Name: 监测树突状细胞迁移 19 F / 1 H磁共振成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学习使用氟磁共振成像技术追踪树突状细胞迁移至淋巴结的方法。该技术利用富含氟的纳米颗粒标记小鼠骨髓来源的树突状细胞，实现无创、高选择性的免疫细胞动态监测，为免疫学研究提供重要工具。

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本研究由德国研究基金会（DFG WA 2804）向 S.W. 提供资助，以及由柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心与夏里特医学院合作共建的实验与临床研究中心向 S.W. 提供的大学资助。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。我们感谢罗伯特·韦斯特法尔先生（Mr. Robert Westphal）在本实验室实习期间提供的技术支持。

所有动物实验操作必须在实施前获得当地机构动物福利委员会的批准。在进行磁共振测量期间，充分的麻醉水平以及生理监测（体温、呼吸频率）是必不可少的要求。
1. 小鼠骨髓来源树突状细胞的制备
<ol>
	<li>从C57BL/6小鼠中提取骨髓细胞，方法如前所述 12. 该方案可追溯至1992年 13 最初由拉尔夫·M·斯坦曼（Ralph M. Steinman，1943–2011）团队描述，他也是树突状细胞的发现者 14.</li>
	<li>简而言之，在处死小鼠后立即取出胫骨和腓骨。在超净工作台内操作（以防止微生物污染），用洗涤培养基（含5% FBS、1%青霉素/链霉素和1% HEPES的RPMI培养基）将骨髓冲洗至小型培养皿中。 12.</li>
	<li>将细胞悬液通过细胞滤器（100 μm孔径，尼龙材质）转移至无菌的50 ml离心管中，以去除骨组织和残留的组织。经过数次洗涤步骤和一步裂解处理后 12，使用台盼蓝和血细胞计数板计数活细胞 血细胞计数板</li>
	<li>重悬骨髓细胞 浓度为 400,000 个细胞/ml-1 在培养基中（RPMI 培养基，添加 10% FBS、1% 青霉素/链霉素、1% HEPES 和 1% L-谷氨酰胺，含 75 ng/ml-1 小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（mGM-CSF）的获取，来源于转染了小鼠基因的293FT HEK细胞上清液 GMCSF 质粒。转移10 ml细胞悬液（4 x 106 细胞置于培养皿（100 mm × 20 mm）中，并在CO₂培养箱中孵育2 培养箱（37 °C，5% CO₂）2。第3天，用10 ml新鲜培养基替换旧培养基（维持mGM-CSF的终浓度为75 ng/ml）。-1第6天，移除10 ml旧培养基，并补充10 ml新鲜培养基（mGM-CSF终浓度 = 75 ng/ml）-1第8天，移除10 ml旧培养基，并补充10 ml新鲜培养基（mGM-CSF终浓度 = 150 ng/ml）-1).</li>
	<li>第10天，用1 μg/ml的试剂成熟化已分化的DC-1 脂多糖（LPS）处理24小时。</li>
</ol>
2. 使用富含19F的颗粒标记树突状细胞
<ol>
	<li>在24小时成熟步骤（1.5）期间，用1 mM富含氟的全氟-15-冠-5-醚（PFCE）颗粒（500–560 nm）对DC进行标记，同样持续24小时。通过在Pluronic F-68中乳化PFCE（总体积2.5 ml），使用细胞破碎用钛合金超声探头，并采用连续脉冲程序（振幅100%，功率=250 W）处理60秒，制备大尺寸氟标记颗粒。</li>
	<li>完成上述孵育步骤后，使用组织培养细胞刮刀收集成熟且经氟标记的DC，转移至50 ml离心管中，在室温下以500 × g离心5分钟。</li>
	<li>为洗去残留颗粒和死亡细胞，将收集的细胞置于聚-L-赖氨酸包被的培养皿中使其贴壁。为此步骤做准备时，先将培养皿用聚-L-赖氨酸（1 mg ml-1）在37 °C孵育1小时，随后用PBS洗去未结合的聚-L-赖氨酸。</li>
	<li>将上述收集的细胞接种于聚-L-赖氨酸包被的培养板中，在无血清培养基中孵育，使细胞贴壁（37 °C，1小时，5% CO2）。</li>
	<li>吸去培养基以去除未贴壁细胞、残留颗粒及死亡细胞，并用预热（37 °C）的PBS洗涤三次。</li>
	<li>通过胰蛋白酶-EDTA处理（0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 °C孵育3分钟）收集贴壁细胞。</li>
	<li>再经过一次洗涤离心步骤后，将所需数量的成熟DC重悬于无菌无血清PBS中。</li>
	<li>为确定细胞是否成功标记，建议使用流式细胞术（FACS）检测细胞的理化特性。侧向散射（SSC）应显示这些细胞的颗粒度增加，如先前所述11。还需注意，成纤维细胞可能污染DC培养物，并可能同时摄取19F颗粒。因此，在进行体内应用前，应评估DC纯度（通过FACS检测CD11c+CD11b+细胞百分比）。</li>
</ol>
3. 体内应用19F标记的树突状细胞
<ol>
	<li>给予DC（106 - 107)以50-100 μl体积，通过将C57BL/6小鼠置于固定装置中，用26½ G针头小心插入皮肤表层后，皮内注射至后肢（使用0.5 ml结核菌素注射器，配固定针头，以最小化死体积）。为确保正确的皮内注射，针头插入部分应部分可见于皮肤下方。若针头完全不可见，则表明已插入过深。对于缺乏经验的操作者，可在麻醉状态下进行皮内注射。</li>
	<li>对肢体进行成像 体内 氟（19F) / 质子 (1H) 注射后21小时进行MRI（见下一节）。</li>
</ol>
4. 体内 19F/1H 磁共振成像
有关设置磁共振扫描的详细说明，参考了使用控制软件 Paravision（版本 5.1）的布鲁克（Bruker）磁共振扫描仪。涉及厂商特定功能和项目的名称已用斜体标出。对于其他磁共振扫描仪，这些步骤可能需要根据制造商的指南进行相应调整。
<ol>
	<li>安排使用专用的小动物磁共振成像仪。为获得足够的图像质量，系统应具备9.4特斯拉或更高的磁场强度，并配备专用的射频线圈（例如 1H/19建议使用F双调谐容积射频线圈（内径35 mm，长度50 mm；Rapid Biomed，德国维尔茨堡）。</li>
	<li>在进行 MRI 之前，准备好用于麻醉和生理监测的 MRI 扫描仪装置。确保动物床/固定装置的呼吸面罩已连接至异氟烷系统，并且温度探头和呼吸垫已连接至远程动物监测系统例如 Model 1025，SA Instruments Inc.，纽约，美国）。后者用于监测动物的生理参数，如体温和呼吸。</li>
	<li>使用与异氟烷系统相连的小鼠麻醉舱，通过吸入麻醉法对小鼠进行麻醉。调节空气和氧气的流速2 0.2 L min⁻¹-1 和 0.1 L min-1分别调节为3%的异氟烷（通过蒸发器调节）持续约2分钟，直至达到所需的麻醉深度（夹趾无反应）。最佳气流速率可能因实验装置不同而有所差异。需注意高流速可能导致动物脱水。如上所述，必须始终密切监测动物的状况。</li>
	<li>将小鼠俯卧位放置于小动物磁共振扫描仪的鼠床/固定装置上（图1).</li>
	<li>在保持空气和O₂的流速不变的同时2 保持恒定，调节异氟烷挥发罐至0.8–1.5%，直至达到最佳呼吸模式。建议呼吸频率为每分钟50–70次。</li>
	<li>实验过程中，使用循环温水（或温热空气）系统将体温维持在36–37 °C。</li>
	<li>测量过程中使用无菌眼用润滑软膏保持小鼠眼睛湿润。</li>
	<li>将动物固定在成像支架上并连接监测系统后，将支架移至 1H/19F射频线圈（位于动物扫描仪磁体的等中心位置）。</li>
	<li>将小鼠放置于磁体等中心位置，可采用自动化方法实现例如 使用定位激光结合电机驱动的动物固定装置，或通过手动计算固定装置需移入磁体以到达等中心的位置距离。</li>
	<li>用于确认动物在扫描仪中的正确位置以及后续图像切片几何形状的规划（即 大小、位置和空间旋转），使用快速低分辨率成像方法获取三个标准方向（轴向、冠状向、矢状向）的定位像例如：TriPilot 方案（采用FLASH脉冲序列）</li>
	<li>调节射频线圈至 1H共振频率（例如 400.1 MHz（对应9.4 T）以及 19F 共振频率 (例如 376.3 MHz（对应9.4 T）并使用动物磁共振扫描仪的调谐监测功能将线圈的特征阻抗匹配至50欧姆。调谐与阻抗匹配对于实现最佳的信号发射与接收条件至关重要。</li>
	<li>执行必要的自动系统设置，包括匀场，以优化磁场的均匀性（例如：ADJ_SHIM），系统频率调节用于将射频调谐至小鼠的拉莫尔频率（例如，ADJ_SF）以及参考增益来调节射频（RF）幅度（例如，ADJ_REFG）。所有这些设置对于生成静态和可变磁场（B0，B1尽可能使感兴趣区域内的信号均匀一致。</li>
	<li>获取第二组定位像（方法同上），沿三个正交方向扫描，调整视野（FOV）使双侧下肢从骨盆至足部均可见（LxWxH = 50x25x25 mm）。这些图像用于规划最终三维扫描的方位。 1H/19F扫描。</li>
	<li>建立TurboRARE 3D序列方案 1H-scan：TR/TE = 1,500/53 毫秒，FOV = 50×25×25 毫米，矩阵 = 400×200×200，RARE 因子 = 16（扫描时间约 60 分钟）。借助定位图像调整 FOV，启动扫描交通信号灯).</li>
	<li>加载单脉冲FID序列，TR至少为1,000毫秒。打开 编辑扫描 并设定细胞核为 19F. 通过取消选择自动参考增益来使用手动增益设置 编辑方法 的 工具箱.</li>
	<li>使用实时显示 MR 信号的模式开始测量，但不记录数据 GSP （进行设置）。如果 19若采集窗口内的F谱信号过低，可增加累加次数 编辑方法 和/或调节脉冲衰减器（TX0 或 SP0 滑块，直到信号清晰可见。调节基础频率以使信号居中 19采集窗口中 0 Hz 处的 F 谱峰 应用基本频率 并按压 停止请注意，用作麻醉剂的异氟烷可能会产生背景信号。在9.4特斯拉磁共振成像中，异氟烷的化学位移与 19含F颗粒与异氟烷之间的频率差约为1,800 Hz。确保激发带宽小于3,600 Hz，以避免同时激发异氟烷和含F颗粒 19F标记的细胞或颗粒。应正确设置由信号产生的基本频率 19F标记的细胞。或者，实验人员可根据需要选用其他麻醉方法。</li>
	<li>克隆（复制）先前的 TurboRARE 3D 方案 1H扫描。前往 编辑方法 并取消选择自动参考增益（如上所述）。设置 19F 原子核来自 编辑扫描将矩阵改为128×64×64，RARE因子至少设为40（最高可达64）。当TR/TE为1,000/6毫秒且累加次数为64时，扫描时间约为70分钟。将接收增益设为101（工具箱）并使用以下设置开始扫描，无需进一步调整 GOP （go 流程）</li>
	<li>扫描完成后，将小鼠固定器从磁共振扫描仪中撤出。小心地将小鼠从固定器上取下。如果小鼠未被处死用于 离体 分析例如 在磁共振测量结束后立即进行组织学或光谱学分析（详见下文），并密切监测小鼠直至其完全从麻醉中恢复。由于麻醉会影响体温调节，在恢复期间应将小鼠置于单独的笼子中，并将笼子放在温度可控的加热垫上。待小鼠完全恢复后，将其放回饲养笼并送回动物房。</li>
	<li>叠加 19F 图像到 1H 图像，请使用 查看菜单 同一软件中的选项Paravision）。 底层 功能可在以下位置找到 相关性保存底层图像，加载新图像并突出显示 19F层通过定义新颜色来自 查找表. 以区分两者 19F 和 1H 扫描，调整所选颜色的阈值（裁剪查找表，使得 19F 信号将呈现所选颜色，而背景 1H 图像将保持为灰度图像。其他后期处理程序（例如 ImageJ）可用于创建 1H/19F 图像叠加。</li>
	<li>应 体内 定量分析 19若需要F信号，按照先前所述的简单定量方案进行 15,16简而言之，可通过在视野（FOV）内靠近小鼠的位置放置一支已知浓度的PFCE乳剂参考管来进行定量。获取MR图像后，对参考管和目标区域的信号强度进行定量分析。 19使用感兴趣区域（ROI）分析F信号，并与之比较 体外 标准曲线，如图所示 图2.</li>
</ol>
5. 淋巴结磁共振波谱分析（MRS）
<ol>
	<li>小鼠安乐死后，取出腘窝淋巴结，置于一个小型5 mm核磁共振管中，并加入100 μl的2%多聚甲醛（PFA）。</li>
	<li>安装一个 19F谱仪线圈（例如 一个环形线圈，其开口至少为5 mm，用于固定装有淋巴结的核磁共振管。</li>
	<li>将核磁共振管放入线圈中，并将线圈移至磁体的等中心位置。</li>
	<li>调节射频线圈至 19F共振频率例如 376.3 MHz（对应9.4 T）并使用动物磁共振扫描仪的调谐监测功能将线圈的特征阻抗匹配至50欧姆。调谐与阻抗匹配对于实现最佳的信号发射与接收条件至关重要。</li>
	<li>设置所有匀场参数 匀场工具箱 设为0并点击应用。通常情况下无需应用匀场方法，因为样品体积相对较小。如果信号强度足够 19F信号可用时，可按照上述方法自动进行匀场、系统频率和接收增益调节。</li>
	<li>加载一个单脉冲FID序列，TR至少为1,000毫秒。打开 编辑扫描 并将细胞核设定为 19F. 通过取消选择自动参考增益来使用手动增益设置 编辑方法 的 工具箱将平均次数设置为1。</li>
	<li>使用以下步骤开始序列 GSP。如果 19如果采集窗口内的 F 光谱信号过低，可增加累加次数 编辑方法 和/或调节脉冲衰减器（TX0 或 SP0 滑动滑块直至信号清晰可见。调节基频，使信号达到最佳状态。 19F谱峰位于采集窗口中心0 Hz处，并施加基本频率。再次调整脉冲衰减器以最大化信号，达到90°激发。当信号达到最大值时，按下 停止.</li>
	<li>设置平均值 编辑方法 64 到 256（或根据信号情况必要时更多）并开始采集 GOP检测到的信号与平均次数呈线性相关。在进行定量时需注意，检测到的信号必须归一化至单次平均。此外，还需使用已知浓度的校准标准品或标准曲线，才能从归一化后的信号计算出细胞数量。 19F信号（图2).</li>
	<li>扫描完成后，取出样品，放入下一个样品，并继续执行步骤 5.3。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

这种采用的方法 19F/1利用氢质子磁共振成像（¹H MRI）追踪树突状细胞（DC）进入淋巴结的迁移过程，为研究免疫细胞的迁移模式提供了可能 在体树突状细胞是能够快速迁移的免疫细胞的典型代表，它们可在三维结构中灵活移动，而无需紧密黏附于特定基质。 17. 尽管空间分辨率较低（&mu;该技术的空间分辨率（微米级）无法与多光子显微镜所能达到的高分辨率（纳米级）相媲美，但利用该技术仍可研究细胞迁移的性质。 体内 并且在更长的时间范围内，显微镜的穿透深度有限，视野范围也受限，因此目前不适合对活体生物内的大范围区域进行成像。
由于该技术具有非侵入性，因此可以在研究后不处死小鼠的情况下连续数天监测免疫细胞的迁移。该技术的另一个优势在于，可以将捕获迁移细胞的19F图像与解剖结构的1H扫描图像叠加，从而准确定位活体生物体内细胞的位置。该技术将使我们能够研究树突状细胞（DC）迁移背后的分子机制。与典型的体外（in vitro）迁移实验不同...

细胞追踪 体内 是生物医学多个领域中的一个关键方面。为此，能够随时间推移选择性定位细胞的非侵入性成像技术具有极高价值。在三维磁共振成像（MRI）发展之前，免疫细胞迁移的追踪仅限于显微镜分析或组织活检。近年来，借助MRI进行细胞追踪受到了广泛关注，不仅在研究免疫细胞行为的免疫学家当中，而且在临床前与临床研究中均展现出重要应用前景。 体内，也适用于临床和干细胞研究人员。在20世纪90年代中期，关于氧化铁纳米颗粒的首批研究 1 引发了一系列利用MRI追踪细胞的发展。氧化铁颗粒可缩短标记细胞的磁共振弛豫时间（T2*），从而导致磁共振图像中的信号减弱。氧化铁颗粒已被用于标记巨噬细胞。 2少突胶质细胞前体细胞 3 以及其他多种细胞类型。其中一些颗粒已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的临床批准，用于黑色素瘤患者细胞疫苗的标记 4。由于 体内 或 离体 使用氧化铁颗粒对细胞进行标记依赖于T2*信号的缩短，而后者也可能由其他因素引起 在体 由于磁敏感性相关的T2*效应（如微出血、铁沉积或气泡），可能难以识别标记的细胞 体内 来自其他背景的T2*信号衰减 5.
本文中，我们介绍一种用于追踪树突状细胞（DC）的技术 体内 通过采用 19F/1氢磁共振成像（MRI）。这种细胞追踪技术直到2005年才被引入 6，首次被认可的应用几年后 19F在MRI中已有报道 7一个重要的优势是 19铁氧化物颗粒细胞标记的缺点之一是其在生物学中的发生率较低 19F 在组织中；这使得能够以基本无背景干扰的图像非常特异性地追踪细胞。此外，还可以进行叠加 19将移植的标记细胞的 F MRI 信号与常规 1H MRI 获取的解剖图像进行融合。 19F/1氢质子磁共振成像因此在细胞迁移研究中具有重要相关性 体内使用该方法研究的细胞会被标记 19富氟颗粒。通常使用主要由碳和氟原子组成的合成全氟碳化合物（PFCs）来制备此类颗粒。这些化合物不溶于水，应用前需进行乳化处理。 体外 或 体内通常其他研究团队所使用的PFC颗粒的大小 体内 19F-MRI 追踪实验的范围在 100 nm 至 245 nm 之间 6,8-10然而，我们已证明，树突状细胞标记全氟-15-冠-5-醚（PFCE）颗粒的效率随颗粒尺寸增大而提高（&gt;560 nm11

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>Charles River, Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>Biochrom AG</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>全氟-15-冠-5醚</td><td>ChemPur</td><td>391-1996</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（35 × 10 mm）</td><td>VWR, Germany</td><td>391-1996</td><td></td></tr><tr><td>27 &amp;frac12; G 注射器</td><td>VWR, Germany</td><td>612-0151</td><td></td></tr><tr><td>尼龙细胞筛（100 &amp;mu;m 孔径）</td><td>VWR, Germany</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>NMR 管</td><td>VWR, Germany</td><td>634-0461</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>解剖工具</td><td>FST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小动物磁共振系统</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td>9.4T BioSpec 94/20 USR，ParaVision 采集与处理软件</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H/&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;F 双调谐体积射频线圈</td><td>Rapid Biomed, W&amp;#252;rzburg, Germany</td><td></td><td>内径 35 mm，长度 50 mm</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;F 波谱线圈</td><td>自制</td><td></td><td>调谐/匹配环形线圈，4 圈，内径 5 mm，长度 10 mm，两个电容用于调谐和匹配</td></tr><tr><td>异氟烷吸入系统</td><td>F&amp;#246;hr Medical Instruments GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>动物监测系统 Model 1025</td><td>SA Instruments Inc., New York, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

监测树突状细胞迁移的19f / 1h磁共振成像方法

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

无创成像技术的持续进步，如磁共振成像（MRI），极大提升了我们研究活体生物生理或病理过程的能力。MRI 也被证实是追踪移植细胞的一种有效工具 体内最初的细胞标记策略在磁共振成像（MRI）中利用了影响MR弛豫时间（T1、T2、T2*）的对比剂，使标记细胞所在区域产生信号增强（T1）或信号减弱（T2*）。超小氧化铁颗粒（USPIO）等T2*增强剂已被用于研究细胞迁移，其中一些已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床。T2*对比剂的一个缺点是难以将标记细胞引起的信号衰减与血凝块、微出血或气泡等其他伪影区分开来。本文介绍一种新兴的细胞示踪技术 体内 基于使用氟对细胞进行标记19富含F的颗粒。这些颗粒通过乳化全氟碳化合物（PFC）制备而成，可用于标记细胞，随后可通过成像技术进行观察。 19f MRI。全氟化碳在细胞追踪中的重要优势 体内 包括（i）无碳键合 19F 体内，从而获得无背景干扰的图像和完全的细胞选择性，以及（ii）通过量化细胞信号的可能性 19F核磁共振波谱学

皮内给药后18至21小时 19F标记的树突状细胞（DC）迁移至引流腘窝淋巴结。通过将图像叠加，可以观察到DC经淋巴管迁移至引流腘窝淋巴结的过程。 1H解剖图像与 19F DC 图像（图2A）。我们先前已报道过这些细胞的迁移 体内以及对……的影响 19F颗粒大小对树突状细胞免疫生物学的影响，包括摄取效率 11为了定量分析树突状细胞向淋巴结迁移的程度，我们分离引流淋巴结并进行后续操作 19F MRS (图2B）。当我们比较时 19每个淋巴结获得的F信号 19使用相同PFCE颗粒标记的不同数量DC所获得的F信号（校准曲线， 图2C) 我们可以推断出数量 19F标记的DC到达引流淋巴结。在所示的代表性实验中 图2A 和 2B，我们可以推断出 3.6 x 10<sup...

近年来，利用磁共振成像（MRI）进行细胞示踪受到了广泛关注。本实验方案描述了使用富含氟（19F）的颗粒对树突状细胞进行标记、将标记后的细胞体内应用，以及通过19F/1H MRI和19F磁共振波谱（MRS）监测这些细胞迁移至引流淋巴结的程度。

监测树突状细胞迁移的19F / 1H磁共振成像方法

无创成像技术的持续进步，如磁共振成像（MRI），已显著提升了我们研究……的能力

以下实验的总体目标是通过非侵入性的氟磁共振成像（fluorine magnetic resonance imaging）或 MRI 结合常规质子 MRI，可视化树突状细胞向引流淋巴结的迁移过程。该目标首先通过制备小鼠骨髓来源的树突状细胞，并用富含氟的颗粒标记完全分化的细胞来实现。在第二步中，将标记了氟的细胞经皮内注射至小鼠后肢，以确保注射的细胞能够高效地发生跨膜迁移。接下来，通过氟-19和氢-1质子磁共振成像对感兴趣的解剖区域进行成像，以监测树突状细胞从皮肤向引流淋巴结的迁移过程。最终，可通过氟-19磁共振成像可视化树突状细胞从施用部位向引流淋巴结的迁移。该方法相较于其他细胞追踪技术（如依赖氧化铁纳米颗粒的技术）的主要优势在于，所有生物体内几乎不存在与碳结合的氟元素。这能够获得完全无背景干扰的图像，并在体内应用氟标记细胞后实现完全的细胞选择性。该方法有助于回答免疫学领域中的问题，例如分子候选物对树突状细胞在体内迁移的影响。演示该方法的是本实验室的技术员尤利娅·科夫斯基（Yulia Kovski）和高级科学家赫尔玛·维尔斯（Helma VIIs），实验时间为骨髓来源树突状细胞培养的第10天。用LPS激活树突状细胞24小时。在此期间，同时使用1毫摩尔富氟的全氟-15-冠-5醚颗粒对树突状细胞进行标记。为确认树突状细胞已成功标记，需通过流式细胞术检测细胞的理化特性。氟标记的细胞在此前向散射和侧向散射图中显示为红色事件，未标记的细胞则显示为蓝色事件。下一步，将一只C57黑鼠六号小鼠置于固定器中，然后用0.5毫升结核菌素注射器（配备26½号针头）吸取50至100微升体积的荧光标记树突状细胞。现在，小心地将针头插入动物每条后肢皮肤的上层，以接种细胞。麻醉小鼠后，将其腹侧朝下置于小动物磁共振扫描仪的鼠床中。将动物固定在成像支架上并连接监测系统后，将支架移至质子/氟射频线圈中心，以确认动物和扫描仪的正确位置，并为后续规划图像切片几何形状做准备。使用磁共振扫描仪软件中的快速、低分辨率成像方法，获取三个标准方向的定位像。将射频线圈调节至质子共振频率和氟共振频率。使用动物磁共振扫描仪的调谐监测器，将线圈的特征阻抗匹配至50欧姆。接着，设置必要的自动系统参数，包括匀场以微调磁场的均匀性，进行频率调节以将射频调谐至磁共振系统中质子的特定LA频率，并设置参考增益。为了调整射频幅度，为质子扫描设置一个 turbo rare 3D 序列，使用 1500 毫秒的 TR 和 53 毫秒的 TE，矩阵为 400 × 200 × 200，rare 因子为 16。借助定位图像调整视野。然后开始扫描。加载一个单脉冲FID序列，TR至少为1000毫秒，然后打开编辑扫描，在工具箱的编辑方法中将核设置为氟。使用go setup取消选择自动参考增益。开始测量但不记录数据，以实时显示MR信号。将基础频率调整至使氟谱峰在采集窗口中居中于零赫兹。然后选择并应用基础频率，立即按下停止。从先前的质子扫描中克隆 turbo rare 3D 序列。进入编辑方法，然后取消选择自动参考增益，如同在编辑扫描中刚刚所示。设置氟核，然后将矩阵更改为 1 28 × 64 × 64，将稀疏因子至少设置为 40。扫描完成后，将小鼠固定器从磁共振扫描仪中撤出，并使用视图菜单将氟图像叠加到质子图像上。处死小鼠后，取出目标腘窝淋巴结，并将其放入含有 100 微升 2% PFA 的 5 毫米核磁共振管中。接着，将试管放入氟谱线圈内，并将线圈移至磁体的 ISO 中心。将射频线圈调节至氟共振频率，然后在动物磁共振扫描仪的调谐监视器上，通过匀场工具箱将线圈的特性阻抗匹配至 50 欧姆。将所有匀场参数设置为零并点击应用。然后加载一个重复时间（TR）至少为 1000 毫秒的单脉冲自由感应衰减（FID）序列。打开编辑扫描界面，将核设置为氟核。现在使用 go setup 启动序列，调节基本频率，使氟谱峰位于零赫兹处的采集窗口中心，并应用基本频率。然后再次调节脉冲衰减器，以最大化信号，达到 90 度激发。当信号达到最大值时，按下停止。最后，在编辑方法中，根据信号将平均值设置在 64 至 256 之间，然后使用 go 流程。在皮内注射后 18 至 21 小时开始采集。氟标记的树突状细胞会迁移至引流的腹股沟淋巴结。通过将质子解剖图像与氟标记的树突状细胞图像叠加，可以观察到树突状细胞经由淋巴管迁移至引流淋巴结的过程。在图像中，氟标记的树突状细胞以红色显示为氟磁共振信号，而淋巴结和淋巴管则在质子解剖磁共振图像中以灰度显示。为了定量分析树突状细胞迁移至引流淋巴结的程度，可分离淋巴结并进行氟磁共振波谱分析（MRS），如前所示：将每个淋巴结获得的氟信号与用不同数量的全氟-15-冠-5醚颗粒标记的树突状细胞所产生的氟信号进行比较，依据此校准曲线，即可推算出在该代表性实验中到达引流淋巴结的氟标记树突状细胞数量。据估算，有7.5×10⁴个未负载抗原的树突状细胞到达左侧淋巴结，而有3.6×10⁵个负载抗原的树突状细胞到达右侧淋巴结。该方法不仅有助于揭示正常条件下免疫细胞迁移的分子机制，还可应用于自身免疫性疾病等动物模型的研究。此外，该技术的应用前景还延伸至癌症治疗领域。任何已确定的分子靶点均可用于调控树突状细胞以进行肿瘤治疗。

monitoring-dendritic-cell-migration-using-19f-1h-magnetic-resonance

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

监测树突状细胞迁移<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H磁共振成像

用于评估纳米颗粒在细胞内生物分布的生物成像方法，适用于纳米制剂化合物的治疗和诊断监测。通过组织学共定位分析，本文所述方法具有高灵敏度和特异性。这些方法为从啮齿类动物到人类的应用提供了转化路径。...

用于诊断与治疗监测的纳米材料注册生物成像

树突状细胞摄取抗原后迁移至免疫器官，将加工后的抗原呈递给T细胞。量子点纳米晶体标记可提供持久且稳定的荧光信号，从而可通过荧光显微镜追踪树突状细胞在不同器官中的分布。...

小鼠骨髓来源树突状细胞的制备及其使用Qdot纳米晶体的标记用于示踪研究

我们描述了一种在小鼠模型中使用MRI进行体内细胞示踪的通用方案，其中细胞经过体外标记。本文包括典型的细胞标记、图像采集、处理与定量分析流程。...

in vivo 19F MRI 细胞示踪

本文描述了一种在二维受限微环境中定量研究细胞自发迁移的方法。该方法利用微加工通道，可在单次实验中于不同条件下研究大量细胞的迁移行为。...

微加工通道中细胞迁移的研究

单核细胞是先天免疫的关键调节因子，在外周单核吞噬细胞系统的更新以及炎症发生时发挥重要作用。本文描述了对小鼠颅骨骨髓进行实时成像以研究单核细胞动员机制的实验步骤。...

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调控效应CD4+ T细胞在炎症部位间质迁移的机制尚不明确。我们提出一种非侵入性方法，用于可视化观察并操控 体外-引发的CD4 T细胞在炎症耳部真皮中的动态行为研究 原位.

成像炎症真皮中CD4 T细胞的间质迁移

用于定量评估淋巴细胞趋化性和迁移性的实验方案是免疫学研究中的重要工具。此处，一个 体外 该方案可实现对细胞迁移进行实时、多重评估，以及一种互补的 体内...

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通过鼻内递送后利用磁共振成像追踪超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在创伤性脑损伤小鼠模型中的分布

本文详细介绍了对一种人源特异性抗CD19单克隆抗体进行放射性标记的方法，以及如何利用该标记抗体在多发性硬化小鼠模型中定量中枢神经系统及外周组织中的B细胞 体内 PET成像， 离体...

使用正电子发射断层扫描在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中成像 CD19+ B 细胞

活体显微镜的发现向临床转化面临的主要挑战是其对组织的穿透深度较浅。本文介绍了一种小鼠背部窗口腔模型，该模型可实现活体显微镜与临床适用的成像方式（如CT、MRI）的共同配准，从而进行直接的空间关联分析，有望加速活体显微镜发现成果的临床转化。...

用于转化癌症研究中活体显微成像与磁共振成像联合应用的背侧皮肤折叠窗室肿瘤小鼠模型

细胞治疗通过使用祖细胞修复受损组织并改善肺功能，为肺纤维化提供了一种有前景的干预手段。由于影像学在追踪细胞整合过程中发挥关键作用，本文描述了一种磁性粒子成像引导的 体内...

影像引导 体内 利用磁性粒子成像技术追踪移植的远端肺上皮前体细胞治疗肺纤维化

学习使用氟磁共振成像技术追踪树突状细胞迁移至淋巴结的方法。该技术利用富含氟的纳米颗粒标记小鼠骨髓来源的树突状细胞，实现无创、高选择性的免疫细胞动态监测，为免疫学研究提供重要工具。

监测树突状细胞迁移的¹⁹F / ¹H磁共振成像方法

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