Drosophila 幼虫中研究先天性和昼夜节律调控光行为的光偏好实验

以下实验的总体目标是通过明暗偏好测试，检测果蝇幼虫的先天性和昼夜节律性光行为。首先在定义的明暗条件下培养实验用幼虫，以在幼虫体内建立初始的昼夜节律钟。随后将幼虫转移至持续黑暗环境中，使其昼夜节律钟进入自由运行状态。

当幼虫发育至三龄幼虫取食阶段后，将其分组，以检测其在不同昼夜节律时间点的趋光性偏好。通过计算偏好指数，并比较不同时间点及实验组之间的差异，获得实验结果，从而揭示趋光性的先天性及昼夜节律性特征。尽管该方法可用于研究光感知的先天性与昼夜节律调控机制以及光行为的神经处理过程，也可拓展应用于其他感觉系统，如嗅觉、味觉、化学趋向性和温度趋向性等。

同样，该方法也可修改用于学习和记忆测试。演示该实验操作的是来自我实验室的研究生 Alina 和 BMA。收集卵时，让成年果蝇在新鲜的培养基上交配并产卵 12 小时，然后将其转移到新的培养瓶中。在 12 小时光照、12 小时黑暗的循环条件下，每隔 12 小时将成虫转移一次。

将12小时的卵收集物置于培养箱中孵育。实验中，将动物培养至早期三龄幼虫阶段，这些幼虫在卵孵化后84至108小时之间开始进食。

正确分期LAE对实验成功至关重要。从三龄晚期开始，LAE的视觉行为发生变化，以检测视觉行为的昼夜节律成分。在测试前48小时以及幼虫主观黎明之前，将收集的幼虫放入纸板箱中。

然后将盒子转移至恒定黑暗的培养箱中，静置48小时直至实验开始，在此期间，这些幼虫必须在其专用空间内保持不受干扰。取一个直径九厘米的培养皿的皿盖，使用一个边长20厘米的正方形并将其均分为四个象限，作为引导。

将10厘米见方的铝箔粘贴在相对的两个象限上，并用黑色胶带覆盖。务必覆盖盖子的边缘。接下来，在桌面光源正下方粘贴一个被分为四个象限的20厘米见方的方块。

在纸张上标记培养皿的圆周，作为保持一致位移的参考指引。使用铁质支架在培养皿上方安装LED灯。调节灯的高度，使整个测试平板均匀受光。

通过进一步调节灯的高度或使用可调电源，将测试位置的光照强度调整至350至760勒克斯之间。实验房间需要红光照明，且温度必须与动物饲养环境相同。小瓶在持续黑暗条件下培养两天。

用刮勺从食物表层最上方5毫米处收集食物中的幼虫。将食物均匀铺展在培养皿盖的外侧。向食物中加入一些水，并用刮勺轻轻搅拌混合。

使用画笔向新培养皿中加入一滴自来水。将幼虫转移至水滴中以清洗。然后用湿润的画笔收集幼虫。

仅选择早期三龄幼虫，避免晚期游走的三龄幼虫。将选中的幼虫转移至测试平板的中央。早期三龄幼虫的前端球状结构呈开放状并向外突出。

呈指状结构。后部球状结构每个具有三个开口以及四组大型分枝毛。唾液腺延伸至第二腹节。

将30只幼虫放置于测试平板中央后，盖上准备好的盖子。打开LED灯，启动计时器，让幼虫在平板上自由活动五分钟。

然后迅速打开盖子，统计黑暗区域和光照区域中的幼虫数量。标记每条幼虫的位置有助于计数。快速拍摄照片也有帮助。对于光偏好不明显的幼虫，例如在壁面上爬行或钻入琼脂中的幼虫，应记为中性偏好，并在计算光偏好指数时计入幼虫总数。

计数幼虫后，弃去培养板，并为下一次实验使用新的测试板。每种基因型完成10至15次试验后，按照方案进行后续分析。在两个不同的昼夜节律时间点比较了Canton ES幼虫的明暗偏好。

在主观上的CT零点和CT 12点，将幼虫置于标准条件下于黎明和黄昏阶段孵育48小时，随后转入持续黑暗环境三天。在350勒克斯光照条件下进行明暗测试，结果显示，在CT零点测试的幼虫对光的敏感性高于在CT 12点测试的幼虫。根据该公式计算，CT零点幼虫的避暗偏好值为0.52，而CT 12点幼虫为0.36。

通过使用Wilcoxon检验比较CT 12幼虫的各项指标，得到的P值为0.023，具有显著性差异。观看本视频后，您应能充分理解如何在不同电路和时间点检测滋养幼虫的趋光性。您应能够对F3期的滋养幼虫进行同步化培养，检测其避光行为，并计算光偏好指数以进行统计学比较。