缺血大鼠肺组织中的血管生成

本实验的总体目标是结扎左侧肺动脉。首先对麻醉大鼠进行气管插管并实施机械通气，随后进行开胸手术，进而结扎左侧肺动脉。

连接后，关闭胸腔并让大鼠恢复。最终，可通过测量组织中的荧光水平或其他组织学方法来评估左肺的新生血管形成程度。该技术的主要优势在于，它提供了研究肺内支气管循环在体发育及新生血管形成的机会。

这为研究通气肺中这种新生血管系统的复杂三维结构提供了机会。目前大多数研究者通常进行体外实验，研究内皮细胞增殖、趋化性或管腔形成，而本方法与此有显著不同。通常，初次操作该实验步骤的研究者在分离左肺动脉与左支气管之间的组织时会遇到困难。

我唯一能提供的建议是多加练习、保持耐心，并经常观看本视频，以观察手术方法是否存在细微的调整。本实验操作由来自我实验室的技术员 John Jenkins 示范。首先，将麻醉后的大鼠置于手术板上，连接鼻罩以持续给予麻醉气体，用塑料导管对动物进行气管插管，并将大鼠连接至呼吸机。

在眼部涂抹药膏后，将大鼠置于其右侧，并用胶带固定四肢。去除手术区域的毛发，并用碘伏和酒精反复擦拭消毒皮肤。准备就绪后，横向切开皮肤。

接着钝性分离，切开脂肪和组织各层，暴露肋骨。暴露后，确定第三肋间间隙，用镊子在第三和第四肋骨之间进行钝性切开。将肋骨撑开器插入切口，轻柔地撑开肋骨，直至可见肺组织。

固定切口。首先，用右手将左肺复位。然后用直血管钳，用左手夹住左肺动脉和气道。

左肺动脉应位于气道上方，且镊子应与台面垂直。对齐后，应正确使用刻纹镊子在左主支气管与肺动脉的自然边界处将其分开。此分界线在两个独立结构之间呈现为一条细而发白的线。

注意不要穿透血管。将镊子的尖端沿着分离面滑动。以这种方式继续操作，直到左肺动脉位于镊子的弯曲处。

用左手轻轻松开直血管钳，并取一段预先剪好的缝线。打开弯血管钳，轻托动脉，使其足以夹住缝线。沿弯钳的弧度方向，轻柔地向上拉动缝线穿过组织。

穿过之后，收紧缝线以阻断左肺动脉，并用镊子夹住缝线，剪去剩余部分。缝合肋骨，注意不要松散地缝合皮肤。

打一个方结以闭合肋骨。通过短暂阻塞呼吸机的呼气管路使肺过度膨胀，然后拉紧缝线。在剪断线头前再打一个完整的结以固定缝线。

移除末梢呼气压，观察30秒以确保肺部不发生塌陷。最后，滴加五滴布比卡因，用组织胶水关闭皮肤。

关闭异氟烷气体，但继续用空气为大鼠通气一到两分钟，直至自主呼吸恢复至稳定状态。随后，将气管插管与呼吸机断开，并确保大鼠能够自主呼吸后再将其移除。在接下来的24小时内定期给予局部镇痛药。

最后，擦去眼部的药膏，并在预定时间内监测动物直至其恢复。缺血后，可注射标记的微球。为评估支气管灌注程度，使用小容量输注泵以恒定速率将标记微球注入左侧颈总动脉。

将导管连接至一个钝头25号针头和一个四通旋塞阀。开始时，请遵循之前演示的手术准备工作。准备就绪后，沿颈部正中线进行钝性切口。

解剖组织以暴露气管和左侧颈动脉。在颈动脉下方穿过两根缝线并分离后，结扎近端缝线并扎紧。接着，在动脉上做一个小切口，插入充满生理盐水的导管。

用上游缝线将此固定。该血管铸型清晰地展示了肺部支气管血管生成现象。左侧肺动脉结扎后28天，于结扎后第3天获取的左肺气道切片如图所示。

注意气道壁内有两个充满红细胞的显著支气管血管。插图经染色以显示支气管动脉中增殖的内皮细胞。此例为结扎后14天采集的左肺组织切片。

请注意此时支气管血管的尺寸增大，而在未处理大鼠的左肺中，用于评估体循环灌注程度的肺动脉荧光几乎无法检测到。然而，在结扎后14天的大鼠左肺中，检测到显著且稳定的一致水平。一旦掌握该技术即可进行。

如果操作得当，该技术可在一小时之内完成。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对大鼠进行插管、实施开胸术，并成功结扎肺动脉。根据您的研究结局指标，您还应能够对左侧颈总动脉进行插管，并灌注标记的微球以进行灌注分析。