡（10秒）后离心（2,000 rpm；20 °C，10分钟）。弃去上清液，加入2-乙氧基乙酸乙酯（1 ml），涡旋混匀后静置1小时。再次涡旋悬浮液并离心（2,000 rpm；20 °C，10分钟）。收集含有荧光物质的2-乙氧基乙酸乙酯水相，转移至比色皿中，使用Hitachi F-2500荧光分光光度计（激发波长612/发射波长618；Digilab，Holliston, MA）进行测定。</li>
</ol>

<ol><li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+in+the+development+of+collateral+circulation+to+the+lung+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Early stages in the development of collateral circulation to the lung in the rat.</a> Circulation Research. 8, 353-376 (1960).</li>
<li>Li, X., Wilson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vascularity+of+the+bronchial+mucosa+in+mild+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Increased vascularity of the bronchial mucosa in mild asthma.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 229-233 (1997).</li>
<li>Turner-Warwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precapillary+systemic-pulmonary+anastomoses%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Precapillary systemic-pulmonary anastomoses.</a> Thorax. 18, 225-237 (1963).</li>
<li>Muller, K. M., Meyer-Schwickerath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+arteries+in+various+stages+of+bronchogenic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Bronchial arteries in various stages of bronchogenic carcinoma.</a> Pathol. Res. Pract. 163, 34-46 (1978).</li>
<li>Remy-Jardin, M., Duhamel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Collateral+Supply+in+Patients+with+Chronic+Thromboembolic+and+Primary+Pulmonary+Hypertension%3A+Assessment+with+Multi-Detector+Row+Helical+CT+Angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Systemic Collateral Supply in Patients with Chronic Thromboembolic and Primary Pulmonary Hypertension: Assessment with Multi-Detector Row Helical CT Angiography.</a> Radiology. , 274-281 (2005).</li>
<li>Karsner, H., Ghoreyeb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+in+infarction%3A+The+circulation+in+experimental+pulmonary+embolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Studies in infarction: The circulation in experimental pulmonary embolism.</a> J. Exp. Med. 18, 507-522 (1913).</li>
<li>Endrys, J., Hayat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+bronchopulmonary+collaterals+and+collateral+blood+flow+in+patients+with+chronic+thromboembolic+and+primary+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">Comparison of bronchopulmonary collaterals and collateral blood flow in patients with chronic thromboembolic and primary pulmonary hypertension.</a> Heart. 78, 171-176 (1997).</li>
<li>Virchow, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uber+die+Standpunkte+in+den+Wissenschaftlichen+Medizin%5BTitle%5D)+AND+%22Virchow+Archiv%22%5BJournal%5D)">Uber die Standpunkte in den Wissenschaftlichen Medizin.</a> Virchow Archiv. 1, 1-19 Forthcoming.</li>
<li>Fadel, E., Mazmanian, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+reperfusion+injury+after+chronic+or+acute+unilateral+pulmonary+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung reperfusion injury after chronic or acute unilateral pulmonary artery occlusion.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157, 1294-1230 (1998).</li>
<li>Charan, N. B., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+bronchial+circulatory+system+after+unilateral+pulmonary+artery+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in bronchial circulatory system after unilateral pulmonary artery obstruction.</a> J. Appl. Physiol. 82, 284-291 (1997).</li>
<li>Shi, W., Hu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+reactivity+of+pulmonary+vessels+in+postobstructive+pulmonary+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered reactivity of pulmonary vessels in postobstructive pulmonary vasculopathy.</a> J. Appl. Physiol. 88, 17-25 (2000).</li>
<li>Shi, W., Giaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+reactivity+to+endothelin+of+pulmonary+arteries+in+long-term+post-obstructive+pulmonary+vasculopathy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased reactivity to endothelin of pulmonary arteries in long-term post-obstructive pulmonary vasculopathy in rats.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 11, 189-196 (1998).</li>
<li>Sukkar, A., Jenkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CXCR2+Attenuates+Bronchial+Angiogenesis+in+the+Ischemic+Rat+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CXCR2 Attenuates Bronchial Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung.</a> J. Appl. Physiol. 104, 1470-1475 (2008).</li>
<li>Mitzner, W., Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse lung.</a> Am. J. Pathol. 157, 93-101 (2000).</li>
<li>Wagner, E. M., Jenkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+and+vascular+function+during+chronic+severe+pulmonary+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lung and vascular function during chronic severe pulmonary ischemia.</a> J. Appl. Physiol. 110, 538-544 (2011).</li>
<li>Remy-Jardin, M., Bouaziz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+and+nonbronchial+systemic+arteries+at+multi-detector+row+CT+angiography%3A+comparison+with+conventional+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Bronchial and nonbronchial systemic arteries at multi-detector row CT angiography: comparison with conventional angiography.</a> Radiology. 233, 741-749 (2004).</li>
<li>Baluk, P., Tammela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+persistent+lymphatic+vessel+hyperplasia+in+chronic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of persistent lymphatic vessel hyperplasia in chronic airway inflammation.</a> J. Clin. Invest. 115, 247-257 (2005).</li>
<li>Bailey, S. R., Boustany, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+vascular+reactivity+and+vascularisation+in+human+chronic+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Airway vascular reactivity and vascularisation in human chronic airway disease.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 22, 417-425 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在所有测试物种中，左肺动脉结扎可导致缺血肺组织发生显著的系统性新生血管化。我们介绍了在大鼠模型中实施该手术的详细操作步骤。通过血管铸型、组织病理学及 体内 标记结果显示支气管动脉增生并灌注肺实质。因此，可在与人类慢性肺血栓栓塞症相似的动物模型中研究支气管血管生成的机制。此外，这一具有临床相关性的小型动物模型为研究新生血管形成与功能提供了机会，而此类研究在人体实验中难以实施。
所列出的手术操作步骤已提供充分的细节，具备外科手术经验的动物技术人员应能迅速掌握这些技术。尽管我们的观察主要基于Sprague Dawley雄性大鼠（75-100 g），其他品系同样适用于此类研究。我们尚未系统评估支气管血管生成程度的年龄依赖性。本文还提供了左颈动脉插管操作的详细说明。我们采用将荧光微球逆行注入左颈动脉的方法，微球进入主动脉混合后最终滞留在左肺，以此作为缺血肺组织体循环灌注的标记，从而反映功能性血管生成情况。我们承认，该测量结果可能因注射期间心输出量的变化而存在变异性。然而，在测量前后持续监测大鼠的全身血压，结果表明其心血管状态并未发生改变。此外，图3</str...

肺部的体循环血管生成现象已被广泛认知。在哮喘2、间质性肺纤维化3、癌症4以及慢性肺血栓栓塞5等疾病状态下，肺内及周围组织的体循环血管增生并侵入肺实质。然而，用于研究体循环而非肺循环特异性激活的动物模型却十分有限。在成年哺乳动物肺部，最可重复的体循环新生血管模型之一是诱导慢性肺动脉缺血后所引发的反应。在人类5–7、犬8、猪9、绵羊10、豚鼠11、大鼠1, 12, 13和小鼠14中，左肺动脉阻塞后的反应表现为支气管动脉及肋间动脉的迅速增殖。肺缺血后体循环血管新生的机制在很大程度上仍不清楚，且尚未得到广泛研究。Weibel 的组织学研究1已对大鼠左肺动脉阻塞后支气管血管生成的时间进程进行了详细描述。在此大鼠模型基础上，本实验室进一步聚焦于该过程中关键的生长因子以及新生血管对肺部生理功能的影响。研究结果表明，缺血早期CXC趋化因子CINC-3表达升高，而使用针对CINC-3受体CXCR2的中和抗体处理大鼠，可减轻血管生成13。肺缺血发生14天后新形成的支气管血管表现出异常，其蛋白质通透性显著增加15。左肺功能亦不正常，表现为弥散能力下降和肺容积减小15。尽管新生血管可能在慢性肺缺血期间有助于维持肺组织存活，但其结构与功能并不正常，可能对肺功能的持续下降产生促进作用。
该模型最引人关注的方面之一可能与其增殖性血管的空间分布有关。尽管由于缺血导致肺实质内释放生长因子，新生血管却起源于相对较粗大的上游支气管动脉。正常的支气管动脉起源于主动脉的一个细小分支，并在隆突处侵入气道树。因此，生长因子诱导动脉生成初始阶段的具体机制尚不明确。我们认为，大鼠的血管解剖结构与人类相似，为研究肺缺血期间体循环血管生成的机制提供了独特的机会。尽管在人类中左肺动脉完全阻塞较为罕见，但无论肺动脉阻塞的部位和大小如何，患者均会出现类似的支气管血管增多现象16。因此，本文详细描述了在大鼠中结扎左肺动脉的手术方法，并提供了一种量化血管生成程度的方法。

<table><tbody><tr><td>盐酸丁丙诺啡，Puralube</td><td>Butler Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>布比卡因</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘消毒棒</td><td>Dynarex Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 规格聚丙烯缝合线，3/8 圆弧反向切割针</td><td>Myco Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE20 导管</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 &amp;mu;m 深红色聚苯乙烯荧光微球</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Hamilton 玻璃注射器</td><td>Hamilton Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genie Plus 注射泵</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物呼吸机 Model 683</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 1. &lt;/strong&gt; 特定试剂与仪器列表。</td></tr></tbody></table>

缺血大鼠肺组织中的血管生成

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

成年肺脏由体循环的支气管动脉以及经肺动脉流经的全部静脉血共同灌注。在大多数肺部病理状态下，通常是较小的体循环血管系统对增强肺灌注的需求作出反应，并表现出显著的新生血管形成。由肺动脉阻塞引起的肺血管缺血，已被证实可在人类及多种动物模型中迅速诱导体循环动脉的血管生成。尽管Weibel1已对大鼠支气管动脉增殖的时间过程进行了详细的组织学描述，但介导这种新血管有序生长的机制尚不明确。本文提供了在大鼠中诱导左侧肺动脉缺血以导致支气管新生血管形成的具体手术操作细节。由于肺内存在两套血管床，对血管生成程度的定量分析带来了额外挑战。本文还提供了基于标记微球注射来评估功能性血管生成的方法。

血管铸型：大鼠左肺动脉缺血效应的结果如图1所示。图中显示的是支气管血管系统以及在左肺动脉结扎（LPAL）后28天左气道树广泛的血管网络的甲基丙烯酸甲酯铸型。为制备该铸型，通过降主动脉逆行灌注甲基丙烯酸甲酯混合物（红色），同时插管气管并灌注白色硅基材料。该血管铸型清晰地展示了肺内支气管血管新生的现象。尤为显著的是左肺大而扭曲的上游支气管血管。尽管本图未显示，右支气管基本无 крупных血管，仅存正常单一的右支气管动脉。
组织学：左肺组织切片中显示的气道血管化变化如图2所示。图中展示了LPAL术后3天和14天观察到的支气管血管。图2A为LPAL术后3天左肺的气道切片，可见位于气道壁内的显著支气管血管。插图为2A的连续切片，经PCNA（增殖细胞核抗原）染色，可见支气管血管内衬的PCNA阳性内皮细胞。图2B显示LPAL术后14天大鼠左肺切片，可见此时支气管血管体积增大，同时肺动脉萎缩。
功能性血管生...

肺部由体循环的支气管动脉和肺动脉共同供血。在大多数肺部病理情况下，是较小的体循环血管表现出显著的新生血管形成。肺血流的中断会促进支气管的快速血管生成。我们提供了诱导左肺动脉缺血以促进支气管新生血管形成的手术细节。

成人肺部由体循环的支气管动脉以及经肺动脉流过的全部静脉回流共同灌注。在大多数肺……

本实验的总体目标是结扎左侧肺动脉。首先对麻醉大鼠进行气管插管并实施机械通气，随后进行开胸手术，进而结扎左侧肺动脉。连接后，关闭胸腔并让大鼠恢复。最终，可通过测量组织中的荧光水平或其他组织学方法来评估左肺的新生血管形成程度。该技术的主要优势在于，它提供了研究肺内支气管循环在体发育及新生血管形成的机会。这为研究通气肺中这种新生血管系统的复杂三维结构提供了机会。目前大多数研究者通常进行体外实验，研究内皮细胞增殖、趋化性或管腔形成，而本方法与此有显著不同。通常，初次操作该实验步骤的研究者在分离左肺动脉与左支气管之间的组织时会遇到困难。我唯一能提供的建议是多加练习、保持耐心，并经常观看本视频，以观察手术方法是否存在细微的调整。本实验操作由来自我实验室的技术员 John Jenkins 示范。首先，将麻醉后的大鼠置于手术板上，连接鼻罩以持续给予麻醉气体，用塑料导管对动物进行气管插管，并将大鼠连接至呼吸机。在眼部涂抹药膏后，将大鼠置于其右侧，并用胶带固定四肢。去除手术区域的毛发，并用碘伏和酒精反复擦拭消毒皮肤。准备就绪后，横向切开皮肤。接着钝性分离，切开脂肪和组织各层，暴露肋骨。暴露后，确定第三肋间间隙，用镊子在第三和第四肋骨之间进行钝性切开。将肋骨撑开器插入切口，轻柔地撑开肋骨，直至可见肺组织。固定切口。首先，用右手将左肺复位。然后用直血管钳，用左手夹住左肺动脉和气道。左肺动脉应位于气道上方，且镊子应与台面垂直。对齐后，应正确使用刻纹镊子在左主支气管与肺动脉的自然边界处将其分开。此分界线在两个独立结构之间呈现为一条细而发白的线。注意不要穿透血管。将镊子的尖端沿着分离面滑动。以这种方式继续操作，直到左肺动脉位于镊子的弯曲处。 用左手轻轻松开直血管钳，并取一段预先剪好的缝线。打开弯血管钳，轻托动脉，使其足以夹住缝线。沿弯钳的弧度方向，轻柔地向上拉动缝线穿过组织。穿过之后，收紧缝线以阻断左肺动脉，并用镊子夹住缝线，剪去剩余部分。缝合肋骨，注意不要松散地缝合皮肤。打一个方结以闭合肋骨。通过短暂阻塞呼吸机的呼气管路使肺过度膨胀，然后拉紧缝线。在剪断线头前再打一个完整的结以固定缝线。移除末梢呼气压，观察30秒以确保肺部不发生塌陷。最后，滴加五滴布比卡因，用组织胶水关闭皮肤。关闭异氟烷气体，但继续用空气为大鼠通气一到两分钟，直至自主呼吸恢复至稳定状态。随后，将气管插管与呼吸机断开，并确保大鼠能够自主呼吸后再将其移除。在接下来的24小时内定期给予局部镇痛药。最后，擦去眼部的药膏，并在预定时间内监测动物直至其恢复。缺血后，可注射标记的微球。为评估支气管灌注程度，使用小容量输注泵以恒定速率将标记微球注入左侧颈总动脉。将导管连接至一个钝头25号针头和一个四通旋塞阀。开始时，请遵循之前演示的手术准备工作。准备就绪后，沿颈部正中线进行钝性切口。解剖组织以暴露气管和左侧颈动脉。在颈动脉下方穿过两根

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

在缺血大鼠肺的血管生成

从一只经历大脑中动脉闭塞的大鼠开始，该手术通过暂时阻断脑组织的血液供应来实现。这会诱发缺血性中风，导致脑组织损伤。接下来，清除阻塞以恢复血流。选择表现出神经功能缺损的大鼠，以确保研究的相关性。然后，向实验组给予测试药物，同时向对照组注射生理盐水。重复给药和生理盐水给药。该试验药物可促进血管生成，从而形成新的血管。这可以增强受损脑组织的血液供应，并减轻中风的影响。接下来，麻醉大鼠并使用加热毯维持其体温。几天后，对两组进行 MRI 扫描。在 MRI...

评估试验药物在缺血性脑卒中大鼠模型中的血管生成作用

啮齿类动物的视网膜长期以来被视为观察大脑的一个易于接近的窗口。在本技术论文中，我们提供了一种利用小鼠氧诱导性视网膜病变模型来研究缺血性损伤后中枢神经系统内血管再生失败机制的实验方案。该系统还可用于探索促进视网膜和中枢神经系统内功能性血管再生的策略。...

利用小鼠视网膜评估中枢神经系统中的血管再生

离体血液灌注肺制备方法使得肺表面微血管网络的可视化成为可能。本文介绍了一种利用实时荧光成像技术定量分析离体肺中单个微血管通透性的方法。...

在离体血液灌注大鼠肺模型中定量单个微血管通透性

重现器官特异性的微环境（可刺激局部血管生成）对于受损组织的成功再生至关重要。本报告展示了一种新方法，即将纤维蛋白凝胶植入活体小鼠的肺表面，以探究肺特异性微环境如何调控成年小鼠中的血管生成及肺泡再生。...

在小鼠肺部植入纤维蛋白凝胶以研究肺特异性血管生成

为恢复肾功能而给予药物时，需要控制治疗化合物的定位和分布。本文详细描述了一种在大鼠中进行肾内给药的简单技术。该操作易于实施，无死亡率，且具有高度可重复性。...

向大鼠肾脏血管内递送生物制剂

本文介绍了一种下肢缺血的实验模型，并结合一系列功能学、组织学和分子生物学检测方法 ，用于评估促血管生成疗法的有效性。​...

评估小鼠后肢缺血模型中的治疗性血管生成

氧诱导的视网膜病变（OIR）可用于模拟缺血性视网膜疾病，如早产儿视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变，并可作为评估抗血管生成药物治疗新生血管疾病的概念验证研究模型。OIR...

用于啮齿类动物缺血性视网膜疾病的氧诱导视网膜病变模型

在此，我们提出了一种优化的大鼠肺移植模型，可改善手术预后。我们根据体重提供了套管尺寸指南，以及一种用于确定4th...

一种用于研究热缺血/再灌注损伤的大鼠肺移植模型：改善预后的优化策略

该方案概述了一种可行、可靠且可重复的小鼠左肺门阻断方法，可用于研究小鼠模型中的肺缺血-再灌注损伤。...

小鼠左侧肺门阻断型肺缺血再灌注损伤模型

本文详细描述了一种使用自体血凝块建立微创大鼠肺栓塞模型的方法学。同时还提供了用于量化梗死面积和可视化肺动脉树的其他方法。...

建立一种使用自体血栓的微创大鼠肺栓塞模型

本研究描述了一种通过开腹手术在大鼠中进行胸腹主动脉阻断后内脏缺血-再灌注所致急性肺损伤的模型。该模型可用于研究主动脉阻断的临床和生物学效应，以及缺血-再灌注对内脏器官和远隔肺部损伤的影响。...

通过腹腔干上主动脉阻断建立大鼠内脏缺血-再灌注后急性肺损伤模型

学习在大鼠肺缺血模型中诱导支气管血管新生的手术方法。通过荧光测量和组织学分析评估左肺血管生成，为研究肺部血管病理机制提供可靠的实验技术。

缺血大鼠肺组织中的血管生成

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