Name: 分离的小鼠胚胎面外胚层和间充质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学习使用Dispase II酶处理技术分离小鼠胚胎面部外胚层与间充质的方法。该方案适用于CD-1 E10.5胚胎，为发育生物学研究提供可重复的组织分离手段，助力探索面部发育机制。

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作者感谢Irene Choi为图1中的胚胎头部插图所做的工作，以及实验室其他成员提供的帮助和讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目DE012728（T.W.）支持

1. 准备中性蛋白酶II
<ol>
	<li>配制新鲜的HEPES缓冲盐水（HBS）（50 mM HEPES/KOH，pH 7.4，150 mM NaCl）。将2 ml 0.5 M HEPES/KOH（pH 7.4）和1.2 ml 2.5 M NaCl加入16.8 ml超纯H2O中。</li>
	<li>配制10 mg/ml Dispase II溶液。称取0.2 g Dispase II（Roche，货号# 4942078001），溶于20 ml HBS中。将溶液分装为每管1.0 ml，置于独立的Eppendorf管中，长期保存时储存于-20 °C。</li>
	<li>使用前将10 mg/ml Dispase II用PBS按1:10比例稀释。将稀释后的Dispase II置于冰上备用。</li>
</ol>
2. 从怀孕雌性小鼠中解剖 CD-1 E10.5 胚胎
所有动物实验均按照科罗拉多大学丹佛分校（UCD）动物护理与使用委员会批准的方案进行。CD-1（ICR）小鼠购自哈兰实验室（Harlan Laboratories，印第安纳波利斯，印第安纳州）。
<ol>
	<li>用70%乙醇清洁解剖区域和工具。</li>
	<li>按照批准的方案处死怀孕的CD-1雌性小鼠。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒腹部，然后切开腹腔。用一把镊子拉出子宫，另一把镊子撕离子宫周围的子宫系膜。将子宫从体内取出。对腹腔另一侧的子宫角重复此操作。</li>
	<li>在10 cm培养皿中用预冷的PBS短暂冲洗子宫，以去除血液。</li>
	<li>将子宫转移至另一含预冷PBS的培养皿中。通过在着床部位之间进行切割，将子宫分离为单胚胎片段。</li>
	<li>在体视显微镜下，将一个胚胎转移至含预冷PBS的培养皿中。用精细镊子从切割处开始撕开子宫肌层，暴露带有卵黄囊的胚胎。剥离卵黄囊和羊膜。将解剖出的胚胎转移至含PBS并置于冰上的6 cm培养皿中。按此步骤逐一收集所有胚胎。</li>
</ol>
3. Dispase II 处理
<ol>
	<li>在6 cm培养皿中用PBS清洗所有胚胎。将PBS更换为10 ml用PBS稀释的Dispase II溶液，盖上培养皿，在37 °C孵育25分钟；可使用细菌培养箱或恒温房间，此步骤无需使用CO2组织培养箱。</li>
	<li>取出培养皿，在体视显微镜下观察胚胎。外胚层应已变得松散，表现为该组织层与下方间充质之间出现明显间隙。若未达到此状态，于37 °C继续孵育5分钟。随后将培养皿置于冰上。</li>
</ol>
4. 分离出完整的面部突起
<ol>
	<li>使用一次性玻璃移液管（VWR，货号# 14672-380） 在体视显微镜下，将一个经Dispase II处理的胚胎转移至6 cm培养皿中的预冷PBS缓冲液内。</li>
	<li>使用一对镊子固定胚胎，再用另一对精细镊子小心地剪开头面部突起与头部相连的边界图1 显示面部突起的边界）。从一侧的下颌突（MnP）开始，然后是上颌突（MxP），最后是额鼻突（FNP）。另一侧以相同方式操作，完整分离出两侧的面部突起图2A).</li>
</ol>
5. 分离面部外胚层与间充质
<ol>
	<li>在具有3倍工作距离的体视显微镜下观察面部突起。使用一根长玻璃巴斯德吸管，轻轻将面部突起上下吹打5次。经过此操作后，外胚层易于剥离。</li>
	<li>用一对镊子夹住面部突起，用另一对镊子非常缓慢地剥离外胚层。图2B展示了分离出的面部外胚层片层。</li>
	<li>使用一根新的长玻璃巴斯德吸管，将面部外胚层转移至含有冰上预冷PBS的1.5 ml离心管中。将间充质转移至另一含有冰上预冷PBS的1.5 ml离心管中。</li>
	<li>每次解剖均使用新的冰冻PBS。收集样品。</li>
	<li>用PBS洗涤样品，在4 °C、500 × g条件下离心3分钟。</li>
	<li>使用长玻璃巴斯德吸管吸除PBS。若样品用于ChIP实验，请进入步骤6.1；若用于RNA提取，请进入步骤6.2；若用于蛋白质提取，请进入步骤6.3。</li>
</ol>
6. 处理样品以进行后续实验
<ol>
	<li>ChIP 实验样品
	<ol>
		<li>加入 1 ml 含 1% 甲醛的 PBS 进行交联，匀浆样品。</li>
		<li>室温旋转孵育 10 分钟。</li>
		<li>每管加入 110 μl 1.25 M 甘氨酸，以淬灭未反应的甲醛。</li>
		<li>混匀后室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下以 500 ×g 离心 3 分钟，弃上清液。</li>
		<li>加入 1 ml 冷 PBS 洗涤组织。</li>
		<li>在 4 °C 下以 500 ×g 离心 3 分钟。</li>
		<li>吸除 PBS，重复洗涤一次。</li>
		<li>去除上清液，将组织在液氮中速冻，于 -80 °C 保存，用于后续合并与处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 提取样品
	<ol>
		<li>将面部外胚层和间充质放入含有 RNAlater（Ambion）的离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 下于 RNAlater 溶液中孵育过夜，以确保试剂充分渗透组织。</li>
		<li>于 -20 °C 保存，用于后续合并与处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白提取样品</li>
</ol>
加入裂解缓冲液以供后续处理。或将组织在液氮中速冻。将样品于 -80 °C 保存，用于后续合并与处理。
注意事项
<ol>
	<li>时间限制。从开始解剖到进入第6步之前，预计需要4-6小时。</li>
	<li>熟练操作后，每个胚胎完成第4和第5步（突起解剖和外胚层分离）约需10-15分钟。</li>
	<li>若样品用于RNA提取，所有溶液均应先用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。同时使用RNase Away清洁镊子和操作区域。</li>
	<li>除Dispase II处理和解剖过程外，样品应始终置于冰上。每次解剖均应更换新的预冷PBS，以确保解剖所用PBS保持低温。</li>
	<li>锋利的镊子对实现精确解剖至关重要。务必彻底清洁镊子，防止任何污染。</li>
	<li>若需从不同突起收集样品，应在Dispase II处理后分别解剖各个突起，再分离外胚层与间充质。</li>
	<li>经Dispase II处理后，面部外胚层易于剥离。需特别注意避免其他外胚层组织的污染，所有可能受污染的组织均应弃用。</li>
	<li>一旦开始操作，应持续进行，直至样品达到第6步的适当阶段。应尽快完成所有胚胎的面部外胚层与间充质的分离。</li>
	<li>不同批次和品牌的Dispase II酶活性可能存在差异，因此需根据所用Dispase II的品牌和批次调整处理时间。</li>
</ol>

<ol><li>Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+craniofacial+development+and+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of craniofacial development and malformation.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).</li>
<li>Gritli-Linde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2+-+The+Etiopathogenesis+of+cleft+lip+and+cleft+palate%3A+usefulness+and+caveats+of+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.</a> Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).</li>
<li>Schutte, B. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+and+factors+of+orofacial+clefts%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">The many faces and factors of orofacial clefts.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).</li>
<li>Chai, Y., Maxson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+craniofacial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Recent advances in craniofacial morphogenesis.</a> Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).</li>
<li>Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+upper+lip%3A+Morphogenetic+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms.</a> Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).</li>
<li>Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectodermal+WNT%2F%CE%B2-catenin+signaling+shapes+the+mouse+face%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face.</a> Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+analysis+of+gene+expression+during+growth+and+fusion+of+the+mouse+facial+prominences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences.</a> PLoS ONE. 4, e8066(2009).</li>
<li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).</li>
<li>Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+the+mouse+Zic1%2C+Zic2%2C+and+Zic3+gene+suggests+an+essential+role+for+Zic+genes+in+body+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation.</a> Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).</li>
<li>Britsch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Sox10+is+a+key+regulator+of+peripheral+glial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development.</a> Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).</li>
</ol>

作者声明本文内容不存在竞争性利益或其他冲突。

本方案提供了一种基于 Dispase II 初步处理步骤来分离小鼠胚胎面部外胚层和间充质的简便方法。在以往的研究中，我们通常在 Dispase II 处理前进行面部突起的解剖，但始终发现间充质会变得“粘稠”，更难操作。我们的新方案避免了这一问题。通过移液器反复吹打施加温和的物理力，结合 Dispase II 处理，可更轻松地实现外胚层与间充质的分离。此外，该方案也适用于其他胚胎外胚层和间充质样本的分离，例如缩短 Dispase II 处理时间即可用于肢芽外胚层和间充质的分离。同样，该方法也可应用于发育的其他阶段——例如，通过延长 Dispase II 处理步骤，可用于分离 E11.5 时期的面部外胚层和间充质。
从E10.5小鼠面部突起获得的样本量非常小，因此我们通常将多批样本储存起来，以便后续集中处理和分析。为此，需要汇集100至150个胚胎的外胚层样本，才能获得10 mg组织。每个胚胎产生的间充质组织量较大，因此所需合并的胚胎数量较少。染色质免疫沉淀（ChIP）实验中，10 mg面部外胚层经超声处理后获得的基因组DNA产量约为80 μg。每10 mg面部外胚层的总RNA产量约...

<table><tbody><tr><td>Dispase II（中性蛋白酶，II 型）</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>用 HBS 配制 10 mg/ml 的 Dispase II 储存液。分装后于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎面部外胚层与中胚层的分离

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

口面裂是最常见的颅面缺陷，全球每1000名新生儿中约有1.5例1,2。口面裂的形成源于面部发育异常3。在人类和小鼠中，面部的初始生长和模式形成依赖于数个微小的组织芽体，即面部突起4,5。面部由六个主要突起发育而来：成对的额鼻突（FNP）、上颌突（MxP）和下颌突（MdP）。这些突起由间充质组织的隆起构成，其表面覆盖有上皮层。多个物种的研究表明，面部外胚层与间充质之间的信号串扰对面部形态的塑造至关重要6。然而，目前尚缺乏关于参与这些信号传递过程的基因的详细分子机制。要全面理解与发育中的面部外胚层和间充质相关的基因表达、转录因子结合以及染色质修饰，一种有效的方法是分离并鉴定这些独立的组织区室。
本文介绍一种在胚胎第10.5天（E）分离面部外胚层和间充质的方法，该时期是小鼠面部发育的关键阶段，发生于面部突起融合之前。本方法改编自我们先前用于解剖面部突起的方法7。在之前的研究中，我们采用近交系C57BL/6小鼠，因为该品系已成为遗传学、基因组学和面部形态学研究的标准8。然而，由于本实验可获取的组织量更为有限，我们改用远交系CD-1小鼠，该品系购买成本较低，饲养适应性更强，且每窝产胚数（12–18只）高于任何近交系小鼠品系8。在分离胚胎后，使用中性蛋白酶Dispase II处理整个胚胎，随后解剖出面部突起，并将面部外胚层与间充质分离。该方法可保持面部外胚层和间充质的完整性。通过本方法获得的样本可用于蛋白质检测、染色质免疫沉淀（ChIP）实验、微阵列研究以及RNA-seq等技术。

经过 Dispase II 处理后，胚胎的外胚层趋于松散。解剖后，面部突起应保持完整（图 2A）。分离得到的面部外胚层清晰，不含间充质组织（图 2B）。为评估本实验方案的有效性并检测是否存在交叉污染，我们采用逆转录 PCR 检测在前脑表达的 Zic39、外胚层特异的 cdh15 以及间充质特异的 sox1010。研究结果证实，分离得到的面部外胚层和间充质均表达了预期的基因，且无交叉污染（图 3）。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/50248/50248fig1.jpg" /> 
图1. 小鼠E10.5时期面部突起的示意图。 左侧为头部的侧面观，右侧为E10.5胚胎头部的吻端观。红色虚线表示面部突起的边界。额鼻突（FNP）、上颌突（MxP）、下颌突（MdP）。...

本文描述了一种分离胚胎面部外胚层和间充质的方案。我们首先使用Dispase II处理整个胚胎，解剖出完整的面部突起，然后分离面部外胚层和间充质。

口面部裂隙是最常见的颅面畸形，全球每1000名新生儿中约有1.5例受到影响1,2。口面部裂隙由异常的……引起

本实验的总体目标是分离小鼠胚胎的面部外胚层和间充质。首先分离出 CD1 品系 E10.5 时期的胚胎，以实现这一目标。实验的第二步是用胰蛋白酶处理完整的胚胎。第二阶段。酶处理后，分离面部突起，最后一步是仔细将面部表皮间充质与中胚层分离。分离后的面部表皮间充质和中胚层即可用于后续实验。与现有的分离面部突起并进行处理的方法相比，该技术的主要优势在于，使用DYS处理整个胚胎可同时保持面部突起和其周围组织的完整性。该方法有助于回答哺乳动物发育生物学领域中的关键问题，例如差异基因表达、表观遗传修饰以及转录因子结合如何调控面部外胚层与间充质之间的分子串扰。在胚胎发育过程中，从现在起计划四到六小时以完成组织的分离，使用70%乙醇清洁解剖区域和工具。若样品用于RNA提取，请使用RNAs away。镊子必须锋利，这一点至关重要。此外，对于RNA提取，溶液应经焦碳酸二乙酯处理。现在使用批准的方案对一只怀孕的CD1雌性小鼠实施安乐死，以收集E10.5胚胎。用70%乙醇喷洒腹部，切开腹腔。使用一套镊子拉出子宫，另一套镊子将子宫系膜从子宫上撕离。将子宫从体内取出，并对另一侧子宫角重复相同操作。在10厘米的培养皿中用预冷的PBS短暂冲洗子宫，以去除血液。将子宫转移至另一含有预冷PBS的新培养皿中。通过在着床部位之间切割，将其分离成单个胚胎片段。然后在体视显微镜下，将一个胚胎转移至冰冷的PBS中。从其中一个切割部位开始操作。使用精细镊子撕开子宫的肌层，以暴露带有卵黄囊的胚胎。然后剥离卵黄囊和羊膜。将解剖好的胚胎转移至含有冰上预冷 PBS 的 6 厘米培养皿中，并重复此操作直至收集完所有胚胎。在用消化酶处理胚胎之前，先在6厘米的培养皿中用预冷的PBS洗涤胚胎。随后，将PBS替换为10毫升用PBS稀释的预冷消化酶溶液。盖上培养皿，在37摄氏度下孵育约25分钟。根据第二阶段酶解的酶活性调整时间，时间长短可能有所不同，需在体视显微镜下观察消化情况，并检查真皮层是否已变得疏松。当该组织层与下方的肌层之间出现明显间隙时，即为典型特征。如果组织仍未松解，需将组织再孵育5分钟。消化完成后，将样品置于冰上。从此步骤开始保持样品低温，仅在使用dys处理后的解剖步骤期间除外。第二阶段，面部真皮易于剥离。使用一次性玻璃移液管在体视显微镜下将经处理的胚胎转移至盛有冰上预冷 PBS 的 6 厘米培养皿中。用镊子夹住胚胎，并使用镊子仔细剪切面部突起与头部相连的边界。注意避免其他外胚层组织的污染，丢弃或可能被污染的组织，以完整分离出面部突起。从一侧开始解剖。首先解剖上颌神经支（MNP）下方区域，然后继续解剖上颌突（MXP）和额鼻突（FNP）。如有需要，从另一侧重复此过程，以完成分离。在三倍放大镜下，将三个面部突起及其下方所有组织分离并单独游离出来。尽快将面部表皮和间充质分开。首先，使用一根长玻璃巴氏吸管轻轻上下吹打面部

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生物学

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