Name: 使用自制双辉光萤光素酶检测的高通量筛选功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学习使用自制双辉光萤光素酶检测的高通量筛选方法，通过机器人转染技术快速识别转录调控因子。该方法可在293T细胞中高效生成数千基因的功能数据，为基因表达调控研究提供经济实用的工具。

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我们感谢麻省总医院（MGH）DNA 核心实验室的 John Darga 在 DNA 筛选文库制备方面的帮助。Perkin Elmer 公司的 Christopher Chigas 为我们 Wallac 1420 发光仪提供了宝贵的技术支持。Agilent 公司的 Steven Ciacco 和 Martin Thomae 为 Bravo 机器人提供了技术支持。我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）的 Ron Johnson 和 Steve Titus 慷慨提供其双荧光素酶报告基因检测方案。

有关实验概述，请参见图1。
1. 准备含有α-突触核蛋白启动子的报告质粒
α-突触核蛋白基因的调控元件（图2）跨度约为10 kb，从上游NACP（淀粉样肽的非Aβ组分）双核苷酸重复序列1,2开始，延伸至内含子23。我们在报告基因载体中包含了该区域的一部分。我们发现，含有内含子2的质粒需要采用特殊的培养方法，具体如下所述。荧光素酶质粒pGL4.10和pGL4.75（图3）可从Promega公司商业购得，并可使用常规分子生物学实验方案进行扩增。
<ol>
	<li>使用 表1 中的配方和 表2 中的引物，通过两轮独立的PCR分别扩增α-突触核蛋白启动子的2&#160;个组分。</li>
	<li>在琼脂糖凝胶上验证PCR产物，并使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）进行纯化，用50 μl TE（Tris-EDTA）洗脱。将洗脱得到的0.9 kb片段于-20 °C保存以备后续使用。</li>
	<li>用SacI和XhoI酶切3.4 kb PCR片段的全部体积以及5 μg的pGL4.10质粒。用小牛肠碱性磷酸酶（Roche）处理载体，并使用PureLink Quick Gel Extraction试剂盒（Invitrogen）进行凝胶纯化。</li>
	<li>使用T4 DNA连接酶（NEB）将片段与载体连接。用PureLink PCR Micro试剂盒（Invitrogen）纯化连接反应产物，以10 μl TE缓冲液洗脱。</li>
	<li>取2 μl纯化后的连接反应产物，转入20 μl ElectroMAX Stbl4感受态细胞（Invitrogen）中，按照制造商说明进行电穿孔。在30 °C、225 rpm条件下振荡培养90分钟。取2&#160;倍体积涂布于含100 mg/ml氨苄青霉素的LB平板，30 °C培养2&#160;天。</li>
	<li>用牙签挑选4–6个单菌落，接种至2 ml TB（Terrific Broth）培养基中。在30 °C摇床中过夜培养。</li>
	<li>使用PureLink HiPure质粒小提试剂盒（Invitrogen），从各小提培养物的1.5 ml中提取质粒DNA。</li>
	<li>用BamHI酶切小提质粒，并在琼脂糖凝胶上进行电泳。正确克隆应产生2.8 kb和4.9 kb的片段。</li>
	<li>将正确克隆剩余的小提培养物在新鲜的LB（Luria Broth）平板上重新划线，30 °C培养2&#160;天。</li>
	<li>挑选一个单菌落，接种至1.5 ml TB预培养液中，30 °C振荡过夜培养。注意预培养液不可达到饱和生长。</li>
	<li>将整个预培养液接种至150 ml预热的TB培养基中，30 °C振荡培养2&#160;天。在进入下一步前，取1.5 ml该培养物进行额外的小提质粒及酶切验证，以确认克隆在复制过程中未发生突变。</li>
	<li>使用PureLink HiPure质粒大提试剂盒（Invitrogen）从剩余培养物中提取质粒DNA。该中间质粒的预期产量为每150 ml培养物50–150 μg。</li>
	<li>解冻第1.2步中保存的0.9 kb片段。重复步骤1.3至1.12，将0.9 kb片段克隆至中间质粒中，但酶切时改用KpnI和SacI。连接、转化、筛选并按前述方法培养以进行大提质粒。用BamHI酶切应产生5.8 kb和2.8 kb的片段。该质粒将用于后续筛选实验。</li>
</ol>
2. 准备293T细胞、报告质粒和文库DNA用于筛选
首先将293T细胞接种至96孔板中，并于次日进行转染。报告基因质粒和文库DNA被稀释后加入96孔板。我们所用的转染级文库DNA由麻省总医院DNA核心实验室提供（<a href="http://dnacore.mgh.harvard.edu" target="_blank">dnacore.mgh.harvard.edu</a>）。本方案将单个文库DNA板转染至2&#160;个相同的293T细胞板中（图1），因此每块待筛选的文库板需准备2&#160;块细胞板。
注意：培养细胞时应使用不含酚红和抗生素的培养基，因为酚红会干扰荧光素酶检测，而抗生素会增加转染过程中的细胞毒性。
<ol>
	<li>对于每个待筛选的文库板，将胰蛋白酶消化后的293T细胞用含14%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基重悬，调整细胞浓度至1.5 × 105 个细胞/mL。倒入无菌储液槽（Axygen）中。</li>
	<li>将储液槽、2&#160;个平底96孔板（Corning）以及一盒滤芯吸头（Agilent）放置于机器人工作台。向每块板的每个孔中加入100 μL细胞悬液，使每孔细胞密度为1.5 × 104 个细胞。</li>
	<li>以50 ×&#160;g离心细胞板2分钟，使用低加速度升速模式，以确保各孔中细胞分布均匀。随后在37 °C、10% CO2 条件下过夜培养。</li>
	<li>将萤光素酶（firefly）和Renilla报告基因质粒用无血清培养基稀释至5 ng/μL。按体积比5:3将萤光素酶质粒与Renilla质粒混合，加入15 mL圆底离心管中。</li>
	<li>用移液器将混合后的质粒溶液加入96孔板的各孔中，每块文库板每孔加入17 μL，并额外多加2–10 μL作为余量。</li>
	<li>获取如上所述的转染级DNA文库板，用无内毒素水稀释至13.3 ng/μL。每孔最小体积应为28 μL。</li>
</ol>
3. 进行转染
第2天&#160;将报告质粒和文库DNA转染至293T细胞中。
<ol>
	<li>对于每个文库板，在聚苯乙烯管中将107.5 μl RT Optifect（Invitrogen）与4.3 ml无血清培养基（1:40稀释）混合。室温孵育5分钟，然后将每块文库板44 μl的混合液分配至96孔聚苯乙烯V型底板（Greiner）的每个孔中。</li>
	<li>将稀释后的Optifect板、报告质粒（步骤2.5）、文库DNA（步骤2.6）以及一盒移液吸头放置于机器人操作台上。</li>
	<li>依次吸取17 μl报告质粒、43 μl稀释后的Optifect和26 μl文库DNA，每次吸取之间保留5 μl空气间隔。为防止交叉污染，应最后吸取文库DNA。将吸头中的内容物排入一个新的聚苯乙烯V型底板中，混匀，覆盖后静置20分钟，以形成脂质体/DNA复合物。若需转染多个文库板，则更换移液吸头和文库板，并重复上述操作。</li>
	<li>打开Optifect/DNA混合液板，将其与两块293T细胞板一同置于机器人操作台上。使用同一盒移液吸头，吸取80 μl Optifect:DNA混合液，并缓慢将40 μl分别加入每块细胞板中。若转染多个文库板，需对所有Optifect:DNA板重复此步骤。覆盖细胞板。</li>
	<li>将细胞板在1,200 x&#160;g条件下离心30分钟。覆盖后放回培养箱。</li>
	<li>继续孵育细胞4–6小时。在此期间，为每块转染的文库板配制新鲜培养基：将含10%胎牛血清和10 μg/ml环丙沙星（CellGro）的DMEM培养基12 ml混合均匀，并倒入无菌储液槽中。</li>
	<li>将2&#160;盒机器人用吸头、一块细胞板、装有新鲜培养基的储液槽以及废液槽放置于机器人操作台上。从细胞中吸取100 μl旧培养基，排入预先装有部分70%乙醇的废液槽中。使用新的吸头吸取100 μl新鲜培养基，并缓慢加入细胞板中。对所有细胞板重复此操作。</li>
	<li>将细胞板放回培养箱继续孵育48小时。</li>
</ol>
4. 进行双荧光素酶检测
第4天&#160;屏幕的火萤和 海肾 进行荧光素酶检测。
注意：双荧光素酶检测需要依次加入 2&#160;检测缓冲液，3X 萤光素酶检测缓冲液和 3X 海肾 检测缓冲液，如所述 表3萤火虫和 海肾 荧光素酶不会被分泌，因此在检测荧光素酶活性前必须裂解细胞。萤火虫荧光素酶检测试剂缓冲液可裂解细胞并为萤火虫荧光素酶提供底物。 海肾 检测缓冲液可淬灭萤光素酶信号，并为后续反应提供底物 海肾 荧光素酶
<ol>
	<li>针对每块文库板，按照表3所述方法，从储备液中配制8 ml的3倍浓度萤光素酶检测缓冲液，并向每块96孔V型底板的每个孔中加入82 μl。</li>
	<li>针对每块文库板，同时配制12 ml的3倍浓度Renilla检测缓冲液，并向每块96孔V型底板的每个孔中加入122 μl。将萤光素酶和Renilla检测缓冲液分别放置备用。</li>
	<li>将一盒移液器吸头、废液槽以及2&#160;块细胞板（来自同块文库板的转染细胞）放置于机器人操作台上。</li>
	<li>从每块细胞板中吸取60 μl培养基，并弃入装有部分70%乙醇的废液槽中。盖好细胞板并放置备用。若同时转染多个文库板，请对所有细胞板组重复此步骤。</li>
	<li>将2&#160;盒移液器吸头、盛有3倍浓度萤光素酶检测缓冲液的板以及一组细胞板放置于机器人操作台上。</li>
	<li>吸取40 μl的3倍浓度萤光素酶检测缓冲液，加入第一块细胞板中，并充分混匀。更换新的吸头后，对第二块细胞板重复此操作。将细胞板在室温下放置10分钟，以完成细胞裂解。若同时转染多个文库板，请更换吸头盒和细胞板，并重复上述步骤。</li>
	<li>使用化学发光仪记录每块细胞板各孔的发光信号，每孔记录1秒。记录完成后将细胞板放回机器人操作台。</li>
	<li>将2&#160;盒移液器吸头、盛有3倍浓度Renilla检测缓冲液的板以及一组细胞板放置于机器人操作台上。</li>
	<li>吸取60 μl的3倍浓度Renilla检测缓冲液，加入第一块细胞板中，并充分混匀。更换新的一盒移液器吸头后，对第二块细胞板重复此操作。若同时转染多个文库板，请对所有细胞板组重复此步骤。</li>
	<li>如前所述，使用化学发光仪记录所有细胞板各孔的发光信号，每孔记录1秒。随后弃去细胞板。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>计算萤光素酶：海肾 发光比值（&#34;F:R 比值&#34;每个孔的荧光素酶信号计数除以海肾荧光素酶信号计数 海肾 信号</li>
	<li>通过将每孔的 F:R 比值除以该酶标板的平均 F:R 比值（排除最高和最低 25% 的孔）来计算诱导值。</li>
	<li>对单个转染文库板的重复样本中的诱导值取平均值。将诱导或抑制α-突触核蛋白表达超过三倍的基因视为 &#34;命中&#34; 在此筛选中被识别，需进一步验证和进行二次筛选。</li>
</ol>

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</ol>

本工作得到了通过授权BacMam试剂（美国专利5,731,182）所获得的版税支持。

α-突触核蛋白作为路易小体的组成成分，已被证实与帕金森病（PD）相关4，而路易小体是该疾病的特征性细胞内包涵体。大量全基因组关联研究已将α-突触核蛋白基因中的单核苷酸多态性与散发性帕金森病风险升高相关联5,6,7。尽管家族性帕金森病较散发性帕金森病少见，但其也可能由α-突触核蛋白基因的突变8，以及α-突触核蛋白基因位点的重复或三倍重复所引起9,10,11，这一现象在散发性帕金森病中亦有发现12。综上所述，这些研究进一步强调了α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的核心作用。本项筛选的目的是鉴定调控α-突触核蛋白的基因，从而可能揭示其在帕金森病发病机制中的作用。利用本实验方案，我们对7,670个人类基因进行了筛选，初步鉴定出154个阳性候选基因（至少3倍诱导效应），对应140个独特的基因。这些候选基因随后使用新制备的DNA样本进行二次检测，以评估其可重复性。在后续的荧光素酶检测中，诱导倍数在3倍左右的候选基因可重复率为28%；而在4倍、5倍和5倍以上诱导的候选基因中，可重复率分别提高至59%、69%和78%。诱导效应超过7倍的候选基因...

识别关键遗传调控元件及其作用因子的能力对于探索多种生物过程至关重要。然而，在稀有细胞类型（如特定神经元群体）中鉴定调控基因表达的因子仍具挑战性。本文介绍了一种用于鉴定α-突触核蛋白（SNCA）新型转录调控因子的实验方案，SNCA 是一种与帕金森病相关、在中脑黑质致密部多巴胺能神经元中表达的基因。本方法采用高通量双荧光素酶报告系统， 体外 报告基因筛选用于解析293T细胞中α-突触核蛋白的表达。首先将α-突触核蛋白启动子克隆至含有萤光素酶基因的报告质粒中。使用一种市售质粒，其含有 海肾 在组成型活性启动子控制下的荧光素酶作为内参对照。这些报告基因载体与DNA表达文库中的质粒共同转染至96孔板中的293T细胞，使每个孔仅转染一种文库质粒。转染48小时后，使用双荧光发光检测法依次测定每个报告基因的荧光素酶活性。通过萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值，推断每种文库基因对α-突触核蛋白（alpha-synuclein）表达的相对调控作用。海肾 经基于孔板的标准化后，每孔的荧光素酶活性（F:R 比值）。
本方案能够以最少的人力（1-2人）和最低的成本（每块微孔板检测的试剂成本约为3美元），每周筛选大量基因（约2,500个），评估其激活报告基因表达的能力。该方法适用于筛选神经元基因的转录调控因子。例如α-突触核蛋白）在难以进行遗传操作的培养神经元中难以研究，而本直接功能检测方法可实现两者的并行比较。我们在本方案中提供了包含α-突触核蛋白启动子的质粒的克隆与培养的详细步骤，因为我们发现含有该区域的质粒在常规培养条件下不稳定（见讨论部分）。此外，我们还提供了一种低成本的替代方案，用于替代商业化的双荧光素酶检测试剂，适用于高通量检测。本方案可轻松调整，用于靶向其他感兴趣的调控元件，或适用于任何需要高通量瞬时转染的实验过程。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>PureLink 快速凝胶回收试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-12</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR 微量纯化试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K310250</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure 质粒小量提取试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-03</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure 质粒大量提取试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 机器人</td><td>Agilent</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯的机器人移液吸头</td><td>Agilent</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>不带滤芯的机器人移液吸头</td><td>Agilent</td><td>19477-002</td><td></td></tr><tr><td>透明底 96 孔板</td><td>Corning</td><td>3610</td><td></td></tr><tr><td>储液槽</td><td>Axygen</td><td>RES-SW96-HP-SI</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯 V 型底 96 孔板</td><td>Greiner</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯 V 型底 96 孔板</td><td>Greiner</td><td>651201</td><td></td></tr><tr><td>粘性板盖</td><td>CryoStuff</td><td>#FS100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Phusion DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>BAC 2002-D6</td><td>Invitrogen</td><td>2002-D6</td><td></td></tr><tr><td>小牛肠碱性磷酸酶</td><td>Roche</td><td>10713023001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E6931</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX Stbl4 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>11635-018</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的 DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Optifect</td><td>Invitrogen</td><td>12579017</td><td></td></tr><tr><td>环丙沙星</td><td>CellGro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>Tris-盐酸粉末</td><td>Sigma</td><td>93287</td><td></td></tr><tr><td>Tris-碱粉末</td><td>Sigma</td><td>93286</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 纯液体</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>C&amp;#8211;nzyme A</td><td>Nanolight</td><td>309</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>荧光素</td><td>Invitrogen</td><td>L2912</td><td></td></tr><tr><td>h-CTZ</td><td>Nanolight</td><td>301</td><td></td></tr><tr><td>PTC124</td><td>SelleckBiochemicals</td><td>S6003</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量功能筛选：使用自制双发光荧光素酶检测法

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

我们介绍了一种快速且低成本的高通量筛选方案，用于鉴定与帕金森病相关的α-突触核蛋白基因的转录调控因子。将293T细胞在96孔板中以每孔一个基因的形式，瞬时转染自阵列化ORF表达文库的质粒以及荧光素酶报告质粒。转染48小时后检测萤火虫荧光素酶活性，以评估文库中每个基因对α-突触核蛋白转录的影响，并以内部对照质粒（驱动Renilla荧光素酶表达的人巨细胞病毒hCMV启动子）的表达水平进行归一化。该方案由置于生物安全柜内的台式机器人完成，可在96孔板中执行无菌液体处理操作。我们的自动化转染流程可轻松适用于高通量慢病毒文库制备，或其他需要将大量独特文库质粒与一组共用辅助质粒进行三重共转染的功能筛选实验。此外，我们还提供了一种经济且经过验证的替代方案，取代商业化的双荧光素酶检测试剂，该方法利用PTC124、EDTA和焦磷酸盐在检测Renilla荧光素酶活性前抑制萤火虫荧光素酶活性。利用这些方法，我们筛选了7,670个人类基因，鉴定了68个α-突触核蛋白的调控因子。本方案易于修改，可用于靶向其他感兴趣的基因。

单个半板典型的荧光素酶值、F:R 比值及诱导值如图所示 图4注意 H2 孔中的阳性结果，为 32 倍诱导。导致毒性过强的基因（例如 E3 孔）或转染效果较差的孔，将导致萤光素酶和海肾荧光素酶的检测值均较低。 海肾 荧光素酶，但为平均诱导值。某些基因可能导致荧光素酶活性的非特异性诱导，或许 通过 与pGL4骨架的相互作用将诱导荧光素酶和 海肾 荧光素酶的表达水平相等，从而得到平均诱导值。若重复样本间的诱导值存在较大差异，则应怀疑实验操作中存在错误。重要的是要确认筛选实验在报告基因检测的线性范围内进行，以确保引起表达升高的克隆能够被准确反映为荧光素酶活性的增加。我们转染了不同浓度的每种报告基因，以验证在本实验条件下报告基因检测的线性关系。图5）。孵育步骤后也应尽快进行检测，以避免因底物耗尽导致的非线性结果。我们在加入试剂后1小时内均观察到显著的萤火虫荧光素酶活性。图6).
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我们介绍一种快速且低成本的筛选方法，通过高通量机器人转染和自制的双荧光素酶检测技术来鉴定转录调控因子。该方案可快速获得数千个基因的直接平行功能数据，并可轻松修改以靶向任何感兴趣的基因。

我们提出了一种快速、低成本的高通量筛选方案，用于鉴定与α-突触核蛋白（alpha-synuclein）基因相关的转录调控因子，该基因与……相关

本实验的总体目标是利用一种简单的高通量转染方案和自制的双荧光素酶检测方法，鉴定任意目的基因的转录调控因子。首先设计并克隆一系列独特的双荧光素酶报告质粒，然后将这些报告质粒与DNA表达文库中的质粒共同转染至96孔板中的293T细胞中，使每孔仅转染一种文库质粒。48 小时后，检测萤光素酶活性，随后检测香草素酶活性。最后一步是计算萤光素酶与香草素酶活性的比值。最终得到目的基因在每种文库作用下的相对诱导水平。基因的推断基于每个孔在基于孔板归一化后，海肾荧光素酶与香草荧光素酶活性的比值。该技术相较于现有报告基因检测方案的主要优势在于，能够以最少的人力和成本快速获得大量基因的功能数据。在转染前一日，即筛选的第一天，将293T细胞接种至96孔板中。将细胞进行计数并调整浓度，使细胞悬液浓度为每毫升1.5 × 10⁵个细胞。在含有14%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中重悬细胞后，将其倒入无菌储液槽中。将储液槽、六个透明平底96孔板以及一盒带滤芯的移液器吸头放置于自动液体处理系统的机器人工作台上。每个待筛选的文库板应准备两块细胞板。每块板的每个孔中加入100微升细胞，使细胞密度达到每孔1.5 × 10⁴个细胞。本演示中将筛选三块文库板。因此，准备六块细胞培养板，在50 × g条件下以低加速度离心2分钟，以确保每孔中的细胞密度均匀。此图像展示了细胞板在离心后应有的形态。将细胞在37°C和10%二氧化碳条件下孵育过夜。为制备萤光素酶和香草素报告质粒，将每种质粒用无内毒素水稀释至每微升含5纳克，置于15毫升锥形管中。按体积比5:3混合萤光素酶与香草素质粒的稀释液。用移液器将混合后的质粒加入96孔板的每孔中，每块文库板加17微升，并在每孔中额外加入2至10微升，用于在筛选第二天进行细胞转染。对于每块文库板，首先在聚苯乙烯管中将107.5 µL室温下的OptiPrep缺陷液与4.3 mL无血清培养基混合，配制成1:40稀释液，在室温下孵育5分钟，然后将44 µL混合液分别加入96孔聚苯乙烯V型底板的每个孔中。将文库DNA板、稀释后的OptiPrep板、报告质粒板以及一盒移液器吸头放置于机器人操作台上。依次吸取17 µL报告质粒、43 µL稀释后的OptiPrep溶液和26 µL文库DNA，在每次吸取之间插入5 µL的空气间隙。应最后吸取文库DNA，以防止交叉污染。将枪头中的内容物加入新的聚苯乙烯V型底板中，盖上盖子并静置20分钟，使脂质体-DNA复合物形成。若需转染多个文库板，在20分钟后更换移液枪头和文库板并重复操作，打开opt effect DNA混合板，将其与两板293T细胞一同放置于机器人载台上，使用同一盒移液枪头操作。吸取80微升光遗传效应DNA混合物，每孔缓慢加入40微升，用于每块细胞培养板。在所有培养板的细胞中加入光遗传效应DNA混合物后，盖好细胞培养板。将培养板在1,200 ×g 条件下离心30分钟。将培养板放回培养箱，继续培养细胞 4 至 6 小时。在此期间，通过混合含有 10% FBS 和 10 µg/mL 环丙沙星的 12 mL DMEM 制备新鲜培养基。对于每块转染文库板，将新鲜培养基倒入无菌储液槽中。接下来，将两盒机器人吸头、一块细胞培养板、含有新鲜培养基的储液槽以及废液储液槽放置到机器人工作台上。然后，从细胞中吸取100 µL培养基，并排入已部分装有70%乙醇的废液储液槽中。使用新的吸头吸取100 µL新鲜培养基，缓慢加入细胞中。将培养板放回培养箱中孵育48小时。随后进行萤火虫荧光素酶和香草荧光素酶检测。在筛选的第四天，即转染后48小时，针对每块文库板，分别从相应的储备液中配制8毫升3倍萤火虫检测缓冲液和12毫升3倍香草检测缓冲液；将82微升萤火虫检测缓冲液加入每块待检测文库板的96孔V型底板的每个孔中。同样，将122微升香草测定缓冲液分别加入另一块96孔V型底板的每个孔中。对于每一块待测定的板，均需预留两种测定缓冲液。在机器人操作台上放置一盒移液器吸头、一个废液储槽，以及来自同一文库板的两块转染细胞板，从每块板中吸取60微升培养基，并弃入预先加入70%乙醇的废液储槽中，然后盖上板盖并暂置一旁。接下来，在机器人工作台上放置两盒移液器吸头、三份萤光素酶检测试剂缓冲液以及一组细胞培养板。吸取40 µL三倍浓度的萤光素酶检测试剂缓冲液，加入第一块细胞培养板中，并充分混匀。更换新的移液器吸头，对第二块细胞培养板重复上述操作。将细胞在室温下放置 10 分钟，以完成裂解。使用光度计记录每块细胞板每个孔的发光信号，每孔记录1秒钟。将板放回机器人工作台。在机器人工作台上放置两盒移液器吸头、三倍体积的检测试剂缓冲液板以及一组细胞板。吸取 60 微升三倍香草素检测试剂缓冲液，加入第一块细胞培养板中。充分混匀。更换新的移液器吸头盒。对第二个细胞板重复上述操作。使用光度计记录所有板的发光信号，每个孔记录一秒钟。这些表格展示了单个半板典型的荧光素酶值。每孔的萤火虫荧光与海肾荧光的比值（即 F2R 比值）通过将萤火虫信号计数除以海肾信号计数计算得出，结果如图 C 所示。图 D 显示了每孔的诱导值，该值通过将每孔的 F2R 比值除以整块板的平均 F2R 比值（排除最高和最低 25% 的孔）计算得出。对于单个转染文库板，诱导值应在重复孔之间取平均值。诱导或抑制α-突触核蛋白表达超过三倍的基因为有效命中。请注意，在此代表性结果中，H2孔显示出32倍的诱导作用，该图展示了单个孔板的诱导值，其中H2孔以蓝色高亮显示。Hi.H2是一种神经元转录因子，此前未发现其与α-突触核蛋白表达相关。重要的是要验证实验在报告基因检测的线性范围内进行，以确保导致表达升高的克隆能够被准确测量为荧光素酶活性的增加。为此，细胞被转染了不同递增量的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶质粒，这些质粒由强效的H-C-M-V-I-E启动子驱动，并进行检测。通过该方案观察到，萤火虫荧光素酶活性在较宽的数值范围内保持线性，而海肾荧光素酶活性在每孔超过15纳克时曲线趋于平缓。孵育步骤后也应及时进行检测，以避免因底物耗尽导致的非线性结果。采用本方案，在添加试剂后长达一小时内的萤光素酶活性检测信号衰减时间进程显示，萤光素酶活性仍保持显著水平。在本研究展示的代表性结果中，共筛选了 7,670 个人类基因，最终鉴定出 68 个新的 α-突触核蛋白调控因子。每条水平线代表单个基因的诱导倍数，相对于对照的 GFP 中性诱导剂。蓝色线条代表阳性诱导物，而唯一的红色线条代表抑制物。诱导值的计算方法是：以每个命中化合物处理下，α-突触核蛋白启动子驱动的萤火虫荧光素酶活性与CMV启动子驱动的ran荧光素酶活性的比值，再相对于使用GFP诱导物的相同荧光素酶构建体检测进行归一化。在此基础上，可进一步采用定量PCR以及过表达和敲低实验等其他方法，以确认所鉴定的命中化合物是否调控内源性靶标。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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