Name: 端粒长度和端粒酶活性;阴阳细胞衰老 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 了解使用定量实时PCR技术测量端粒长度和端粒酶活性的方法，用于研究细胞衰老和衰老相关疾病的诊断。该技术适用于多种组织和物种，为衰老研究提供可靠工具。

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1. 端粒长度检测方案19
1. DNA 提取
大多数DNA提取方法均可使用。本实验室对于血液样本优先使用Qiagen DNeasy试剂盒（#69506）。根据DNA来源的不同，例如口腔黏膜细胞或其他来源，可采用不同的提取方法。
2. 引物
所有引物均用PCR级水稀释至100 pmol/μl的储存浓度，并于-20 °C保存直至使用。工作浓度的引物需新鲜配制，可短期存放于20 °C（数月）。端粒和作为SCG的β-珠蛋白的标准引物参照O'Callaghan 等20所述方法使用。
引物序列： 
Telo 1：5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3'
Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3' 
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3' 
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3'
注意：引物在加入反应体系前需稀释至10 pmol/μl的工作浓度。
3. 基因组DNA的连续稀释
为端粒（Telo）和单拷贝基因（SCG）制备基因组DNA的系列稀释液，以生成该检测的标准Ct值曲线。所用基因组DNA从血液样本中的淋巴细胞中提取。这些稀释液通过将DNA用PCR级H2O逐级稀释，每次稀释倍数为1.68，从而使用相同的基因组DNA制备出两组系列稀释液。起始浓度已通过反复试验优化确定，在使用不同试剂、仪器、其他物种的DNA、不同细胞类型或不同的单拷贝基因时，可能需要进行调整。
注意：使用基因组DNA进行连续稀释时，需轻柔混匀，并在取样进行下一次稀释前至少静置15分钟至1小时。每次稀释均需给予基因组DNA足够的解离时间。如需长期保存，应将连续稀释的DNA分装至PCR排管中，于-80 °C保存。每次使用时仅解冻一管，并一次性用完，以避免反复冻融对DNA造成损伤。
4. 逆转录 PCR 反应体系的建立
所用仪器：Roche480 Light Cycler
试剂：Roche Light cycler sybr-green
将待测DNA样本稀释至终浓度为10 ng/μl。我们使用Nanodrop或Qubit检测浓度。随后将DNA从10 ng/μl进一步稀释至终浓度5 ng/μl。不再重复检测浓度。
反应组分：
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td fo:width="1.5in">TELO</td>
 <td fo:width="1.5in">1x</td>
 <td fo:width=".25in" rowspan="6"> </td>
 <td fo:width="1.5in">SCG</td>
 <td fo:width="1.5in">1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H20</td>
 <td>6 μl</td>
 <td>H20</td>
 <td>6 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Telo 1</td>
 <td>0.2 μl</td>
 <td>SCG 1</td>
 <td>0.6 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Telo 2</td>
 <td>1.8 μl</td>
 <td>SCG 2</td>
 <td>1.4 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rxn mix</td>
 <td>10 μl</td>
 <td>Rxn mix</td>
 <td>10 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA 或梯度稀释液</td>
 <td>2 μl</td>
 <td>DNA 或梯度稀释液</td>
 <td>2 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
注意：主混合液（Master Mix）在不含 DNA 的情况下制备，且需过量 5% 至 10%。
Telo 和 SCG 应在同一块板上使用以下程序同时进行扩增。为检测精确性，每个样本和对照应至少运行三个重复。所用引物的差异可能影响实验结果。本方案已针对 Roche 480 Light Cycler 及本实验室所用引物优化至如下条件。
初始变性 
95 °C 变性 10 分钟 
循环反应 
95 °C 保持 10 秒 
60 °C 保持 5 秒 
72 °C 保持 11 秒并进行单次信号采集 
根据需要重复 45 至 55 次
2. 定量端粒酶检测（QTD）方案（基于Allied Biotech, Inc. 公司QTD试剂盒，货号MT3012）
提取制备
<ol>
 <li>离心收集细胞或组织。</li>
 <li>用 1× PBS 洗涤一次。</li>
 <li>再次离心并弃去 1× PBS。</li>
 <li>每 105–106 个细胞或 40–100 mg 组织，用 200 μl 1× 裂解缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
 <li>冰上孵育 30 分钟。</li>
 <li>在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 30 分钟。</li>
 <li>将 160 μl 上清液转移至新管中，并测定蛋白浓度。</li>
 <li>将剩余提取液分装后在干冰/乙醇中速冻，于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
*在此条件下，冷冻细胞或组织中的端粒酶至少可保持稳定一年。解冻后使用时，应立即用1×裂解缓冲液重悬细胞。
2.1. 检测对照
热灭活对照：每个样本均需额外设置一个对照提取物，于端粒酶活性检测前在85 °C下孵育10分钟进行热处理。
TSR对照模板的标准曲线：使用TSR的稀释液进行定量实时PCR扩增，TSR是一种与试剂盒中提供的端粒引物序列相似的寡核苷酸，用于生成标准曲线。
<ol>
 <li>用裂解缓冲液将储备TSR浓度（0.5 amol/μl）进行1:5倍比稀释</li>
 <li>取每种TSR稀释液及储备液各1 μl，进行端粒酶检测标准实验。这些稀释液可在4 °C下保存至少2周。</li>
</ol>
2.2. 使用QTD实时PCR检测端粒酶活性
<ol>
 <li>每个样本中，向 PCR 管或薄壁 PCR 板中加入以下组分（总体积 25.0 μl）：
 <ul>
 <li>12.5 μl 的 2 x QTD Premix</li>
 <li>1.0 μl 的细胞或组织提取物</li>
 <li>11.5 μl 的 PCR 级水</li>
 </ul>
 </li>
 <li>充分混匀</li>
 <li>按照以下程序设置实时荧光定量 PCR 检测系统： 
 - 25 °C 反应 20 分钟（端粒酶反应） 
 - 95 °C 预变性 10 分钟（PCR 初始激活步骤） 
 进行 35–40 个循环： 
 - 95 °C 变性 30 秒 
 - 60 °C 退火 30 秒 
 - 72 °C 延伸 30 秒</li>
 <li>将 PCR 管放入热循环仪中，并启动循环程序。</li>
 <li>循环结束后，收集阈值循环数（CT 值）。阈值循环数是指 ΔRn 出现具有统计学意义的显著增加时所对应的循环数。</li>
</ol>
2.3. 数据分析
<ol>
 <li>使用CT读数生成标准曲线，并比较端粒酶活性。</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

端粒长度为研究应激和衰老细胞提供了一种独特的细胞标志物，并有助于揭示衰老的机制。自从首次提出其在衰老过程中的作用以来，已有大量研究将端粒长度与年龄、寿命、年龄相关疾病、癌症以及应激联系起来。几十年来，端粒长度测量的金标准是采用Southern杂交的末端限制性片段分析。然而，近年来Cawthon开发出一种经济、快速且易于操作的新方法。通过定量实时PCR，Cawthon提供了一种测量端粒长度的有效替代方案，使得大样本量的研究成为可能。
利用qRT-PCR技术，已有大量研究探讨了端粒长度与多种结局之间的关系，尤其是与年龄相关疾病的关系。更具体地说，该方法使研究人员能够在人群层面开展大规模的流行病学研究，以验证或否定端粒长度与多种疾病之间的相关性。例如，缺血性心脏病7、阿尔茨海默病22、女性骨肉瘤23、吸烟者的肺癌24、家族性甲状腺癌25、糖尿病5、血压26、衰老27以及痴呆28均已被证实与较短...

端粒是位于染色体末端的重复DNA六聚体（TTAGGG）序列。在每次细胞复制过程中，这些染色体末端都会缩短。如果端粒变得过短，染色体可能发生端粒末端融合、异常重组和降解。因此，维持足够的端粒长度在染色体稳定性和细胞保护中起着重要作用38。端粒长度的维持对于位于染色体末端附近的基因也至关重要，因为DNA复制无法持续到染色体的最末端1-2。因此，防止端粒缩短可能有助于提高细胞稳定性。
许多研究报道，端粒长度与生物体的寿命及疾病状态相关，例如癌症3-4、糖尿病5和心血管疾病6,7。此外，端粒缩短还与过度压力或不健康的生活方式有关8，可能是通过促进细胞过早衰老和死亡所致9。然而，也有研究发现，端粒长度与寿命及年龄相关疾病之间并无显著差异39, 40, 41。
细胞抵御端粒缩短的天然机制之一是激活其自身的端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase, TERT）。该酶及其亚基——端粒酶RNA（telomerase RNA, TERC），一种非编码RNA，以端粒为模板，在染色体末端添加端粒重复序列10。尽管端粒酶活性在多种细胞类型中缺失，且其他机制也参与端粒长度的维持，但端粒酶活性的增强与端粒长度的增加相关。端粒酶的激活已被确认为细胞应对损伤和应激、避免过早衰老和死亡的机制之一。例如，在具有超常寿命的阿什肯纳兹犹太人群体中观察到了更长的端粒11，TERC或TERT的突变被证实可导致致命性疾病12，而端粒酶的表观遗传调控也被证明会影响衰老相关疾病的发生13。自发现以来，端粒长度已被提出作为多种动物模型及人类健康状况的生物标志物，但早期研究因所用方法繁琐、耗时且昂贵，难以广泛重复验证。2002年，Cawthon提出并验证了一种新型、准确、快速且简便的基于PCR的检测端粒长度的实验方案，并于2009年进一步优化，用于深入研究端粒长度在细胞生物学、衰老及疾病等多个方面的功能19。
为研究选择正确的端粒长度测量方法至关重要。目前有多种用于测量端粒长度的方法，每种方法都有其各自的优缺点。传统上，端粒长度通过末端限制性片段（TRF）的Southern印迹分析进行测定，其步骤包括：a. 使用不在端粒重复序列内切割的限制性内切酶消化DNA，以获得末端限制性片段（TRF）；b. 利用端粒探针通过Southern印迹法检测这些TRF，并确定平均TRF长度14, 37。尽管该方法准确性高、变异系数小，属于直接测量方法，且适用于分析长度分布，但TRF分析成本较高、操作繁琐，并至少需要3 μg的DNA。此外，该方法对短端粒不敏感，且由于亚端粒区DNA含有类似（TTAGGG）n的序列，可被探针检测到，从而干扰端粒长度的准确测定15, 42。
另一种高精度测量端粒长度的方法是单个端粒延长长度分析法（STELA），这是一种基于单分子PCR的技术，仅需少量DNA。该方法设计引物以识别染色体末端的富含G的突出端，并与某一条染色体上的独特亚端粒序列结合，从而扩增特定染色体的端粒。扩增产物随后通过Southern印迹进行检测。该方法的优点是精度高，能够检测到较短的异常端粒16。然而，由于并非所有染色体都具有富含G的末端和可用的亚端粒序列，因此只能对特定染色体的端粒长度进行测量，这些测量结果可能无法代表细胞中所有端粒的实际长度15。
另一种已应用的方法是使用肽核酸（Peptide Nucleic Acid, PNA）探针来检测端粒长度。定量荧光原位杂交（Quantitative Fluorescence in situ Hybridization, Q-FISH）可使我们在中期染色体中直接观察端粒，通过PNA探针对端粒进行染色，其荧光强度与端粒长度成正比，从而实现不同特定染色体之间端粒长度的比较。尽管该方法也可用于间期细胞，但在间期无法分辨各个染色体的端粒长度，因此在检测衰老细胞或分裂不频繁细胞的端粒长度时存在局限性17。而流式FISH（Flow FISH）则结合流式细胞术，目前是临床环境下测量血细胞端粒长度最敏感的方法，但该技术需要由经验丰富的技术人员操作18。
目前，我们实验室测量平均端粒长度的标准方法利用了定量实时 PCR 的精确性、灵敏度和便捷性。该方法之所以能够用于测量端粒长度，得益于新型引物的开发，这些引物可避免引物二聚体产物的合成，而此类产物在标准检测中会因端粒的重复性质而产生。在此检测中，端粒长度以 T/S 比值表示，即端粒重复序列拷贝数与单拷贝基因数之比。由于端粒长度与 PCR 初始阶段结合 DNA 的标记端粒引物数量呈直接正比关系，因此 T/S 比值与端粒长度成正比。T/S 比值通过比较使用端粒引物和 SCG 引物的样本在 Ct 值上的差异来测定，Ct 值是指样本累积荧光信号超过基线荧光数个标准差阈值时所对应的循环周期分数19。该方法因对端粒长度的间接测量而受到批评，可能导致测量结果不准确，例如在染色体重复或拷贝数变异的情况下15。此外，不同研究之间的比较通常较为困难，但已有标准寡核苷酸被开发用于测量绝对端粒长度20。Cawthon 进一步改进了该方法，采用单色多重 qPCR 检测。在此检测中，PCR 前几个循环在较低温度下运行，以避免引物二聚体结合，并将端粒和对照基因在同一 PCR 管中进行分析，从而进一步减少误差。所得的端粒长度测量结果与通过 TRF 的 Southern 印迹分析测得的端粒长度高度相关，且准确性更高15, 19, 36。目前，qRT-PCR 是唯一适用于大样本量检测的便捷方法，且仅需少量 DNA 即可完成。该方法的关键部分在于全面的质量控制措施，因此在操作得当的情况下，可提供有关端粒长度的有价值比较信息。此外，该方法已被扩展应用于白细胞以外的多种不同组织中的端粒长度测量42。
此外，为了进一步理解端粒长度维持背后的生物学机制以及两种相反效应之间的相互作用（即 在复制过程中端粒缩短以及端粒酶介导的端粒延长的背景下，我们将端粒长度检测方法与另一种测定端粒酶活性的实验相结合。
为此，我们采用了端粒重复扩增法（Telomeric Repeat Amplification Protocol），一种 体外 检测。简言之，裂解并保存的、具有酶活性的细胞利用端粒酶在寡核苷酸底物上合成端粒重复序列，产物在SYBR Green存在下通过PCR扩增。随后通过比较样本与对照的Ct阈值分析结果。由于端粒酶是一种热敏感酶，每个样本均需平行运行一个额外的加热处理对照。 21.
尽管测量端粒长度可为端粒长度在衰老和疾病病理生理学中的可能作用提供有价值的见解，但端粒长度并非静态特性，还需更多信息来理解端粒功能。端粒酶活性研究可补充有关端粒长度调控机制的信息。例如，端粒酶的受控激活可维持端粒长度和细胞增殖，而端粒酶的非受控激活则可能导致癌症。这两种经济且简便的方法结合使用，不仅为我们提供了端粒长度与细胞稳定性之间关系的更有力证据，还进一步揭示了端粒缩短与恢复的可能机制。通过这些方法，我们希望进一步阐明细胞对衰老及不同细胞增殖状态的响应，最终更深入地理解细胞生物学的核心机制。

<table><tbody><tr><td>定量端粒酶检测</td><td>Allied Biotech</td><td>MT3012</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master，用于基于 SYBR Green I 的实时 PCR 的即用型热启动反应混合液，适用于 LightCycler 480 仪器</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707516</td><td></td></tr></tbody></table>

端粒长度与端粒酶活性：细胞衰老的阴阳平衡

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

端粒是位于染色体末端的重复DNA序列，其长度具有多样性，在人类中可长达15,000个碱基对。端粒在每次细胞分裂过程中起到保护染色体免受磨损的生物学防护作用。当端粒缩短至某一特定长度时，将无法支持进一步的复制，这一过程可能导致染色体不稳定或细胞死亡。端粒长度由两种相对的作用机制共同调控：缩短与延长。缩短发生在每次细胞分裂过程中。相反，延长则部分依赖于端粒酶的活性，该酶可在染色体末端添加重复序列。因此，端粒酶有可能逆转某种衰老机制，恢复细胞活力。这些因素在维持细胞生命活动中至关重要，也被用于评估细胞衰老程度。在本文中，我们将描述一种准确、快速、精密且经济的方法，用于检测多种组织和物种中的端粒长度。该方法利用了两个关键要素：端粒序列的串联重复特性，以及qRT-PCR技术对检测样本中拷贝数差异的高度敏感性。此外，我们还将介绍一种简单的检测端粒酶活性的实验方法，作为端粒长度分析的补充基础检测手段。

一种端粒长度qRT-PCR检测示例见于 图1左上方面板中，以红色和绿色标记的样本表示受试者在96孔板中的位置。右上方面板显示扩增曲线。每位受试者均通过两种检测（端粒和单拷贝基因）进行测试，每种检测均设三个复孔。由于所选个体在两种检测中产生的DNA拷贝数不同，荧光信号达到指数增长曲线所需的循环次数在不同检测间存在差异。在拷贝数较高的反应管中（即 端粒检测中，荧光信号量在27个循环后达到指数增长曲线。第二组曲线代表单拷贝基因（SCG），该基因在基因组中仅有一个拷贝，因此其拷贝数远少于端粒样本，需经过31个循环后才进入指数增长阶段。棕色曲线代表基于已知样本浓度梯度稀释所建立的标准曲线。右下角图示为标准曲线各点的对数浓度（一条直线表明梯度稀释效果理想）。该线性曲线用于计算待测样本管的浓度（左下角图示）。qRT-PCR结果最初由Cawthon建立 19，已被我们及其他研究者重复验证，结果表明其与末端限制性片段长度分析法所得数据具有相关性。一个T/S比值单位（端粒扩增的qRT-PCR循环数除以SCG扩增的qRT-PCR循环数）相当于白细胞平均端粒长度为4,270 bp <su...

本文描述了一种准确、快速、精密且低成本的方法，利用qRT-PCR技术在多种组织和物种中检测端粒长度。此外，我们还将介绍一种简单的检测端粒酶活性的实验方法，作为端粒长度检测的互补性基础实验。

端粒是位于染色体末端的重复DNA序列，其长度具有多样性，在人类中可长达15,000个碱基……

本实验的总体目标是提供一种简短、准确且低成本的方法，用于评估多种组织和物种中的端粒长度及端粒酶活性。该方法首先通过定量实时 PCR 技术分离基因组 DNA 以测定端粒长度；第二步是在能够保持端粒酶活性的缓冲液中分离并裂解相同组织的细胞，随后利用实时 PCR 定量检测端粒酶活性。最终，端粒长度测定和端粒酶活性检测均被用于探索端粒长度与细胞衰老之间的关系、端粒缩短的可能机制，以及对衰老和细胞增殖状态的恢复反应。我最初接触这些方法是在寻找一种快速简便的方法来测量端粒长度和端粒酶活性时。该技术的应用意义在于有助于诊断与年龄相关疾病及早亡风险，因为它能够报告细胞状态，从而反映器官状况和整体身体状态。本实验操作将由我实验室的技术员Mr.Ur Bogo进行演示。开始本实验前，使用专为血液样本设计的Qiagen DNE试剂盒从受试者血液中提取DNA，并在最后一步使用PCR级水洗脱DNA，然后使用分光光度计测定其浓度。接下来，按照 OC Callahan 等人的方法，为单拷贝基因（SCG）对照和端粒制备储存用 PCR 引物，将其稀释至每微升 100 皮摩尔。在引物复性过程中使用 PCR 级水，对已分离的 DNA 进行系列稀释。首先用 PCR 级水将储存 DNA 稀释，端粒反应的起始浓度为每微升 6.1 纳克，单拷贝基因反应为每微升 1.8 纳克。进行SCG反应时，每次稀释后至少静置15分钟，再进行下一次稀释。15分钟后，根据下表所示配制下一次稀释液。对所列的每一次稀释均重复此步骤。接下来，在标准的PCR板中设置PCR反应。每个样本以及SCG对照均设置三个重复。首先，向每个孔中加入6 µL的PCR级水，然后加入10 µL的SYBR Green反应混合液。然后，按照此处所示用量将引物分别加入对应的孔中。接着，用PCR级水将各储备引物溶液取一部分进行十倍稀释，使终浓度为每微升10皮摩尔。最后，向各对应孔中加入2微升经连续稀释的DNA，并用粘性塑料封膜覆盖反应板，以密封内容物。然后将反应板放入实时荧光定量PCR仪中。接着，在Roche four 80 Light Cycler上设置程序，首先在95°C下变性10分钟，随后进行循环：95°C 10秒，60°C 5秒，72°C 11秒。总共进行 50 个循环，每个循环后均进行 Cyber Green 检测。接着，在热循环仪完成程序后开始运行。将 CT 线设定在指数增长曲线的起始位置，并记录每个样本跨越阈值线时的循环数值。接下来，计算端粒与单拷贝基因样本之间的循环数比值。由于端粒具有多个区域，会在每个循环中扩增，因此端粒的CT值将小于单拷贝基因，导致比值小于1。最后，根据Terry Etal的研究计算端粒长度，其中每单拷贝基因对应的端粒比值单位相当于平均端粒长度为4,270。使用Allied Biotech的定量端粒酶检测试剂盒检测白细胞中

telomere-length-telomerase-activity-yin-yang-cell

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

端粒长度和端粒酶活性;阴阳细胞衰老

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