Name: 嵌入后突触蛋白的免疫标记海马切片培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: 学习使用免疫金标记和电子显微镜技术对大鼠海马CA1锥体神经元中的突触蛋白进行超微结构定位的方法。该技术可有效保存中枢神经系统组织的结构完整性和抗原性，为神经科学研究提供重要的蛋白质定位信息。

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作者感谢 Matthew Florence 在海马脑片培养制备方面的工作。本研究由美国国家衰老研究所和阿尔茨海默病协会的资助支持，资助对象为 NZG。

1. 固定
固定剂具有致癌性；操作时应佩戴手套，并在通风橱中处理固定剂。除非另有说明，所有孵育步骤均在冰上进行，所有溶液使用前均需过滤。请使用电子显微镜级别的试剂。
第1天
<ol>
	<li class="jove_content">实验条件处理后（例如 病毒注射、药物处理）后，将带有海马体脑片的膜置于盛有冰冷的0.1 M磷酸盐缓冲液（Sorensen磷酸盐缓冲液，pH 7.3）的60 × 15 mm聚苯乙烯培养皿中。直接在脑片上方加入1–2 ml的0.1 M磷酸盐缓冲液，以保持其低温状态。</li>
</ol>
关键步骤：务必使用新鲜配制的缓冲液和固定剂。确保缓冲液的pH值处于所需范围内。若未做到这一点，可能会损伤细胞结构。
<ol start="2">
	<li>为分离切片中的CA1区，使用一次性手术刀在紧邻齿状回（DG）处沿CA1细胞层平行方向轻轻横向切割切片（图1）。随后垂直切割剩余切片，以去除CA3区和下托。可切去切片的一个角，以帮助识别组织的上表面。</li>
</ol>
注意：如果无需通过病毒递送目的蛋白，可在移除培养基后用预冷缓冲液轻轻冲洗，然后对整个组织切片进行固定，之后再切取CA1区。
关键步骤：请始终标记组织的上表面，以便后续对载网进行正确切片。
<ol start="3">
	<li>使用手术刀背面小心地将组织从膜上取下。用巴氏吸管轻轻将组织转移至含有 0.1 M 磷酸盐缓冲液的 12 孔板中。</li>
	<li>吸去孔板中孔内的缓冲液，加入 500 μl - 1 ml 冰冷固定液（pH 7.3），固定液成分如下：0.1% 苦味酸、1% 多聚甲醛和 2.5% 戊二醛溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液中。在 4 °C 下孵育 2 小时。</li>
</ol>
注意：苦味酸在干燥时可能具有爆炸性。应将其用水润湿后置于密闭容器中保存。储存于干燥且通风良好的场所。
<ol start="5">
	<li>从孔中移除固定剂，并用 0.1 M 磷酸缓冲液清洗样品 3 次，每次 20 分钟。</li>
	<li>在 0.1 M 马来酸盐缓冲液（pH 6.0）中含 1% 鞣酸（w/v）的溶液中孵育 40 分钟。</li>
	<li>用马来酸盐缓冲液冲洗两次，每次 20 分钟。</li>
	<li>在避光条件下，于马来酸盐缓冲液中含 1% 醋酸铀酰（w/v）的溶液中孵育 40 分钟。醋酸铀酰对光敏感且具有放射性。溶解时需用 Parafilm 封住烧杯，并将未用完的缓冲液避光保存于 4 °C。</li>
	<li>用马来酸盐缓冲液冲洗两次，每次 20 分钟。</li>
	<li>在含 0.5% 氯化铂（w/v）的马来酸盐缓冲液中孵育 20 分钟。</li>
	<li>用马来酸盐缓冲液冲洗两次，每次 20 分钟。将样品在 4 °C 保存，直至进行后续处理。</li>
</ol>
2. 脱水与包埋
环氧丙烷具有致癌性。操作时应在通风橱中进行，以避免接触其蒸气。使用无水、100%纯乙醇，确保不含任何水分。用此无水乙醇稀释，制备不同浓度用于脱水。
第2天
<ol>
	<li>在50%乙醇中孵育5分钟，然后在70%乙醇中孵育5分钟。</li>
	<li>在新配制的70%乙醇中含1% p-苯二胺（PPD）溶液中孵育15分钟。</li>
	<li>用70%乙醇冲洗三次。</li>
	<li>在80%乙醇中孵育5分钟，然后在95%乙醇中孵育5分钟。</li>
	<li>在100%乙醇中孵育两次，每次5分钟。</li>
	<li>准备带螺口盖的玻璃小瓶，并确保其清洁且完全干燥。将组织切片转移至玻璃小瓶中，并对每个小瓶进行简单清晰的标记。</li>
	<li>在1:1乙醇:丙烯酸氧化物溶液中孵育5分钟。</li>
	<li>在100%丙烯酸氧化物中孵育两次，每次5分钟。</li>
	<li>向每个小瓶中加入树脂（Epon），使其与丙烯酸氧化物形成1:1混合液，轻轻混合2小时。避免剧烈震荡小瓶，以防产生气泡而影响包埋效果。</li>
	<li>加入树脂，使其与丙烯酸氧化物形成3:1混合液，并混合2小时。</li>
	<li>转移至100%树脂中，过夜孵育。</li>
</ol>
第3天
<ol start="12">
	<li>将样品夹在ACLAR塑料片之间，并在60 °C下固化24小时。</li>
</ol>
3. 切片与载网贴附
第4天
<ol>
	<li>切取半薄（0.5 μm）切片，用1%亚甲蓝和1%硼砂染色，以确定样品的正确取向。</li>
	<li>切取超薄切片（60 nm），并将切片转移至镍网上，每张镍网放置一个切片。</li>
</ol>
4. 免疫组织化学
所有缓冲液和水在使用前均应过滤。
第5天
<ol>
	<li>在平坦表面上的一块干净的Parafilm上滴加一滴（约50 μl）pH 7.5的1% Tween-20/磷酸盐缓冲液（T/PB）。用干净的镊子轻轻夹住铜网边缘，将铜网（切片面朝下）漂浮于缓冲液上，在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>将铜网切片面朝上置于滤纸上，吸去多余液体，然后将其漂浮于含50 mM甘氨酸的T/PB中，在室温下孵育15分钟。</li>
</ol>
关键步骤：在孵育过程中，为避免溶液从一个液滴过多“携带”到下一个液滴，每次更换溶液后，应将载网边缘轻轻接触#1滤纸以沥去多余液体。同时，用一小条滤纸轻轻插入夹持载网的电镜镊子臂之间，吸除镊子臂间滞留的溶液，注意确保切片不会完全干燥。
<ol start="3">
	<li>用滤纸将载网干燥，然后在含有2.5% BSA和2.5%次级抗体来源动物血清的T/PB溶液中室温下封闭30分钟。</li>
	<li>加入一抗（溶于T/PB中），在室温或4 °C过夜孵育。最佳孵育时间、温度以及抗体浓度需通过实验确定。</li>
	<li>用T/PB洗涤载网三次，每次2分钟。</li>
	<li>加入次级抗体（1:20稀释的与10 nm金颗粒偶联的抗兔或抗小鼠抗体），室温孵育1小时。</li>
	<li>用T/PB洗涤三次，每次2分钟。</li>
	<li>用含2%戊二醛的T/PB溶液在室温下后固定5分钟。</li>
	<li>先用T/PB洗涤三次，每次2分钟，再用过滤水洗涤三次，每次2分钟。</li>
	<li>用2%醋酸铀水溶液孵育10分钟。</li>
</ol>
在染色网格的同时，准备一个无 CO2 的培养室：将一块 Parafilm 放在玻璃培养皿中央，然后在培养皿中 Parafilm 周围放置 4–6 粒 NaOH 颗粒，以吸收空气中的 CO2。将盖子盖上并静置数分钟。使用巴斯德移液管，迅速将少量雷诺氏柠檬酸铅溶液转移至玻璃培养皿中的 Parafilm 上。打开盖子的缝隙仅足以插入巴斯德移液管，以尽量减少 CO2 重新进入培养室。
注意：配制雷诺氏柠檬酸铅溶液时，将 100 ml 去离子水在微波炉中煮沸，然后在密闭容器中冷却。取一个带塞的 50 ml 容量瓶，加入 1.33 g 硝酸铅、1.76 g 柠檬酸钠和 30 ml 已煮沸的水，剧烈振荡 1 分钟，随后间歇振荡 30 分钟。向此浑浊溶液中加入 8 ml 1 M 氢氧化钠溶液，缓慢翻转容量瓶数次，溶液将变为澄清。用煮沸过的水将溶液定容至 50 ml。将溶液密封保存。若出现沉淀，则应弃去并重新配制。
<ol start="11">
	<li>在三个较小的烧杯中准备温热的新鲜煮沸去离子水。将载网浸入第一个烧杯中，轻轻旋转30秒，以洗去醋酸铀酰。在其余两个烧杯中重复此步骤。</li>
	<li>打开玻璃培养皿盖至刚好能将载网放入柠檬酸铅（Reynold法）溶液液滴中。如有可能，操作时应佩戴口罩，避免呼出气体接触柠檬酸铅，防止沉淀形成。孵育10分钟。</li>
	<li>将培养皿盖打开至刚好能取出载网的程度，避免呼吸接触柠檬酸铅。依次将载网浸入盛有温热新鲜煮沸蒸馏水的三个烧杯中，清洗三次。将载网置于滤纸上，切面朝上，自然晾干。样品现可进行透射电子显微镜观察。</li>
</ol>

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<li>Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSD-95+is+associated+with+the+postsynaptic+density+and+not+with+the+presynaptic+membrane+at+forebrain+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses.</a> J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).</li>
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</ol>

我们没有需要披露的内容。

在本实验方案中，我们采用了Phend和Weinberg的方法处理大鼠脑和脊髓组织，以研究海马脑片培养中的树突棘。海马CA3-CA1区的树突棘是精细的结构，含有多种蛋白质，在调控神经元功能中发挥重要作用。该方法在增强抗原性的同时，保持了良好的超微结构保存效果（图2A），实现了适度的标记效率和良好的可重复性，有助于表征特定抗原在树突棘内的分布情况。在此，我们使用10 nm胶体金标记了Ng，并对金颗粒进行定量分析，以生成Ng的标记模式，从而帮助理解其在突触功能中的作用（图2B）8。
免疫金标记的定量分析可通过多种方式进行11-13。然而，此类定量结果的解释并不总是直接明了。标记效率、金颗粒大小、样品处理过程中的变异以及不同样品间抗原数量的差异均可能影响金颗粒的定量结果。这些问题超出了本实验方案的范围，但已有若干综述对其中部分问题进行了探讨14-17。
在此方法中，以硫代乙酰胺（TA）、铀酰乙酸（UA）...

<table><tbody><tr><td>60 x 15 mm 聚苯乙烯培养皿</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>EXELINT</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养小室</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>10 nm 羊抗兔金标</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>抗神经颗粒素抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5620</td><td></td></tr><tr><td>100% 苦味酸</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>19550</td><td></td></tr><tr><td>96% 多聚甲醛</td><td>Acros Organics</td><td>AC41678-0030</td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛（电镜级）</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>对苯二胺</td><td>Sigma</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>四氯化铂</td><td>Sigma</td><td>379840</td><td></td></tr><tr><td>单宁酸</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>21710</td><td></td></tr></tbody></table>

海马脑片培养中突触蛋白的包埋后免疫金标记

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

免疫电子显微镜技术是研究亚细胞水平生物分子的有力工具。与胶体金等电子致密标记物偶联的抗体可揭示特定抗原在各种组织中的定位与分布1。目前应用最广泛的两种技术是包埋前免疫标记法和包埋后免疫标记法。在包埋前免疫金标电子显微镜（EM）技术中，组织必须先进行通透处理，以允许抗体渗透，然后再进行包埋。这类方法在结构保存方面效果理想，但抗体渗透性差（通常仅前几微米）是一个显著缺点2。包埋后标记法则可避免这一问题，因为标记过程是在固定组织的切片上进行的，抗原更易接近。多年来，多种技术改进已显著优化了包埋后标记方法，提高了免疫反应性并更好地保留了超微结构3-5。
组织固定是电镜研究中的关键步骤。固定剂通过化学交联大分子，使组织结构得以稳定保存。固定剂的选择不仅影响结构的保存效果，还会影响抗原性和对比度。四氧化锇（OsO4）、甲醛和戊二醛数十年来一直是标准固定剂，尤其适用于在化学和物理处理过程中极易受损的中枢神经系统（CNS）组织。然而，OsO4反应性极强，已被证明会掩盖抗原6，导致标记效果差且不充分。为避免化学固定，替代方法包括组织冷冻。但这些技术操作困难，且需要昂贵的仪器设备。为解决上述部分问题并改善中枢神经系统组织的标记效果，Phend et al. 以醋酸铀（UA）和单宁酸（TA）替代四氧化锇（OsO4），并成功引入了其他改进措施，以提高脑和脊髓组织中抗原检测的敏感性和结构保存质量7。我们采用了这种无锇后包埋法处理大鼠脑组织，并优化了免疫胶体金标记技术，用于检测和研究突触蛋白。
本文介绍了一种用于确定大鼠海马CA1区锥体神经元中突触蛋白超微结构定位的方法。我们采用海马器官型培养切片，该切片可维持海马的三突触回路，因此特别适用于研究突触可塑性——这一机制被广泛认为是学习与记忆的基础。出生后第5至第6天的小鼠或大鼠海马组织可制备成器官型切片，方法如前所述8，此类切片特别适用于急性敲低或过表达外源性蛋白。我们此前已利用该方案对神经颗粒素（neurogranin, Ng）进行了表征，Ng是一种神经元特异性蛋白，在调控突触功能中具有关键作用8,9。我们也用该方法研究了钙调蛋白（calmodulin, CaM）以及钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（Ca2+/CaM-dependent protein kinase II, CaMKII）的超微结构定位10。如结果所示，该方案可良好保存树突棘的超微结构，并实现Ng的高效标记，有助于阐明其在树突棘内的分布特征8。此外，本文所述方法亦可广泛应用于研究参与神经元功能的其他多种蛋白。

图2B 展示了内源性Ng分子在海马CA1区锥体神经元树突棘中分布的一个示例。载有海马CA1区超薄组织切片（厚度60 nm，如图2A所示）的镍网先用1% T/PB和50 mM甘氨酸处理，随后用2.5% BSA和2.5%血清进行封闭，再与抗Ng抗体孵育。经T/PB洗涤后，将镍网置于连接有10 nm金颗粒的山羊抗兔二抗溶液中。最后，镍网再次用T/PB洗涤，并用2%戊二醛后固定，接着用2%醋酸铀和Reynold's柠檬酸铅染色以增强对比度。左图：代表性透射电镜图像，显示不对称型突触。突触后区可通过电子致密的突触后密度（PSD，箭头所示）以及清晰的质膜结构加以识别。右图：每个Ng分子（箭头所示）到质膜的最短距离被标准化为树突棘的半径。位于树突棘内（但不在PSD处）的Ng分子倾向于靠近质膜分布。该直方图最初发表于《EMBO杂志》8。
<img alt="Drug treatment, vira...

蛋白质的定位与分布为其细胞功能的研究提供了重要信息。电子显微镜（EM）具有较高的空间分辨率，可用于免疫组织化学后特定抗原亚细胞定位的确定。对于中枢神经系统（CNS）组织而言，在电子显微镜研究中同时保持结构完整性和抗原性尤为困难。本文采用一种已用于保存CNS中结构与抗原的方法，以研究和表征大鼠海马CA1区锥体神经元中的突触蛋白。

免疫电子显微技术是研究亚细胞水平生物分子的有力工具。将抗体与电子致密标记物（如...）偶联，可用于...

本实验的总体目标是进行免疫金标记，以确定大鼠海马CA1区旁位神经元中突触蛋白的超微结构定位。首先，从器官型脑片中取出CA1区，修剪顶部一角以标记正确方向，并将其置于冰上的无锇酸固定液中孵育。第二步，对固定后的组织进行脱水，并通过树脂渗透使其包埋硬化。接下来，从包埋在树脂中的组织上切取超薄切片，并将其置于镍网上。最后一步是对切片组织进行免疫组织化学染色。最终，通过免疫电子显微镜技术来确定突触中蛋白质的定位。好的。该方法有助于回答突触可塑性领域中的关键问题，例如树突棘内蛋白质的定位如何帮助理解其在突触功能中的作用。尽管该方法针对海马体脑片进行了优化，但也可广泛适用于其他神经元样本，包括急性脑片和原代神经元培养。开始实验时，将海马体脑片置于含有新鲜冰冻Sorensen磷酸盐缓冲液的聚苯乙烯培养皿中。在切片上直接加入额外的一到两毫升冰冻缓冲液。为了分离切片中的CA1亚区，使用一次性解剖刀在齿状回附近轻轻沿与CA1细胞层平行的方向进行切割。然后将剩余的切片垂直切割，以去除CA3亚区和峡部（sulu）。接下来，用手术刀背面切下CA组织的一角，以帮助识别组织的上表面，并小心地从膜上取下组织。轻柔地将组织转移至含有冰冻Sorensen缓冲液的12孔板中。移除缓冲液，加入0.5至1毫升pH为7.3的冰冻固定剂，用Sorensen缓冲液稀释，确保充分覆盖样本。然后在 4 摄氏度下孵育两小时。孵育结束后，从孔中移除固定剂，并用冰冻的 Sorensen 缓冲液清洗样品三次，每次 20 分钟。随后将样品在 pH 6.0 的 0.1 摩尔苹果酸缓冲液中，于 1%（质量/体积）单宁酸溶液中孵育。40分钟后，用苹果酸盐缓冲液将样品清洗两次，每次20分钟，以洗去单宁酸。接着，将样品在1%醋酸铀酰的苹果酸盐缓冲液中于4摄氏度避光孵育40分钟。注意：醋酸铀酰对光敏感且具有放射性，操作时需小心谨慎。孵育结束后，用预冷的苹果酸缓冲液将样品漂洗两次，每次20分钟，然后在 inmate 缓冲液中的0.5%氯化铂中孵育20分钟。最后，通过两次每次20分钟的漂洗去除残留的氯化铂。每次使用 inmate 缓冲液后，将样品保存在苹果酸缓冲液中，并于4°C下储存，直至进行后续处理。开始免疫组织化学实验时，首先将固定的CA1区进行脱水、树脂包埋，并按本视频文字方案中所述方法切割，以获得负载于镍网上的60纳米超薄切片。接着，在干净的聚甲醛片上滴加一滴pH 7.5的1%吐温-20磷酸盐缓冲液。然后用洁净镊子轻轻夹取镍网，使切片面朝下漂浮于缓冲液液滴上，在室温下孵育10分钟。孵育结束后，将镍网切片面朝上置于滤纸上，吸去多余液体。同时，用一小条滤纸轻轻吸除 EM 镊子臂之间滞留的溶液，注意确保切片不会完全干燥。然后在 Parafilm 上滴加一滴 50 毫摩尔的甘氨酸溶液，将网格的切片面朝下漂浮于甘氨酸溶液中，在室温下孵育。在样品孵育 15 分钟的同时，将用于二抗的动物来源的 2.5% 血清加入 2.5% BSA 溶液中，混匀后取一滴该混合液置于 Parafilm 上。孵育15分钟后，用滤纸将载网吸干，然后置于封闭液中漂浮30分钟。在室温下，通过将卷起的Kim擦拭纸放置于洁净塑料培养皿内侧来制备孵育腔。将一块洁净的帕拉膜置于培养皿中央，然后向Kim擦拭纸上加入过滤水。接下来，将一滴一抗溶液滴加在方华膜上，将样品置于其上，在室温下孵育，或在4°C下孵育过夜。最佳孵育时间、温度以及抗体浓度需通过实验确定。与一抗孵育后，用含1%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤载网三次，每次两分钟。随后加入二抗进行孵育，使用1:20稀释的抗兔或抗小鼠抗体，该抗体偶联10纳米金颗粒，孵育一小时。在室温下，用含1%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤三次，每次两分钟。然后用含2%戊二醛的缓冲液对样品进行五分钟后固定。用含1%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤三次以去除多余的戊二醛，再用过滤水洗涤三次，每次两分钟。冲洗后，将载网置于2%醋酸铀中孵育10分钟。孵育期间，准备一个无CO2的培养环境：将一块多聚甲醛置于玻璃培养皿中央，然后在多聚甲醛周围放置10至15粒氢氧化钠颗粒，以吸收空气中的CO2。关闭顶部数分钟。随后，使用巴斯德吸管迅速将少量新配制的Reynolds柠檬酸铅溶液转移至模具中。打开顶部的幅度应仅足以插入巴斯德吸管，以尽量减少CO2重新进入腔室。取三个小烧杯，分别装入温热的新鲜煮沸的去离子水。将载网浸入第一个烧杯中，轻轻旋转30秒，以洗去载网上的醋酸戊酯。在其余两个烧杯中重复此步骤。清洗完毕后，将玻璃培养皿的盖子打开至刚好足以将载网放置于Reynolds柠檬酸铅溶液液滴上的程度。如果可能，在操作时佩戴口罩，以避免呼出的气体接触柠檬酸铅并防止沉淀物形成。10 分钟后，稍微打开容器盖子，取出载网。依次将其浸入三个盛有温热蒸馏水的新烧杯中，清洗三次。然后将网格置于滤纸片上晾干。样品现已准备好用于电子显微镜观察。此处显示的海马区ca一区域的超薄组织切片透射电子显微照片中，可清晰辨认出锥体神经元的树突和树突棘。由于存在突触后密度和界限清晰的质膜，因此易于识别轴突末梢（以T标记）与树突棘（以S标记）之间的不对称突触。通过免疫金电镜标记技术，可以观察到神经颗粒蛋白（neuro grandin）在树突棘中的分布情况，这些透射电镜（TEM）图像中的箭头突出了该分布特征。从树突棘中心到其质膜的神经颗粒蛋白的径向距离可被测量为标准化径向距离。距离值为零表示颗粒位于膜上，距离值为一表示颗粒位于树突棘的中心。随后可通过图形展示神经颗粒蛋白与树突棘之间的距离。此处以蓝色显示其归一化径向距离的分布，并与粉色显示的随机分布进行比较，该图表明神经颗粒蛋白位于靠近质膜的位置。该技术为研究神经系统的研究人员探索受体、受体相互作用蛋白、转运蛋白和离子通道等多种分子在不同脑组织（包括大脑皮层、丘脑、嗅球和小脑）中的定位与分布奠定了基础。请注意，使用固定剂可能具有极高危险性，因此在进行本操作时，必须采取佩戴手套和实验服、在通风橱内操作固定剂等预防措施。

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嵌入后突触蛋白的免疫标记海马切片培养

本视频演示了对含有生物胞素标记的中间神经元的固定大鼠脑切片进行染色的操作步骤。该实验方案包括与亲和素-生物素复合物（ABC）孵育、使用辣根过氧化物酶（HRP）及显色底物染色、用四氧化锇固定组织结构，以及将组织包埋于树脂中以用于成像。...

大鼠海马脑片中生物胞素标记的中间神经元染色可视化方法

来源：Schönherr, S., 等. 结合光遗传学与冰冻断裂复型免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布。 J. Vis. Exp.

小鼠脑组织冰冻断裂标本中神经元膜蛋白的免疫标记

来源：McLeod, F., 等. 海马啮齿类脑切片中突触密度的评估. J. Vis. Exp.

使用免疫荧光法对小鼠海马脑片中突触进行显微分析

我们提供了一种详细的方案，用于在海马CA1区诱导长时程增强效应，并随后从已强化的脑片区域分离出核富集组分。该方法可用于在学习与记忆的细胞模型中确定活动依赖性的核蛋白入核过程。...

从海马脑片中分离CA1区核富集组分以研究突触-核信使蛋白的活性依赖性核转运

本视频文章介绍了利用啮齿类动物急性海马脑片研究CA1锥体神经元中长期可塑性及其相关联的突触标记、捕获和交叉标记等过程的实验方法。...

利用啮齿类动物急性海马脑片研究突触标记/捕获及交叉捕获

后包埋免疫胶体金法是进行特定分子亚细胞定位高分辨率分析的最有效方法之一。本文介绍了一种定量分析视网膜带状突触处谷氨酸受体的实验方案。...

视网膜带状突触膜受体的高分辨率定量免疫金分析

本文阐述了如何通过光遗传学工具的病毒转导与冰冻断裂复型免疫标记技术相结合，对具有已鉴定的突触前和突触后成分的突触处神经递质受体的表达进行定量，并分析其分布模式。...

结合光遗传学与冰冻断裂复制免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布

本方案介绍了一种通过生物胞素填充及后续免疫组织化学处理，对电生理记录过程中进行膜片钳的神经元进行形态学重建的方法。我们展示，经过染色并加盖盖玻片的较厚生物胞素填充脑片，可在数天后使用第二种一抗重新染色 或数月后。...

生物素填充并处理的脑组织切片中神经化学标记物的免疫染色

通过将突触小泡蛋白与pHluorin融合后的光学显微镜检测以及突触小泡摄取的电子显微镜观察，可检测突触小泡的内吞作用。...

在培养的海马神经元中测量突触囊泡内吞作用

本文概述了一种利用免疫荧光技术在海马切片中准确识别和分析突触的实验方案。...

海马体啮齿类动物脑切片中突触密度的评估

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

学习使用免疫金标记和电子显微镜技术对大鼠海马CA1锥体神经元中的突触蛋白进行超微结构定位的方法。该技术可有效保存中枢神经系统组织的结构完整性和抗原性，为神经科学研究提供重要的蛋白质定位信息。

海马脑片培养中突触蛋白的包埋后免疫金标记

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