用于成像和膜片钳电生理学研究的巨型脂质体的制备

本实验的总体目标是以一种与整合在囊泡膜中的膜蛋白功能完整性相兼容的方式制备巨型单层脂质体。首先将脂质或小脂质体沉积到导电表面（例如镀有氧化铟锡的玻璃载片）上；第二步是以受控方式蒸发溶剂，从而在导电表面上形成均匀的脂质膜。

接下来，用适当的缓冲液小心地重新水合脂质膜，并制备电形成腔室。最后一步是在脂质膜上施加交变电压，以生成巨大的未米勒囊泡。最终，将对囊泡进行成像，以确定其大小和质量，并与使用经典技术制备的囊泡进行比较。

本方案的可视化演示非常有用，因为脂质沉积操作较难掌握，受多种因素影响，且最佳检测方法为肉眼观察。在开始本实验前，将储存于负20摄氏度或负80摄氏度的脂质取出，并升温至室温。如有可能，应在惰性气体环境中（例如手套箱）进行实验。

接下来，用干燥的氩气或氮气覆盖脂质，并在所有步骤中尽量减少脂质与空气的接触。如果脂质未以有机溶剂提供，则将0.3毫克脂质悬浮于氯仿或环己烷中，浓度为10毫克/毫升。请注意，厂家提供的浓度通常仅为标称值。

使用乙醇清洁两片 25 毫米 × 37.5 毫米的 ITO 涂层载玻片的两面。然后在脂质中加入 0.1% 的 Texas red DPPE，用于荧光成像。使用万用表测量表面电阻，以确认载玻片的 ITO 涂层面朝上，此时电阻值应为几百欧姆。

用耐溶剂注射器吸取脂质，注射器针头不要接触ITO表面。通过来回移动针头，缓慢地将脂质涂布到载玻片上。均匀覆盖整个表面，观察玻璃表面是否出现彩虹样光泽。

随后迅速将载玻片放入真空干燥器中，将腔室抽真空至低于1托的真空度，持续0.5至1小时，以去除任何残留溶剂。用惰性气体释放真空。

在硅胶垫圈的两侧均涂抹一层薄薄的硅脂，然后将垫圈放置在载玻片上。在载玻片的一端至少留出 5 毫米未覆盖的区域。接下来，通过将 27 号针头置于垫圈边缘，缓慢加入缓冲液，使每个垫圈孔洞的液面高出约 10%，并含有 3 毫摩尔的堆叠。

脂质水化后，需迅速完成后续步骤。由于脂质膜开始脱层，应立即使用万用表确认载玻片的导电面，然后将第二片ITO载玻片的导电面朝下贴合到垫片顶部。

确保密封区域外侧及与第一悬垂相对的一侧均留出至少五毫米的悬垂部分，并轻轻按压以确保密封良好。使用乙醇清洁两个悬垂部分。现在将ITO玻璃夹层固定到电极接触点上，例如铜条或密封垫泡沫。

此图展示了腔室和触点组件的爆炸视图，以供参考。详细方案可在文本协议中找到，使用万用表进行检测。请验证触点之间不存在电气短路，并确认触点与 ITO 表面正确连接。

接下来，将电穿孔形成室放入烘箱中，并将温度加热至比所用脂质中最高熔点高出10摄氏度。测量两个ITO涂层表面之间的间距，以确定正弦波的振幅。正弦波的振幅应约为每毫米ITO表面间距0.7伏特均方根（RMS）。对于每毫米的ITO表面间距，施加10赫兹的正弦波60至90分钟。

将发生器连接到电成型室，并使用万用表确认电压。电成型60至90分钟后，应形成巨大的无单层囊泡。使用配备Texas red染料滤光立方体的倒置显微镜对脂质体进行成像。

脂质体应呈球形，主要通过肉眼观察判断其形态，并且无缺陷，例如有丝状物从脂质体上悬挂下来。前述步骤涵盖了由纯脂质制备巨型脂质体的经典方法。下文展示了一种更具挑战性的制备方法，即使用小型脂质体进行制备。

首先，在20摄氏度下配制相对湿度为44%的饱和碳酸钾溶液。使用一个塑料酸奶和格兰诺拉麦片容器，其上层嵌套杯经过改造，在杯壁上钻有孔洞。将饱和盐溶液和过量盐置于带有内层搁板的可紧密密封的容器中。

填充后重新安装隔板，并确保液体液面位于隔板下方5至10毫米处。将湿度传感器放置在容器侧壁的凹槽中。用乙醇清洁ITO镀膜玻璃片的两侧。

使用万用表确定哪一侧具有导电性，并用样品名称标记非导电侧。接下来，在一个或多个孔的硅胶垫圈的两侧轻轻涂抹润滑脂。将载玻片的导电面朝上放置在实验台上，并将硅胶垫圈贴附到每个需要施加脂质的载玻片上。

确保玻片一端至少露出 5 毫米，以便连接电融合装置。压平垫圈以确保良好密封，用低盐等渗缓冲液将囊泡样品稀释至大约 1–2 毫克/毫升。将脂质以 1–10 微升的液滴形式滴加到玻片上。

将载玻片放置在饱和盐溶液上方的内层搁板上，并 tightly 密封容器。室温下静置三小时至过夜。此后，该载玻片可用于大脂质体的电形成，具体操作如经典方案中所示。

注意各个沉积物呈现的彩虹样外观。该图像显示的是由氯仿中沉积出的脂质电形成产生的脂质体，箭头所指为巨型脂质体。该图像模糊区域极少，表明制备效果良好。

下一张图像存在许多模糊区域，表明制备效果总体较差。请注意，箭头二所指区域的脂质体难以清晰分辨，而箭头三所指区域则无法将任何脂质体调至清晰对焦。图中显示的是通过小脂质体脱水沉积脂质后，成功电场形成的脂质体的10倍放大图像。

箭头指示在 40 倍放大下三个质量良好的脂质体，其大小约为 5 至 20 微米。在脂质体边缘可见一个清晰的环，表明为单腔室或近乎单腔室的脂质体。此处展示了从形成的巨型脂质体中切除的脂质膜片上记录到的辣椒素激活的 TRPV1 离子电流。

在加入辣椒素之前，漏电流显示封接电阻达到500兆欧。饱和浓度的辣椒素激活了较大的TRPV1电流。在尝试该操作过程中，随着辣椒素被冲洗出膜片，电流恢复至接近基线水平。

保持灵活性非常重要，因为许多因素会影响脂质在玻璃基底上脱水并形成均匀薄膜的过程。请参考我们的在线故障排除部分，并调整温度、湿度、脂质浓度和液滴大小，以获得最佳结果。