使用自制双辉光萤光素酶检测的高通量筛选功能
June 1st, 2014
我们目前确定采用高通量机器人转染和一个自制的双发光荧光素酶检测转录调控因子的快速和廉价的检查方法。该协议迅速产生直接并排端功能数据数以千计的基因，很容易修改针对任何感兴趣的基因。
该程序的总体目标是使用简单的高通量转染方案和自制的双辉光荧光素酶测定来鉴定任何目标基因的转录调节因子。这是通过首先设计和克隆一组独特的双荧光素酶报告质粒来实现的。这些质粒使用来自 DNA 表达文库的质粒转染到微孔板中的 2 9 3 T 细胞中，使得每个孔都用单个文库质粒转染。
48 小时后，测定萤火虫荧光素酶活性，然后测定香草荧光素酶活性。最后一步是计算萤火虫与香草荧光素酶活性比。最终，响应每个文库的目标基因的相对诱导。
基因是通过基于板的标准化后每个孔中萤火虫与香草荧光素酶活性的比率来推断的。与现有的报告基因检测方案相比，该技术的主要优势在于它能够以最少的人力和成本快速生成大量基因的功能数据。在指定为筛选第一天的转染前一天，将 2 9 3 个 T 细胞排入 96 个细胞中。
对孔板细胞进行大小测定、计数并重悬至每毫升 10 至 5 个细胞的 1.5 倍浓度。在含有 14%FBS 的 DMEM 中，将细胞倒入无菌储液器中。将储液槽、6 块透明底 96 孔板和一盒过滤移液器吸头放在自动液体处理器的机器人甲板上。
每个要筛选的文库板应放置两块细胞板。将 100 μL 细胞分配到每个板的每个孔中，密度为 1.5 乘以 10 到每孔的第四个细胞。本演示将筛选三个文库板。
因此，制备 6 块细胞板，以 50 倍 G 离心细胞板 2 分钟，使用低升温速度，以确保每个孔中的细胞密度相等。该图说明了离心后铺板的细胞应该是什么样子的。将细胞在 37 摄氏度和 10% 二氧化碳下孵育过夜。
为了制备萤火虫和香草报告基因质粒，在 15 毫升锥形管中用无内毒素的水稀释至每微升 5 纳克。按体积 5 比 3 萤火虫与香草质粒的比例混合稀释液。将组合质粒移液到 96 孔板的每个孔中，每个文库板分配 17 微升，加上 2 至 10 微升过量的质粒到每个孔中，在筛选的第二天转染细胞。
要开始此程序，对于每个文库板，将 107.5 μL 室温 op 缺陷与 4.3 mL 无血清培养基混合，在聚苯乙烯管中稀释 1 至 40 mL，在室温下孵育 5 分钟，将每个文库板 44 μL 分配到 96 孔聚苯乙烯 V 型底板的每个孔中。将文库 DNA 板、稀释的 opt 效应板、报告质粒板和一盒移液器吸头放在机器人甲板吸出物上。17 μL 报告质粒、43 μL 稀释的 opt 效应和 26 μL 文库 DNA，在每次抽吸之间插入 5 μL 的气隙。
文库 DNA 应最后吸出，以防止交叉污染。将吸头中的内容物分配到新的聚苯乙烯 V 底板混合物盖中，静置 20 分钟，以形成脂质 DNA 复合物。如果横切多个文库板，请更换移液器吸头和文库板，并在 20 分钟后重复，揭开 Opt 效应 DNA 混合物板，并使用一盒移液器吸头将其放在带有两块 2 9 3 T 细胞板的机器人平台上。
吸出 80 μL opt效应 DNA 混合物，并为每板细胞缓慢分配每孔 40 μL。将 opt 效应 DNA 混合物添加到所有板中的细胞中后，覆盖细胞。将板以 1， 200 倍 G 离心 30 分钟。
将板放回培养箱中，孵育细胞 4 到 6 小时。在此孵育过程中，通过将 12 毫升含有 10% FBS 的 DMEM 和每毫升 10 微克环丙氧辛混合来制备新鲜培养基。对于每个转染的文库板，将新鲜培养基倒入无菌储液槽中。
接下来，将两盒机器人吸头、单板细胞、包含新鲜培养基的储液器和一个废物储液器放在机器人甲板上。然后从细胞中吸出 100 μL 培养基，并分配到废液储液器中，部分填充 70% 乙醇。使用新鲜吸头吸出 100 μL 新鲜培养基，然后缓慢分配到细胞上。
将板放回培养箱中 48 小时。进行萤火虫和香草荧光素酶测定。转染后第 4 天，对于每个文库板进行筛选，从各自的储备溶液中制备 8 毫升 3 x Firefly 检测缓冲液和 12 mL 3 x vanilla 检测缓冲液，将 82 μL 萤火虫检测缓冲液分配到 96 孔 V 形底板的每个孔中，用于每个待检测的文库板。
同样，将 122 μL 香草测定缓冲液分配到另一个 96 孔 V 形底板的每个孔中。对于每个要检测的板，将两种检测缓冲液放在一边。将一盒移液器吸头、一个废液储存器和从同一文库板转染的两板细胞放在机器人甲板上，从每个板中吸出 60 微升培养基，并丢弃在部分装满 70% 乙醇盖板的废液储存器中并放在一边。
接下来放置两盒移液器吸头。机器人甲板上的三个 firefly 检测缓冲液板和一组细胞板。吸出 40 μL 的 3 x Firefly 测定缓冲液，并将其添加到第一块细胞板中，充分混合。
改用新的移液器吸头。对第二个细胞板重复此作。将细胞置于室温下 10 分钟以完成裂解。
在光度计上记录每个细胞板每个孔的发光，每孔记录一秒。将板返回机器人甲板。将两盒移液器吸头、三 x 分析缓冲液板和一组细胞板放在机器人甲板上。
吸出 60 微升 3 x 香草测定缓冲液，并将其添加到第一块细胞板中。充分混合。换用新的移液器吸头盒。
对第二个细胞板重复此作。在光度计上记录所有板的发光。记录每个孔一秒钟。
单个半板的典型荧光素酶值如下表所示。萤火虫与更新发光比或每个孔的 F 2 R 比值是通过将萤火虫信号计数除以 ran 更新信号计数来计算的，结果显示在图 C 中.面板 D 显示了每个孔的诱导值，方法是将孔的 F 2 R 比率除以板的平均 F 2 R 比率， 不包括最高和最低 25% 的井。对于单个转染文库板，应在重复中对诱导值进行平均。
诱导或抑制 α 突触核蛋白超过三倍的基因被认为是命中。请注意，此处显示的代表性结果中 H 2 孔中的 32 倍诱导剂是单孔板诱导值的图形表示，其中 H 2 孔以蓝色突出显示。Hi.H two 是一种神经元转录因子，以前与 α 突触核蛋白表达无关。
重要的是要验证筛选是否在报告基因测定的线性范围内进行，以便测量导致表达增加的克隆，因为在强 H-C-M-V-I-E 一启动子和测定的控制下，用增加量的萤火虫和香草荧光素酶质粒转染该末端细胞增加的荧光素酶活性。通过该协议，观察到萤火虫活动在广泛的值范围内保持线性。而香草活性的曲线在每孔 15 纳克以上趋于平坦。
在孵育步骤后立即进行检测也很重要，以避免由于底物耗竭而导致的非线性。用于萤火虫荧光素酶测定的衰变信号的时间进程显示，使用该方案添加试剂后长达 1 小时内具有显着的萤火虫荧光素酶活性，筛选了 7， 670 个人类基因，并最终确定了 68 个新的 α 突触核蛋白调节因子在此处显示的代表性结果中。每条水平线代表与受控 GFP 中性诱导剂相比，单个基因命中的诱导率。
蓝线代表阳性诱导剂，而唯一的红线代表抑制剂诱导值计算为驱动萤火虫荧光素酶活性的 α 突触核蛋白启动子与驱动每次命中的随机荧光素酶活性的 CMV 启动子的比率，使用 GFP 诱导剂标准化为相同的荧光素酶构建体测定，遵循此程序。可以进行其他方法，如定量 PCR 以及进一步的过表达和敲低测定，以确保鉴定出的命中调节内源性靶标。
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概述
本文介绍了一种快速且经济高效的方法，用于通过高通量机器人转染和自制双荧光荧光素酶检测来识别转录调控因子。该协议允许以直接的方式为数千个基因生成功能数据。
关键研究组成部分
科学领域
- 转录调控
- 基因表达分析
- 高通量筛选
背景
- 转录调控因子在基因表达中起着至关重要的作用。
- 高通量方法可以加速这些调控因子的识别。
- 荧光素酶检测常用于测量基因活性。
- 机器人转染提高了筛选过程的效率。
研究目的
- 开发一种用于识别任何感兴趣基因的转录调控因子的方法。
- 利用双荧光荧光素酶检测来生成功能数据。
- 实现数千个基因的快速筛选。
使用的方法
- 设计和克隆双荧光素酶报告基因质粒。
- 在微板中将质粒共转染到293T细胞中。
- 在48小时后测定萤火虫荧光素酶活性。
- 计算萤火虫和香草荧光素酶活性的比率。
主要结果
- 该方法成功地识别了转录调控因子。
- 快速且高效地生成功能数据。
- 结果可以轻松修改以针对特定基因。
- 该方法适用于广泛的基因。
结论
- 该协议为基因调控研究人员提供了一个宝贵的工具。
- 它提高了转录调控因子识别的速度和效率。
- 该方法适用于各种研究应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This high-throughput functional screening protocol enables rapid identification of transcriptional regulators for target validation in neurodegenerative disease research, particularly for alpha-synuclein in Parkinson's disease. By combining robotic transfection with a validated homemade dual-glow luciferase assay, the method delivers quantitative, normalized gene expression data at scale, supporting mechanistic de-risking and lead identification in early discovery. The approach reduces reliance on expensive commercial reagents while maintaining reproducibility, making it suitable for enterprise-scale screening campaigns targeting druggable pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses by measuring gene-specific effects on promoter activity across thousands of ORFs.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of putative regulators in a disease-relevant cellular context.
- Predictive Value: Generates ratio-based readouts (Firefly/Renilla) that facilitate target prioritization and portfolio triage based on induction magnitude.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces normalized luciferase signals suitable for high-throughput compound or genetic screening campaigns.
- Reproducibility: Employs internal Renilla control to correct for transfection efficiency and cell viability variations.
- Scalability: Compatible with bench-top robotic systems for processing 96-well plates at 7,670 genes per screen.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly targets alpha-synuclein transcriptional regulation, a key pathway in Parkinson's disease pathogenesis.
- Translational Continuity: Identified hits (e.g., neuronal transcription factors) can be advanced to validation in endogenous models using qPCR or knockdown assays.
- Mechanistic De-risking: Clarifies upstream regulatory networks affecting target expression, reducing ambiguity in target mechanism.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling hypothesis-driven screening from target validation through lead identification by linking genetic perturbations to measurable transcriptional outputs.
- Discovery Biology: Tests transcriptional regulator hypotheses by quantifying promoter-driven luciferase activity in response to library gene expression.
- Screening: Delivers assay-ready, normalized luminescence data compatible with automated liquid handling and luminometer detection.
- Analytics: Provides Firefly-to-Renilla ratios and induction values that enable statistical comparison and hit calling (e.g., >3-fold change).
- Translational Research: Supports progression to preclinical validation by identifying regulators confirmable in endogenous systems.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other genes of interest and library types (ORF, lentiviral) with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanism by linking genetic modifiers to transcriptional output.
- Operational Value: Reduces reagent cost through validated homemade dual-luciferase alternatives and increases throughput via automation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional, quantitative data on target regulation early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on transcriptional regulatory network insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, plasmid preparation, and robotic liquid handling.
- Needs access to a biosafety cabinet-enclosed automated liquid handler and luminometer for luminescence detection.
- Demands standardization of plasmid ratios, transfection conditions, and assay timing across plates.
- Involves adaptation considerations when shifting from ORF to lentiviral library formats or different cell lines.
- Includes practical limitations such as luciferase assay linearity constraints (e.g., Renilla signal flattening above 15 ng/well).
