海马脑片培养中突触蛋白的包埋后免疫金标记

本实验的总体目标是进行免疫金标记，以确定大鼠海马CA1区旁位神经元中突触蛋白的超微结构定位。首先，从器官型脑片中取出CA1区域，修剪顶部一角以标记正确方向，并将其置于冰上无锇酸固定液中孵育。第二步，对固定后的组织进行脱水，并通过树脂渗透使其包埋硬化。

接下来，从包埋在树脂中的组织上切取超薄切片，并将其置于镍网上。最后一步是对组织切片进行免疫组织化学染色。最终，通过免疫电子显微镜技术来确定突触中蛋白质的定位。好的。

该方法有助于回答突触可塑性领域中的关键问题，例如树突棘内蛋白质的定位如何帮助理解其在突触功能中的作用。尽管该方法针对海马体脑片进行了优化，但也可广泛适用于其他神经元样本，包括急性脑片和原代神经元培养。开始实验时，将海马体脑片置于含有新鲜冰冻Sorensen磷酸盐缓冲液的聚苯乙烯培养皿中。

在切片上直接加入额外的一到两毫升冰冻缓冲液。为了分离切片中的CA1亚区，使用一次性解剖刀在齿状回附近平行于CA1细胞层的位置轻轻横向切割切片。然后将剩余的切片进行垂直切割，以去除CA3亚区和峡部（sulu）。

接下来，用手术刀背面切下冠状面（CA）组织的一角，以帮助识别组织的上表面，并小心地从膜上剥离组织。轻柔地将组织转移至含有冰冻Sorensen缓冲液的12孔板中。移除缓冲液，加入0.5至1毫升pH为7.3的冰冻固定剂，用Sorensen缓冲液稀释，确保充分覆盖样本。

然后在 4 摄氏度下孵育两小时。孵育结束后，从孔中移除固定剂，并用冰冻的 Sorensen 缓冲液清洗样品三次，每次 20 分钟。随后将样品在 pH 6.0 的 0.1 摩尔苹果酸缓冲液中，于 1%（质量/体积）单宁酸溶液中孵育。

孵育40分钟后，用苹果酸盐缓冲液洗涤样品两次，每次20分钟，以洗去单宁酸。接着，将样品在1%醋酸铀酰的苹果酸盐缓冲液中于4摄氏度避光孵育40分钟。醋酸铀酰对光敏感且具有放射性，因此操作时需小心。

孵育结束后，用预冷的苹果酸缓冲液将样品漂洗两次，每次20分钟，然后在 inmate 缓冲液中的0.5%氯化铂中孵育20分钟。最后，通过两次各20分钟的漂洗去除残留的氯化铂。每次使用 inmate 缓冲液后，将样品保存在苹果酸缓冲液中，并于4°C下储存，直至进行后续处理。

开始免疫组织化学实验时，首先将固定的CA1区进行脱水、树脂包埋，并按本视频文字方案所述，在镍网上切成60纳米的超薄切片。接着，在干净的载蜡纸上滴加一滴pH 7.5的含1%吐温-20的磷酸盐缓冲液。然后用洁净镊子轻轻夹取镍网，使切片面朝下漂浮于缓冲液滴上，在室温下孵育10分钟。孵育结束后，将镍网切片面朝上轻轻接触滤纸，吸去多余液体。

同时，用一小条滤纸轻轻吸除 EM 镊子臂之间滞留的溶液，注意确保切片不会完全干燥。然后在封口膜上滴加一滴 50 毫摩尔的甘氨酸溶液，将网格切片面朝下漂浮于甘氨酸溶液中，在室温下孵育。在样品孵育 15 分钟的同时，将用于二抗的动物来源的 2.5% 血清加入 2.5% BSA 溶液中，混匀后取一滴该混合液置于封口膜上。

孵育15分钟后，用滤纸将载网吸干，然后置于封闭液中漂浮30分钟。在室温下，通过将卷起的Kim擦拭纸放置于洁净塑料培养皿内侧来制备孵育 chamber。将一块洁净的param置于培养皿中央，然后向Kim擦拭纸中加入过滤水。

接下来，将一滴一抗溶液滴加在方华膜上，将样品置于其上，在室温下孵育，或在4°C下孵育过夜。最佳孵育时间、温度以及抗体浓度需通过实验确定。与一抗孵育后，用含1%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤载网三次，每次两分钟。随后加入二抗进行孵育，使用1:20稀释的抗兔或抗小鼠抗体，该抗体偶联10纳米金颗粒，孵育一小时。

室温下，用含1%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤三次，每次两分钟。然后用含2%戊二醛的缓冲液后固定样品五分钟。通过用含1%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤三次，再用过滤水洗涤三次，每次两分钟，以去除残留的戊二醛。

冲洗后，将载网置于2%醋酸铀中孵育10分钟。孵育期间，准备一个无CO2的培养环境：将一块多聚甲醛置于玻璃培养皿中央，然后在多聚甲醛周围放置10至15粒氢氧化钠颗粒，以吸收空气中的CO2。

关闭顶部数分钟。随后，使用巴斯德吸管迅速将少量新配制的Reynolds铅柠檬酸盐溶液转移至包埋模具中。打开顶部的幅度应仅足以插入巴斯德吸管，以尽量减少CO2重新进入腔室。

取三个小烧杯，分别装入温热的新鲜煮沸的去离子水。将载网浸入第一个烧杯中，轻轻旋转30秒，以洗去载网上的醋酸铀。在其余两个烧杯中重复此步骤。清洗完毕后，将玻璃培养皿的盖子打开至刚好足以将载网放置于Reynolds柠檬酸铅溶液液滴上的程度。

如果可能，在操作时佩戴口罩，以避免呼出的气体接触柠檬酸铅并防止沉淀物形成。10 分钟后，稍微打开容器盖子，取出载网。依次将其浸入三个盛有温热蒸馏水的新烧杯中，清洗三次。

然后将载网放在滤纸片上晾干。样品现已准备好用于电子显微镜观察。此处所示的海马区ca1区域超薄组织切片透射电镜图像中，可清晰分辨出内侧隔核神经元的树突及其树突棘。通过突触后致密区的存在以及界限清晰的质膜，可方便地鉴定出轴突末梢（以T标示）与树突棘（以S标示）之间的不对称突触。

通过免疫金电镜标记技术，可以在这些透射电镜图像中观察到神经颗粒蛋白（neurogranin）在树突棘中的分布情况，图像中的箭头对此进行了强调。神经颗粒蛋白从树突棘中心到树突棘质膜的径向距离可表示为标准化径向距离。距离值为零表示颗粒位于膜上，距离值为一表示颗粒位于树突棘的中心。

随后可以通过图形展示neuro grandin与树突棘之间的距离。此处以蓝色显示其归一化径向距离的分布，并与粉色显示的随机分布进行比较，该图表明neuro Grandin位于靠近质膜的位置。该技术为研究神经系统的研究人员探索受体、受体相互作用蛋白、转运蛋白和离子通道等多种分子在不同脑组织（包括大脑皮层、丘脑、嗅球和小脑）中的定位与分布奠定了基础。

请注意，使用固定剂时可能具有极高危险性，因此在进行此操作时，必须采取佩戴手套和实验服、在通风橱内操作固定剂等预防措施。