Name: 复用的恒化器阵列的设计与应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 40 s
Description: 了解复用恒化器阵列的构建与应用方法，用于酵母实验进化研究。该低成本系统支持基因组功能分析，可同时运行多达32个培养单元，为长期培养提供高效解决方案。

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本视频的制作得到了美国国立卫生研究院下属的国立研究资源中心（资助号：5P41RR011823-17）和普通医学科学研究所（资助号：8 P41 GM103533-17）的资助支持。本研究还获得了美国国家科学基金会（NSF）资助（资助号：1120425）。MJD 是丽塔·艾伦基金会学者。AWM 的部分资助来自美国国立卫生研究院 T32 HG00035 项目。我们感谢 Anna Sunshine 在优化实验方案方面提供的帮助。此外，我们感谢 Sara DiRienzi、Celia Payen 和 Amy Sirr 作为 ministats 工具的早期使用者所给予的支持。

在整个实验过程中应采用适当的无菌操作技术。
1. 组装微型反应器阵列的部件并进行准备
<ol>
 <li>订购所有部件。</li>
 <li>清洗玻璃试管，并在试管上标记 20 ml 刻度线。</li>
 <li>制备带有进气口、培养基入口和废液出口的橡胶塞组件，并将其安装在已清洗的玻璃培养管顶部。</li>
 <li>准备加湿 chamber 并摆放所有无需高压灭菌的部件。</li>
 <li>使用足够长度的管路和匹配的连接件，分别制备进气、废液和培养基管路。</li>
 <li>将各类管路（进气、废液和培养基）连接至橡胶塞组件、铝箔包裹的滤器以及培养基快速接头，以准备进行高压灭菌。</li>
 <li>准备一个大容量试剂瓶，用于配制无菌恒化器培养基。</li>
 <li>通过在取样瓶中插入带两个孔的橡胶塞并安装适当接头，制备培养物取样瓶；用铝箔包裹每个滤器，以准备进行高压灭菌。</li>
 <li>将组装好的整套装置整齐地放入一个或多个高压灭菌托盘中，并对所有部件进行高压灭菌。</li>
 <li>配制恒化器培养基，并过滤至已灭菌的大容量试剂瓶中。</li>
</ol>
2. 实验设置
<ol>
 <li>向每个补水瓶中加入 700 ml ddH2O。</li>
 <li>将已灭菌的微型生物反应器放入设定好所需温度的加热块中。</li>
 <li>将通气管插入四通道歧管，并打开气泵。</li>
 <li>将流出管路连接至 100 ml 收集瓶。</li>
 <li>移除培养基管路和培养基大瓶末端的铝箔，连接两个快速接头。将每段蠕动泵管依次穿入蠕动泵盒中并卡紧到位。启动培养基泵。</li>
 <li>让反应腔室充满培养基后，关闭培养基泵。</li>
 <li>用 70% 乙醇喷洒橡皮塞组件，并使用注射器接种培养物。如需要，保存一份接种物作为甘油冻存菌种。让培养物生长 30 小时。</li>
 <li>调节流出针的高度，直至在关闭气流的情况下培养体积设定为 20 ml。此过程可能需要在一小时内进行多次调整。完成后重新打开气流。</li>
 <li>打开培养基泵。</li>
 <li>清空流出液取样瓶（其中含有设定工作培养体积期间收集的培养基），并记录时间。</li>
 <li>为获取零时点测量值，将流出管路插入无菌收集管中收集 15 分钟至 2 小时（根据 DNA 分析所需的取样体积而定）。如需要，此时也为每种培养物制备甘油冻存菌种。</li>
</ol>
3. 每日测量
<ol>
 <li>与初始时间点（time-zero）测量相同，根据实验需要将样品置于冰上孵育15分钟至2小时，并记录用于DNA分析和冻存样品的取样时间。</li>
 <li>对于RNA样品，可使用注射器和22G 5英寸针头从培养物中快速吸取少量样品，或打开每个ministat装置以收获全部培养物。样品必须迅速采集，通过过滤收集后立即在液氮中速冻。</li>
 <li>测量自上次取样以来每个ministat收集的流出液，以确定稀释速率。如需调整，可通过重新设置泵速或调节单个泵管上的微调装置来校正稀释速率。</li>
 <li>将流出液导管更换至空的收集瓶中。</li>
 <li>定量每毫升细胞数及其他感兴趣的检测指标，并制备甘油冻存菌种。</li>
</ol>
4. 实验后清理
<ol>
 <li>将所有导管分别放入不同的托盘中，并用 ddH2O 大量冲洗。使用水族泵干燥导管。</li>
 <li>用 ddH2O 清洗软木塞组件，并使用针头插入器清洁针头，交替吸液和排液以冲洗针头。擦拭针头外部及软木塞，以去除任何残留的培养基。</li>
 <li>用清水和乙醇清洗玻璃导管，并使用三团卷起的Kimwipe纸巾和镊子去除物理污染物。</li>
 <li>使用前再次冲洗并干燥所有部件。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

在微控培养系统（ministats）中进行恒化器培养时，与所有恒化器实验一样，需要注重细节并具备排除故障的能力。由于连续培养实验中污染问题尤为关键，我们通常在接种时以及长期进化实验的每50代，通过显微镜检查是否存在细菌和真菌污染。迄今为止，在超过300代的96个进化实验中，我们均未观察到污染现象（数据未显示）。为检测微控培养系统之间是否存在交叉污染，以及微生物是否可能通过流出管路定植于培养室，我们运行了16个微控培养系统，其中每隔一个系统按前述方法接种酵母，其余系统则不接种任何培养物。所有培养物的废液被收集至一个共用的废液容器中，该容器每隔一天清空一次。因此，如果污染物可能通过流出管路进入培养系统，则本实验极有可能观察到此类现象。在为期三周、超过100代的培养过程中，采用接种与未接种交替的棋盘式布局，我们未在未接种的微控培养系统培养管中观察到任何生长现象，表明在类似时长的实验中，来自外部的酵母或其他微生物污染几乎不可能发生。
尽管微型恒化器的设计旨在以类似于商用恒化器的方式运行，但这种模块化结构可根据用户的需求和预算进行优化。本方案中使用的蠕动泵可实现每小时0.0186体积至3.6体积的流速（数据未显示）。通过采用其他型号的泵，可实现对稀释速率更精确的控制。需要注意的是，在较低稀释速率下运行时，可能需要更换更粗的针头，以达到相同的液滴输送频率。种群规模是设计进化实验时需要重点考虑的因素。本实验采用的标准稀释速率和营养物浓度可维持相对较大的种群数量（约109个细胞），其数量级与已发表的进化研究相当11。通过调整工作体积或限制性营养物浓度，也可维持更大或更小的种群规模。此外，使用具有较高突变率的菌株进行实验，还可获得更高的突变供给量。
现有的微培养装置设计也有改进空间。例如，培养管壁上可能会产生冷凝水，使用较深的水浴、培养箱或恒温房间可显著减少这一现象。尽管在硫酸盐受限的培养条件下出现细胞聚集和管壁生长的情况相对较少——在300代以内的48个进化实验中仅出现5次（数据未显示）——但可选用多种表面活性剂来帮助减少或延缓这一特性。如果细胞聚集影响了培养物的充分混合，可通过减少每个空气泵所连接的分支数量，或增加搅拌装置来加强振荡。此外，还可根据其他设计的方案，加入用于检测溶解气体浓度、pH值或其他参数的额外探头。17
尽管可能存在某些改进，但在使用本方案所述的微恒化装置时，我们将该装置与已报道的大型商用恒化器数据进行比较后发现，实验参数高度一致，结果具有良好的可重复性。这包括细胞生理学特性的可重复性，例如在10至15代内达到稳态平衡（图2A），以及在平衡状态下获得相似的培养密度。基因表达模式在三个微恒化装置的生物学重复之间以及微恒化装置与商用大容量平台之间均保持一致（图2B），仅铁代谢相关基因除外。这些表达差异可能由两种装置中金属含量的不同或培养基成分质量的改进所致。我们的数据表明，微恒化装置将适用于需要稳定环境的生理学或竞争性实验。
为了检验微流控恒化器（ministat）设计是否足以满足实验进化应用的需求，我们在硫酸盐限制条件下对培养物进行了250代的长期进化，并利用比较基因组杂交（CGH）技术检测了 SUL1 位点的扩增情况——这是在大体积恒化器中长期进化的典型特征。10 我们在4个独立进化的实验中，均观察到硫酸盐限制培养基中分离的克隆菌株出现了 SUL1 基因的扩增（图2C）。综合来看，这些数据表明，微流控恒化器是一种稳健的实验平台，可能适用于多种传统的恒化器应用场景。尽管本文展示了其在培养芽殖酵母中的应用，但该系统也应适用于其他生物体，事实上，类似的设计已被用于培养细菌及其他酵母物种。16,17,25 此外，由于培养体积更小，相应减少了培养基的消耗量，微流控恒化器可能成为需要昂贵或非常规试剂（如化学筛选或遗传筛选实验中常见情况）实验的更具吸引力的替代方案。

微生物生长与进化的动态过程是微生物学、生态学、遗传学和生物技术领域的基础。培养微生物最常见的方法是分批培养，即在营养丰富的液体培养基中以较低密度接种细胞，并使其生长至饱和状态。尽管使用标准实验室设备即可简便操作，但分批培养过程中化学环境不断变化，导致细胞生理状态随之波动。这种异质性的生长环境可能引发次级生长和应激效应，从而掩盖细微的生理差异。通过连续分批传代进行的实验进化可能筛选出复杂的、与生长阶段相关的亚群混合体，使得将适应性变化与特定选择条件关联起来变得困难。由于取样时间不精确以及滞后期等特征的变异所引入的噪声，定量表型的测量也可能具有挑战性。连续培养则提供了一种替代性生长模式，可在化学均一的环境中以确定的生长速率可重复地培养细胞，使其达到生理稳态。由于具备这些优势，实验进化研究以及细胞状态的表征常采用如恒化器等连续培养系统所提供的受控环境。14
人们对这些优势的认识已重新激发了对恒化器培养的兴趣15。自1950年首次提出以来1,2，恒化器系统已发展出多种规模和应用形式，体积范围从升至微升级不等16-19。这些不同的设计，无论是商业化的生物反应器、手工吹制的玻璃装置，还是定制的微流控平台，均遵循共同的基本设计原则。培养腔室持续搅拌并通气（通常通过向其中鼓入空气），以确保微生物始终均匀分散于整个培养腔中。成分明确的新鲜培养基持续加入，其添加速率控制着微生物的生长速率，并影响培养物所处的化学环境。通过溢流口设定培养管中的培养液体积，培养物也以与新鲜培养基流入相同的速率经由溢流口被取出。通过这种方式，培养物可迅速达到生理上的稳态，此时许多生物学参数保持恒定。尽管恒化器具有诸多优势，且文献中已有多种平台的报道，但其广泛应用仍受限于系统构建与操作的困难，以及商业化设备的高昂成本。此外，关于这些装置的制作与使用方法的描述往往不够清晰。
我们提供了一种小型化恒化器阵列的设计方案及使用说明，该装置由 readily available 的部件构成，成本低廉且占用空间小。将本装置与已报道的在较大体积商用生物反应器中培养酵母的数据进行比较时，我们观察到实验参数高度一致，结果具有良好的可重复性。这包括细胞生理状态的一致性，表现为在10–15代内达到稳态平衡，并在平衡状态下获得相似的培养密度。此外，微型恒化器与商用大体积平台之间的基因表达模式也保持一致。三个重复培养之间稀释速率、光密度以及基因表达的可重复性，均体现了本平台的稳健性。我们还发现，在类似的实验进化时间尺度上，微型恒化器中出现的适应性突变与大体积恒化器中出现的突变相同。

<table><tbody><tr><td>3/32&quot; x 7/32&quot; 硅胶管</td><td>VWR</td><td>63009-260</td><td>管路：订购：(50英尺线圈包装)</td></tr><tr><td>1/2&quot; x 5/8&quot; 硅胶管（超大号）</td><td>VWR</td><td>63009-299</td><td>管路：订购：(50英尺线圈包装)</td></tr><tr><td>1/4&quot; x 3/8&quot; 硅胶管（中号）</td><td>VWR</td><td>63009-279</td><td>管路：订购：(50英尺线圈包装)</td></tr><tr><td>橙绿色Marprene泵用管</td><td>Watson-Marlow</td><td>978.0038.00+</td><td>管路：订购：6套（每包6根）</td></tr><tr><td>雌性鲁尔接头，1/8&quot; 插管</td><td>Cole Parmer</td><td>HV-45500-04</td><td>接头：订购：4套（每包25个）</td></tr><tr><td>雄性锁紧鲁尔接头，1/8&quot; 插管</td><td>Cole Parmer</td><td>HV-45503-04</td><td>接头：订购：1套（每包25个）</td></tr><tr><td>变径接头，PVDF材质，1/4&quot; 转 1/8&quot;</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-30703-50</td><td>接头：订购：1套（每包10个）</td></tr><tr><td>带插管Y型接头，内径1/8&quot;</td><td>Cole Parmer</td><td>HV-30703-92</td><td>接头：订购：3套（每包10个）</td></tr><tr><td>中号管夹</td><td>VWR</td><td>63022-405</td><td>夹具：订购：1套（每包12个）</td></tr><tr><td>Day夹（管路用金属夹）</td><td>VWR</td><td>21730-001</td><td>夹具：订购：1套（每包10个）</td></tr><tr><td>直通式带阀雄性快接接头，适配管径：1/4英寸</td><td>Fisher</td><td>05-112-39</td><td>接头：订购：1套（每包25个）</td></tr><tr><td>直通式带阀雌性快接接头，适配管径：1/4英寸内径，聚丙烯材质</td><td>Fisher</td><td>05-112-37</td><td>接头：订购：1套（每包5个）</td></tr><tr><td>静音空气泵</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.aquariumguys.com/&quot; target=&quot;_blank">Aquarium Guys.com &lt;/a&gt;</td><td>212422</td><td>气源：订购：4台泵</td></tr><tr><td>PTFE滤膜，0.45 &amp;mu;m，用于空气过滤</td><td>Cole Parmer</td><td>HV-02915-22</td><td>气源：订购：1盒（每盒100片）</td></tr><tr><td>带侧臂的1L烧瓶</td><td>Fisher</td><td>10-181F</td><td>气源：订购：2套（每包6个）</td></tr><tr><td>#8硅胶塞，孔径3/8英寸，用于带侧臂烧瓶</td><td>Fisher</td><td>K953715-0801</td><td>气源：订购：8个塞子</td></tr><tr><td>4通道歧管</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06464-85</td><td>气源：订购：8个歧管</td></tr><tr><td>55 ml 螺口培养管</td><td>Corning Life Sciences</td><td>9825-25</td><td>培养室：订购：2套（每包48根）</td></tr><tr><td>常规白色针座皮下注射针头，16G，5英寸长，用于流出管线</td><td>Fisher</td><td>14-817-105</td><td>培养室：订购：1套（每包100根）</td></tr><tr><td>脊髓穿刺针</td><td>VWR</td><td>BD40836</td><td>培养室：订购：4套（每包10根）</td></tr><tr><td>常规粉色针座皮下注射针</td><td>Fisher</td><td>14-817-104</td><td>培养室：订购：1套（每包100根）</td></tr><tr><td>泡沫硅胶塞，尺寸&quot;2&quot;，粉色</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06298-06</td><td>培养室：订购：2套（每包20个）</td></tr><tr><td>8孔试管架</td><td>VWR</td><td>82024-452</td><td>培养室：订购：4个架子</td></tr><tr><td>带底部软管出口的10L储液瓶：耐真空</td><td>VWR</td><td>89001-530</td><td>培养基：订购：2个或以上</td></tr><tr><td>黄色泡沫硅胶塞，非标尺寸12</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06298-22</td><td>培养基：订购：2个或以上</td></tr><tr><td>大瓶排气滤器</td><td>Fisher</td><td>SLFG 050 10</td><td>培养基：订购：1套（每包10个）</td></tr><tr><td>绿色电工胶带</td><td>&lt;a href=&quot;http://Amazon.com&quot; target=&quot;_blank">Amazon.com&lt;/a&gt;</td><td>10851-BA-10</td><td>培养基：订购1卷</td></tr><tr><td>瓶顶滤器，1L，0.2 &amp;mu;m，45 mm</td><td>VWR</td><td>29442-978</td><td>培养基：订购：(1箱，共12个)</td></tr><tr><td>带底部出口的5000 ml储液瓶：耐真空</td><td>VWR</td><td>89003-384</td><td>培养基：（可选）</td></tr><tr><td>蓝色泡沫硅胶塞，非标尺寸10 1/2</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06298-18</td><td>培养基：（可选）</td></tr><tr><td>205S/CA16，16通道泵</td><td>Watson-Marlow</td><td>020.3716.00A</td><td>培养基泵：订购：1台</td></tr><tr><td>16通道205CA扩展泵头</td><td>Watson-Marlow</td><td>023.1401.000</td><td>培养基泵：订购：2个扩展泵头</td></tr><tr><td>硅胶水族密封剂</td><td>Fisher</td><td>S18180B</td><td>培养基泵：订购：1瓶</td></tr><tr><td>6孔干浴器</td><td>VWR</td><td>12621-120</td><td>加热块：订购：32个微培养装置需2台，16个需1台</td></tr><tr><td>干浴器用模块，每块6 x 25 mm试管</td><td>VWR</td><td>12621-120</td><td>加热块：订购：32个微培养装置需12块，16个需6块</td></tr><tr><td>尼龙膜滤器，0.45 &amp;mu;m 孔径；直径：25 mm</td><td>Fisher</td><td>R04SP02500</td><td>收获：订购：1套（每包100片）（可选）</td></tr><tr><td>尼龙膜滤器，0.45 &amp;mu;m 孔径；45 mm</td><td>Fisher</td><td>R04SP04700</td><td>收获：订购：1套（每包100片）（可选）</td></tr><tr><td>47 mm 大型滤器装置</td><td>Fisher</td><td>XX10 047 30</td><td>收获：订购：1套（可选）</td></tr><tr><td>玻璃滤器支架，25 mm，小型滤器装置</td><td>VWR</td><td>26316-692</td><td>收获：订购：1套（可选）</td></tr><tr><td>1L液氮杜瓦瓶</td><td>VWR</td><td>63380-052</td><td>收获：订购：1个（可选）</td></tr></tbody></table>

多重恒化器阵列的设计与应用

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

恒化器是一种连续培养系统，其中细胞在严格控制、化学环境恒定的条件下生长，培养密度受特定限制性营养物质的约束。1,2 由于恒化器在稳态下提供恒定的生长速率和环境，因此其数据在定量表型测量中具有高度可重复性。基于这些原因，恒化器已成为通过基因表达分析3-6 及其他稳态平衡条件下培养特性的研究，对生理学进行精细表征的有用工具。7 恒化器中的长期实验能够揭示微生物种群在受控环境中进行适应性进化时所采取的特定进化轨迹。事实上，自恒化器发明以来，其已被广泛用于实验进化研究。8 进化实验中的一个常见结果是，每个生物学重复都会获得一组独特的突变谱型。9-13 这种多样性表明，通过更高通量的进化实验仍有大量未知内容有待发现。
本文介绍了一种相对简单且低成本的微型恒化器阵列（简称ministats）的设计与操作方法，并验证了其在酵母生理学研究及进化实验中的应用。该方法通过单个多通道蠕动泵驱动数十个恒化器运行，培养体系维持在20 ml的工作体积，适用于多种应用场景。我们希望，通过提高通量、降低成本，并提供详细的构建与操作说明，能够进一步推动本设计作为一种通用平台，在科研与工业领域用于大规模菌株、物种、生长参数以及基因或药物文库的功能表征。

如上所述及（图1A、B）所示，采用微量化恒化器阵列在硫酸盐限制条件下培养单倍体MATa出芽酵母实验室菌株（S288c），培养条件如前所述10。我们测试了该系统在常见恒化培养应用中的有效性，包括生理特性测定和实验进化研究。为验证微量化恒化器的性能，我们重复了此前在经改造用于恒化培养的工业发酵罐中进行的多项实验10,20,21。ATR Sixfors发酵罐的工作体积为300 ml，超过微量化恒化器体积的十倍以上，且在培养通气和搅拌方式上存在显著差异。我们尝试重现这些发酵罐所获得的设备稳定性、稳态生理特征、实验进化结果以及基因表达模式。
由于稀释速率和通气的均匀性是恒化器设计的重要方面，我们在32个微型恒化器经过15代生长后测量了实际的稀释速率。当目标稀释速率为0.17 vol/hr（4-5滴/分钟）时，32个重复样本的平均稀释速率为0.17208，标准差为0.0075。该范围处于我们通常可接受的±0.01 vol/hr目标偏差之内；超出此范围时，已观察到基因表达发生大规模变化。22-23 在4个微型恒化器中，测得的空气流速为307.5 ml/min，标准差为9.57 ml/min。这表明进入反应室的气流稳定，并在4个腔室之间均匀分配，其数值与工业发酵罐中通气条件所描述的值相似。20
我们先前观察到，在8次酵母硫酸盐限制条件下的进化实验中，高亲和力硫离子转运蛋白SUL1在8/8次实验中均出现重复性扩增10。鉴于在此条件下结果的一致性，我们选择硫酸盐限制条件来测试本系统的能力。恒化培养的一个必要条件是维持稳定的化学环境。限制性营养物质丰度的波动或环境中的其他变化通常会导致特定培养物中细胞数量的改变。我们以光密度作为细胞数量的替代指标（图2A），并在16个重复培养物中评估其可重复性，结果显示经过约15代生长后，平均A600为1.12（约109个细胞），标准偏差为0.057单位，即5.1%。作为对比，从4个在工业发酵罐中培养的重复样本中测得的标准偏差为2.5%。生长室中的细胞混合充分：从流出液通道采集的OD值和细胞计数与直接从培养管取样的结果相当（数据未显示）。这些结果表明，我们的平台具有良好的稳健性，能够在与工业发酵罐相近的容差范围内维持稳定的化学环境。
作为对生理状态更敏感的检测指标，我们比较了在微型生物反应器和工业发酵罐中、硫酸盐限制条件下培养的菌株全基因组稳态基因表达情况。微型生物反应器中的基因表达在三个生物学重复之间表现出高度相似性（图2B我们先前指出，对于来自两个重复Sixfors恒化器的RNA并共杂交至微阵列的结果，99%基因的表达水平差异在1.5倍范围内，因此可将1.5倍作为经验性的显著性阈值。21 三个重复微发酵罐的基因表达经两两比较显示，99%的基因变化范围在1.5至1.7倍之间，与工业发酵罐的结果相当。这三个样本分别杂交至独立的芯片，随后计算两两之间的比值，因此这些数值不仅包含生物学变异，还包含了芯片间的噪声，与已发表的共杂交结果相比，可能高估了重复样本间的变异程度。共有138个基因差异表达。 &gt;在三个迷你生物反应器（ministat）重复实验中，与来自工业发酵罐培养的匹配样本相比，基因表达量变化达1.5倍。在迷你生物反应器中表达下调的基因显著富集于铁代谢相关基因。这一特征可能反映了不同设备配置下金属成分的差异：Sixfors装置包含浸没于培养液中的金属搅拌桨和通气组件，此前使用的培养基瓶也需金属硬件。迷你生物反应器仅使用不锈钢针头，不含其他金属部件。表达上调的基因主要与细胞膜相关，但其生物学意义尚不明确。 
最后，我们在这些条件下测试了实验进化。经过250代的硫酸盐限制性生长后，来自4个独立进化的群体中检测的4/4个克隆均显示出SUL1的扩增，该结果通过阵列比较基因组杂交（CGH）检测得到（图2C）。该结果与在较大体积的恒化器中类似时间间隔内的研究发现一致。10
<img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="微生物培养示意图，包含培养基储液瓶、蠕动泵、培养室、通气装置和取样设置。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. A. 微型恒化器阵列的设计与布局。 B. 培养室的设计。
<img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="微生物生长分析：图表（A600 与世代数），基因表达热图，基因组拷贝数。" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. A. 实验数据显示，培养物在生长十代内即达到平衡状态（n=16）。B. 在硫酸盐限制条件下处于稳态时采集的三个生物学重复样本 S1-3 的基因表达数据，与在匹配的硫酸盐限制型 Sixfors 恒化器中培养的共同参照样本进行比较。C. 在硫酸盐限制环境下生长 250 代后，从微恒化器中获得的 SUL1 基因扩增情况。通过比较每个进化克隆的基因组 DNA 与祖先菌株的 DNA 进行 CGH 分析21，计算每个扩增区域的平均拷贝数，并标注于各扩增子旁。所有微阵列数据均已存入 GEO 数据库，登录号为 GSE36691。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图。</a>

我们开发并验证了一种小型化微型恒化器阵列，该装置由 readily available 的部件构成，成本低廉。其生理学及实验进化结果与较大体积的恒化器相似。该微型恒化器阵列为传统的恒化器实验、功能基因组学以及化合物筛选应用提供了一个紧凑、经济且易于获取的平台。

恒化器是一种连续培养系统，其中细胞在严格控制、化学环境恒定的条件下生长，培养物密度处于...

您好，我是Mitre a Dunham，华盛顿大学酵母资源中心的一名教授，在我的实验室中，我们致力于研究基因组进化。我们用于研究这一过程的工具之一是实验进化，即在实验室中对酵母菌株进行长期培养，进而研究其基因组如何发生变化。我们使用的设备之一是恒化器。恒化器本质上是一种培养装置，可在实验室中持续培养酵母菌株达数百代之久，历时数月，从而研究细胞的适应性变化。此处的这种止血装置是一种定制的玻璃流式止血装置，正如您所想象的，这类装置价格昂贵且占用大量空间。因此，最近在我的实验室中我们开发了微型止血装置。微型止血装置使我们能够以更低的成本和更小的空间完成与大型止血装置相同的所有操作。我的研究生 Aaron Miller 将带您了解如何构建和使用微型止血阵列。大家好，我是 Aaron Miller，来自 Dunham 实验室的一名研究生。在本系列视频中，我将向您展示如何制作和使用一组迷你恒温器。如果您有任何在这些视频中未解答的问题，请参阅迷你恒温器使用手册。迷你恒温器腔室由一根50 mil的玻璃管构成，并以硅胶封口。通过一根长的脊椎穿刺针将空气注入培养室，该针延伸至管底，提供强劲的气流。采样由第二根针控制，该针将培养物引导至收集室进行分析。此针的长度决定了工作培养体积。使用第三根更短的针头向培养室中添加培养基。该操作决定了稀释速率，并直接控制细胞生长速率。20 mil 的培养体积小到足以实现高度多重化并仍可容纳在相对较小的空间内，同时又大到足以产生足够的样品量。为了进行 DNA-RNA 和代谢物表征，需将水族箱泵中的空气泵入气体洗涤瓶中。这会将气流分散成细小气泡，使空气充分湿润，随后导入培养室。这些气泡不仅为培养基提供通气，还能使细胞保持悬浮状态，防止细胞聚集。培养基通过连接培养基储液罐与培养基输送针头的管路输送至微型恒化器中。在 minis 培养系统中，流速由多通道蠕动泵控制，该泵通过培养液管路推动培养基流动，培养液管路是培养液通道的一部分。当培养液位达到培养取样针位置时，气流产生的正压将培养物经流出通道推入培养物收集室。内部培养室的温度由外部热源调节，在本例中为加热块，但水浴或培养箱也可实现相同功能。在本视频中，我将介绍如何组装一个包含四个迷你恒化器（mini stat）的阵列。四个迷你恒化器构成其基本单元，通过重复应用本教程中的步骤，您可将该系统扩展至同一泵上运行多达32个迷你恒化器。迷你恒化器系列的第二部视频提供了在竞争性实验研究和迷你恒化器中开展进化实验的完整设计与方法，以及实验结束后清洗操作的详细说明。首先，我们将清洁并组装培养室以清洗管子。先用约10 mL的90%乙醇冲洗，再用10 mL水冲洗。为了物理去除污染物，我还取三张Kim擦拭纸擦拭管子内壁。然后我再进行最后一次清洗，以去除Kim擦拭布留下的任何绒毛。培养管在不使用时通常倒置存放。接下来，我们标记出所需培养体积的液位线。我们使用 20 mL 的培养体积。此外，标记 21 mL 和 19 mL 的体积刻度，以表示与理想起始体积的偏差。每根试管均加入 21 mL 液体，并标记每根试管的液面位置。然后移除1 mil，标记20 mil刻度，再同样操作标记19 mil刻度。在进行下一部分操作前，请戴上护目镜，并始终佩戴护目镜；操作暴露的针头时应小心谨慎。接下来，单独留出一根培养管，用于在穿刺软木塞时存放每个软木塞。使用我们迷你静音装置设计中的三根针时，该管中会充满软木屑碎片，因此在彻底牢固地清洁之前，请勿将其用于实验。将软木塞放入管中。取最长的针，即带有粉红色底衬的那根，将其针尖略微偏离软木塞中心位置插入，以便为其他针留出空间。用软木塞固定，将针头推入，使针头大致与玻璃腔室的侧面平行。该针头配有一个插入件，请妥善保存，稍后会用到。接着，取带有黄色衬垫的培养基针头，将其置于距离软木塞中心大致相同距离的位置。在软木塞圆周约三分之一处，固定软木塞并推动针头穿刺而过。最后，取带有白色衬垫的流出液针头，在剩余的空间中穿刺软木塞，使针头大致与玻璃培养室的壁面平行。仅将针头插入一半，因为这是用于设定培养液体积的针头；取出来自粉红色袋子的针头插入物，用其清理进气针和出液针。然后用镊子进入操作区域，回收任何卡在针头下方软木塞上的软木碎片。最后，将组件放入一个干净且已标记的培养管中。对全部四个培养管进行此操作。接下来，我们将组装并安放所有无需高压灭菌的部件。水化培养室至关重要，可防止蒸发。我们尝试了多种方法，发现仅通过在实验初期的批量培养阶段向10 mil厚的顶部通入气泡，即可显著减少蒸发。操作时，先用钳子将末端折断，然后从背面取出棉塞，并将其穿过单孔硅胶塞。将此部件放置在1升抽滤瓶的上方。然后安装一个适配器，并连接一段长约4厘米的大口径管路，将其固定在顶部。接着，将一个连接头插入另一段长约10厘米的大口径管路中，并将该管路连接到抽滤瓶侧面的喷嘴上。空气在加湿室中加湿后，通过一个四通歧管被分配至四个迷你恒温箱。取四段长度为4厘米的粗管，分别连接到歧管的每个接口上。接下来，将一段较长的管路连接到多通管的左侧，并将该管路的另一端连接到水合室。对于此处所示的装置，这段管路的长度为45厘米。关键在于，该管路必须足够长，以确保能够跨越多通管与水合室之间的距离，从而保证气流畅通。我们使用水族箱泵，将略高于每分钟300 µL的经过过滤和加湿的空气泵入每个腔室。连接一段足够长的细管，使其能够从泵延伸至加湿室顶部的适配器。在合理范围内调整此管的长度似乎不会影响进入腔室的流速。接下来，我们设置蠕动泵。在酵母实验中，我们使用每小时0.17体积的培养基流速，这大致对应于泵转速为7.5 RPM。可以使用泵卡匣左侧的阻塞喷嘴分别调节微调和流速。重要的是，需提前确定哪种泵速能为您的实验提供理想的稀释速率。同样，需明确加热块上的设置与您期望的温度之间的对应关系。我们使用 30 摄氏度来模拟特定培养物所处的环境。通常将空气通入充满水的腔室，以最真实地反映每个培养腔内的温度。现在，我们来组装三种用于将空气和培养基输入及输出培养腔的管路。气管将四通歧管连接到每个微型恒温腔室。确保管路长度足够完成此连接。在本演示中，我使用的管路长度为45厘米。在一端，我们放置一个空气过滤器，用于在空气进入每个培养室底部之前，作为无菌屏障对加湿空气进行过滤。在另一端，我们安装一个诱捕接头，用于将此管路连接到粉色后针。流出管路将每个培养室连接至相应的100 mL取样瓶。确保导管长度足够。本演示中，导管长度为 48 厘米。只需在一端安装一个连接器，即可使用。通过蠕动泵将无菌培养基来源的培养基经由培养基管路输送至各个培养室。确保所用管路长度足够，能够从培养基来源处连接至泵，并从泵连接至培养室。首先，取一段64厘米长的粗管，将其连接至雌性接头。快速连接。在此部件的另一端安装一个大转小接头，并将其连接到一段较长的小型软管上。接下来，我们组装一个分支系统，以实现从单一来源向多个腔室输送培养基。在此情况下，插入四根小管和快速接头至该分支管组中。接着，取每根蠕动泵管，在两侧安装适配针头，并拧紧公端鲁尔锁接头。然后将这些管路分别连接到分支管组中。然后将泵管的另一端连接到最后一组管路，本演示中这些管路的长度为42厘米。这些管路连接至最终的一组lu接头，该接头被拧入每个培养室顶部的黄色背衬培养基输送针头中。接下来，我们将组装流出液采样容器。迄今为止，我们一直使用 100 或 125 mil 的玻璃螺口瓶作为采样容器，发现瓶口添加软木塞有助于保持操作有序和无菌。我们发现，除非采取辅助措施引导培养基流入瓶中，否则软木塞可能会造成一定程度的杂乱。为此，我一直在使用如图所示剪裁过的 200 微升枪头，将其插入软木塞底部两个孔中的任意一个。接下来，将两根长四厘米的小管置于软木塞顶部，并用空气过滤器封口，以便在高压灭菌过程中进行气体交换，同时保持腔室无菌。随后，迷你装置阵列形成一个封闭系统。我们对该系统进行高压灭菌以实现灭菌，并在灭菌后至使用前期间，使用过滤器和铝箔折纸来确保无菌状态。取一小片铝箔，对折。将其覆盖在培养基管路的快速接头上，压平，并将角落向后折叠。确保折叠处紧贴管壁。为防止生物污染物进入，再次将箔纸自身折叠并捏紧封口。现在可进行高压灭菌。接下来，我们将各管路连接至每一个培养室。取培养基管路的分叉端，依次连接至软木塞组件中的每个黄色后置针头上，注意按顺序操作以避免培养基管路缠绕。接着，取四根通气管路，将其连接至软木塞组件中的粉色后置长针头上。然后取滤膜末端，用一大块铝箔纸包裹。包裹应足够紧密以防止水进入，但不可过紧，以免灭菌过程中空气无法逸出。接着，取流出管路，并在每根管路的末端安装滤膜。这些将作为临时的无菌屏障。将每根管子的另一端拧入软木塞组件上白色背衬的中等长度针头中。与之前相同，将一大片铝箔折叠在滤膜端，使空气能够逸出，但水无法进入。标记F LX管线，以便将其与通气管线区分开。每个采样室还将配备铝箔包裹，以允许空气排出并防止水进入。在高压灭菌过程中，关于小车准备的详细说明见迷你型恒温器手册，需将10升或5升的小车组装好并用铝箔包裹，以备高压灭菌。现在将包括小车在内的所有物品放入一个或多个容器中。将垃圾桶放入高压灭菌锅中，使用液体循环程序进行灭菌，灭菌时间为20分钟。该过程通常需要一个半小时才能完成。在本系列迷你统计视频的第二集中，您将学习如何开展基于竞争研究和迷你统计的进化实验，并学习实验结束后如何进行清理工作。在进行实验之前，您必须按照视频一中的演示，对微阵列的所有组件进行高压灭菌并完成组装。此外，您还需根据minis stat操作手册中的说明制备并过滤培养基，并在合适的恒化器培养基中制备过夜培养物。向每个水合室中加入700 mL的DD H₂O。取迷你统计阵列并将其放入加热块中。将通气管插入四通道歧管，并打开水族泵。移除空气过滤器，将培养物取样管迅速插入已高压灭菌的100 mL取样瓶中，并揭开封口铝箔。将管路中的培养基连接到小车。然后松开卡扣，按摩管路以排出其中的空气。启动泵。如果没有其他人使用该泵，可将其调至 90 RPM，腔室应在 0.5 小时内充满。如果已有实验正在进行，则让培养腔过夜灌注培养基。当培养液填充至约 35 毫升时，关闭培养基泵。额外的培养基可减缓在批量生长阶段的蒸发效应，以防止接种过程中发生污染。用足量的70%乙醇喷洒每个迷你恒化器培养塞组件，并静置一分钟。如有需要，可用吸水纸轻拭其侧面以去除多余的乙醇。戴上安全护目镜，使用22号针头和1毫升注射器，向迷你培养装置中接种100 µL过夜培养物。确保将接种物注入培养基中，而不仅仅注射到迷你培养装置的腔室壁上。然后让培养物生长30小时。这种分批培养阶段是建立饱和培养物的常用策略，其中在实验开始时关键限制性营养物已被耗尽。30小时后，您需要将培养液体积调整至20 mL：依次降低白色背衬出液针的高度，并逐个关闭通入培养液的空气气泡，直至在停止曝气时培养液体积达到20 mL。或者，如果培养液体积过低，可重新打开泵，等待其在无气流条件下补充至20 mL刻度处。现在将培养体积设定为 20 mL，将泵速调回 7.5 RPM，或根据您的泵调整至相当于每小时 0.17 体积的转速，每天一至两次将样品泵入置于冰上的洁净培养管中。根据实验要求，将取样塞插入置于冰上的收集管中，我通常取样两小时，可获得 6.8 mL 培养液。若您的泵设置正确，您需要记录开启泵的时间以及开始采集零时测量值的时间、测量持续时间以及收集到的体积。收集到100毫升采样瓶中的流出液因设定培养液体积而产生，并不重要，因此两小时结束后可将其倒掉。将采样瓶塞重新盖回现已空置的100毫升采样瓶上，随后可进行细胞计数，并对样品进行其他所需的检测分析。每天如此操作。我在冰上对培养物取样两小时。在此期间，我测量自上次取样以来收集的流出液，以计算稀释速率、每小时体积以及自上次测量以来的世代数。两小时取样结束后，将取样管重新放回现在已空的100 mL流出液收集瓶中。使用取样培养物，通过深入的分析方法对每毫升细胞数及其他感兴趣的终点指标进行定量，并利用遗传标记对群体组成进行表征；此外，微型恒化器手册中还涵盖了对 DNA 和 RNA 的表征方法。手册中还提供了一份我们在实验室中使用的模板工作表，有助于组织数据采集并实现数据分析的自动化。当您完成实验运行后，务必在当天拆卸并处理所有部件，以确保培养基不会干燥，从而避免污染管路或其他微型恒化器组件。实验的最后一天，关闭培养液和空气泵，进行最后一次取样。我通常会移除连接到培养室的所有管路，并将所有管道和独立的灭菌容器分开放置。然后将培养室本身置于冰上，测量培养体积、每毫升细胞数以及任何其他感兴趣的终点指标。接下来，取每种类型的管路，用反渗透水（RO水）彻底冲洗。对于培养基管路，我冲洗数分钟，其他类型的管路至少冲洗30秒。然后使用气泵将残留在每段管路中的水分吹出。此后，可将所有导管整理并悬挂晾干，以备后续实验使用。同时，所有快速接头应用水冲洗并取下晾干。为清洁软木塞组件，需用双蒸水对每根针头进行彻底冲洗。使用化学擦拭纸。同时擦去残留在针头外表面的任何培养基。然后使用针头插入器从培养基针和流出针中吸液并分配水。再次擦拭针头的外表面，即可准备使用。在下一次实验中，用水和乙醇清洗培养室，并按照第一个视频中的说明将其倒置存放。此外，还应用去离子水彻底冲洗塞在瓶塞中的小瓶内部三次。务必确保已将快速接头从汽车底座上取下，并让水流过出水口。在重复使用软管、软木塞组件或培养室之前，我通常会再次用反渗透水（RO水）清洗，并使用气泵向软管中吹气，以确保清除其中残留的水分。希望本说明对您有所帮助，祝您的实验顺利成功。如果您有任何疑问，请参阅迷你统计手册。

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