端粒长度和端粒酶活性;阴阳细胞衰老
May 22nd, 2013
描述一个准确的，短的，复杂的和廉价的方法，使用定量RT-PCR在多个组织和物种评估端粒长度。此外，我们将介绍一个简单的检测，以评估作为一个互补的骨干测试端粒长度的端粒酶活性。
该程序的总体目标是提供一种简短、准确且廉价的方法来评估多种组织和物种中的端粒长度和端粒活性。这是通过首先分离基因组 DNA 以使用定量实时 PCR 测定端粒长度来实现的。第二步是在保留端粒酶功能的缓冲液中分离和溶解相同组织的细胞，并使用实时 PCR 定量测量端粒酶。
最终，端粒长度测定和端粒酶活性检测都用于寻找端粒长度与细胞衰老之间的关系、端粒缩短和恢复对衰老和细胞增殖状态的反应的可能机制。当我在寻找一种快速简便的方法来测量 ome 长度和 omera 活性时，我第一次接触到这种方法。这项技术对年龄相关疾病和过早死亡的诊断具有广泛的意义，因为它报告了细胞状态，这反映了器官状况和整体体型。
演示此程序的是我实验室的技术员 Ur Bogo 先生。要开始此程序，请使用专为血液来源配制的 Qiagen DNE 试剂盒从受试者的血液中分离 DNA，这是最后一步。在 PCR 级水中洗脱 DNA，并使用分光光度计测量浓度。
接下来，按照 OC Callahan 等人所述为单拷贝基因或 SCG 对照和端粒制备储备 PCR 引物，将它们稀释至每微升 100 皮摩尔。在引物再水化时使用 PCR 级水，制备分离的 DNA 的系列稀释液。首先用 PCR 级水将储备 DNA 稀释至端粒反应的最高浓度为 6.1 ng/μL，端粒反应的最高浓度为 1.8 ng/μL。
对于 SCG 反应，让稀释液静置至少 15 分钟，然后再进行下一个反应。15 分钟后，根据此处所示的表格准备下一次稀释液。对列出的每个稀释度重复此作。
接下来，在标准 PCR 板中设置 PCR 反应。每个样品以及 SCG 对照一式三份运行。首先，向每个孔中加入 6 微升 PCR 级水，然后加入 10 微升 Cyber Green 反应混合物。
然后将此处显示的量的引物添加到各自的孔中。接下来，用 PCR 级水进一步将每种储备引物的等分试样稀释 10 倍，使最终浓度为 10 皮摩尔/微升。最后，将 2 微升连续稀释的 DNA 添加到各自的孔中，并用塑料粘性片盖住板以密封内容物。
然后将板放入实时 PCR 机器中。接下来，在 Roche four 80 light PCR仪上准备一个程序，从 10 分钟变性开始。以 95 摄氏度为步，然后循环 95 摄氏度 10 秒，60 摄氏度循环 5 秒，72 摄氏度循环 11 秒。
对于总共 50 个周期，请在每个周期后执行 Cyber Green 测量。接下来，热循环仪完成后开始程序。将 CT 线设置在指数曲线的起点，并记录每个样品越过阈值线时的循环值。
接下来，计算端粒和单拷贝基因样品之间的循环数比率。由于端粒具有多个区域，这些区域在每个周期中都会扩增，因此端粒 CT 值将小于单个基因拷贝数，从而导致比率小于 1。最后，根据 Terry Etal 的工作计算端粒长度，其中每个单基因拷贝配给单位一个端粒相当于平均端粒长度 4， 270。
白细胞中的碱基对使用 Allied Biotech 的定量端粒酶检测进行端粒酶活性测量，开始测量，收集 10 到 5 到 10 到 6 个外周血细胞，并在 PBS 中冲洗它们。然后在室温下以 500 倍 G 沉淀 10 分钟。接下来，将沉淀重悬于检测试剂盒中的 200 μL 1 x 裂解缓冲液中，并在冰上孵育 30 分钟。
孵育后，将样品在 4 摄氏度下以 12， 000 倍 G 离心 30 分钟。为了沉淀细胞碎片，将 160 μL 所得上清液转移到新试管中并闪蒸，将剩余的上清液在乙醇和干冰浴中冷冻，然后在零下 80 摄氏度下储存以重复使用。接下来，通过标准 BCA 测定法测定上清液的蛋白质浓度。
对于收集的每个样品，根据端粒酶试剂盒的工作范围计算检测所需的蛋白质量。然后，由于端粒酶是一种热敏酶，因此通过在 85 摄氏度下孵育 10 分钟，将每个样品的一半加热灭活用作阴性对照。接下来，通过连续稀释原液来制备定量标准曲线。
TSR 寡核苷酸使用裂解缓冲液将储备液稀释 5 倍，稀释 1 至 5 倍。TSR 寡核苷酸与端粒引物具有相同的序列，并且具有已知的浓度。接下来，设置由每个样品和 11.5 μL 2 x 定量端粒酶检测预混液和 11.5 μL PCR 级水组成的预混液和混合物。
然后将 24 微升预混液移液到正在使用的每管中。分配预混液后，向孔中加入由标准品、加热和活化样品或常规样品组成的每种模板的 1 微升。接下来，用粘性塑料片密封板，并通过涡旋混合样品。
然后将它们放入实时 PCR 检测系统中。将 PCR 程序设置为在 25 摄氏度下开始 20 分钟。在此期间，端粒酶反应将发生。
随后在 95 摄氏度下放置 10 分钟，进行初始 PCR 活化步骤。然后执行 40 个 95 摄氏度 30 秒、60 摄氏度 30 秒和 72 摄氏度 30 秒的循环。放大在 20 摄氏度下添加的端粒模板 25
.最后，运行程序并收集每个样品的阈值循环值。然后使用 CT 值生成标准曲线并使用它来计算端粒酶活性。在所示的示例中。
以下是一名 65 岁受试者的实时 PCR 结果。由亮红色线代表的端粒基因在大约 27 个周期后达到其指数曲线。第二组线代表单拷贝基因扩增，它在基因组中只有一个拷贝，因此比红线表示的端粒样本的拷贝数少。
此外，单拷贝基因在大约 31 个循环后达到其指数曲线。棕色线表示基于已知样品浓度的连续稀释的 33 标准曲线。浓度对数与阈值的标准曲线如图所示。
一条直线确认连续稀释液已准确测量和上样。然后使用实时 PCR 分析的结果来估计端粒长度。一个端粒与单个基因拷贝比率单位相当于白细胞中 4， 270 个碱基对的平均端粒长度，从这些数据得出的比率为 0.87，即 3， 715 个碱基对的平均长度，对于这个年龄的人来说。
使用定量实时 PCR 检测的结果，可以阐明端粒活性与端粒与单个基因拷贝比之间的关系。该图显示了两种检测方法在其开发后的密切关系。这项技术为衰老领域的研究人员探索模态生物体、患者人口统计学和器官系统中的细胞衰老铺平了基础。
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概述
本文介绍了一种使用定量实时PCR（qRT-PCR）评估各种组织和物种端粒长度和端粒酶活性的方法。该技术旨在提供一种成本效益高且高效的方法来理解端粒动态及其对衰老和细胞增殖的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 遗传学
背景
- 端粒对于染色体稳定性和细胞衰老至关重要。
- 端粒酶是维持端粒长度的酶。
- 了解端粒动态可以提供对年龄相关疾病的洞察。
- 当前测量端粒长度的方法可能复杂且成本高昂。
研究目的
- 开发一种简单准确的测量端粒长度的方法。
- 评估端粒酶活性作为一种互补测试。
- 探索端粒长度和细胞衰老之间的关系。
使用的方法
- 用于端粒长度测量的基因组DNA分离。
- 用于端粒长度测定的定量实时PCR。
- 在缓冲液中分离细胞以保持端粒酶功能。
- 使用实时PCR定量测量端粒酶活性。
主要结果
- 该方法可有效测量多种组织中的端粒长度。
- 端粒酶活性可以与端粒长度一起进行定量评估。
- 研究结果表明端粒长度与细胞衰老过程之间存在联系。
- 该技术对诊断与年龄相关的疾病具有潜在的影响。
结论
- 该方法提供了一种研究端粒动态的可靠方法。
- 它可以增进对细胞衰老和相关疾病的理解。
- 该技术可能有助于年龄相关健康诊断的进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Telomere length and telomerase activity serve as key biomarkers for cellular aging and proliferative capacity, offering predictive value in target validation for age-related disease mechanisms. This qRT-PCR-based method enables rapid, cost-effective assessment across tissues and species, supporting early discovery decisions by linking molecular signatures to senescence pathways. The approach provides mechanistic de-risking by quantifying telomere dynamics that influence cell viability and genomic stability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of telomere maintenance pathways as therapeutic targets in aging and cancer.
- Operational Value: Provides quantitative telomere length and telomerase activity readouts to validate target engagement in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, normalized telomere-to-single-copy-gene ratios for high-throughput screening of modulators.
- Operational Value: Uses standardized qRT-PCR workflows with serial dilution controls to ensure assay precision across sample sets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by correlating telomere attrition with senescence phenotypes in primary cells.
- Operational Value: Facilitates longitudinal tracking of telomerase activity in cell proliferation assays to inform lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing orthogonal biomarker data to de-risk mechanistic hypotheses.
- Discovery Biology: Measures telomere length dynamics to assess pathway modulation and cellular senescence induction.
- Screening: Delivers quantitative, normalized outputs suitable for assay standardization and hit confirmation.
- Analytics: Generates cycle threshold (CT) ratios and standard curves enabling statistical comparison of telomerase activity across conditions.
- Translational Research: Connects telomere length measurements to cellular aging models for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable qRT-PCR platform applicable across tissues, species, and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic linkage of telomere dynamics to cell senescence.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and low-cost scalability via qRT-PCR and serial dilution controls.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing ambiguity in aging-related target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on telomere length and telomerase activity biomarkers.
Implementation Considerations
- Expertise in qRT-PCR setup, primer design, and serial dilution preparation.
- Instrumentation requiring real-time PCR detection systems with thermal cycling capability.
- Standardization of lysis buffer conditions to preserve telomerase function during activity assays.
- Adaptation considerations for DNA input normalization across diverse tissue types and species.
- Practical limitation: Telomere length calculation relies on established conversion factors (e.g., 4,270 bp per ratio unit) that may require validation in new models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Telomere Length Measurement using Quantitative Real-Time PCR
5:50
Quantitative Telomerase Detection Activity Measurement
9:47
Results: Quantitative Real-Time PCR is Used to Determine Telomere length and Telomerase Activity in Human Leukocytes
11:41
Conclusion
