代高通量测序技术（ChIP-seq的高品质的染色质免疫沉淀DNA模板）
April 19th, 2013
染色质免疫沉淀和超高通量测序（芯片起）的组合可以识别并映射在一个给定的组织或细胞系的蛋白质-DNA相互作用。概述是如何产生一个高质量的ChIP随后的测序模板，使用的经验，例如转录因子TCF7L2。
该程序的总体目标是通过染色质鉴定蛋白质结合区域。这是通过首先将蛋白质与 DNA 交联来实现的。第二步是剪切 DNA。
接下来，DNA 结合的靶蛋白被免疫沉淀，然后被暗示。最后一步是逆转交联并分离 DNA。最终，染色质免疫沉淀用于显示蛋白质结合在整个基因组中的定位。
这种方法可以帮助回答功能基因组学领域的关键问题，例如识别和绘制给定组织或细胞系中的蛋白质 DNA 相互作用，该程序的细胞在 100 x 20 毫米的细胞培养皿中生长。细胞数量从每个培养皿 1 个细胞到 1000 万个细胞不等，具体取决于细胞类型。大约 200 万个细胞足以进行一次免疫沉淀，使细胞中的蛋白质和染色质交联。
添加甲醛至 1%，在室温下孵育 10 分钟，加入甘氨酸至终浓度为 125 毫摩尔，偶尔进行摇摆淬火交联，并孵育 5 分钟。在室温下，第二次洗涤后用 1 x 磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次，倒出 PBS 并用塑料细胞刮刀将 0.2 毫升新鲜 PBS 收获细胞加入微量离心管中。在 4 摄氏度下以 2000 RPM 的速度离心细胞 5 分钟。
吸出上清液以进行核提取。将细胞作为沉淀保存以制备全细胞裂解物，这将在下一部分进行演示。Resus 悬浮细胞在 SDS 裂解缓冲液中通过在湿冰上超声处理从交联细胞制备全细胞裂解物。
使用 My ator 为了获得理想的 DNA 片段大小，必须通过尝试不同的超声处理条件来优化该程序。在整个过程中，样品必须保持在冰上。在这些设置下对每个样品进行超声处理，振幅设置为 2，开 30 秒，关 45 秒。
在本例中，需要 12 个循环才能获得理想的片段大小。每个样品收集 20 μL 以检查超声处理结果和定量。样品的其余部分可以储存在零下 80 摄氏度。
通过添加 30 μL 0.1 XTE 缓冲液稀释 20 μL 样品。然后在 37 摄氏度下用 1 微升 RNA A 处理样品 1 小时。接下来，加入 1 微升蛋白酶 K，并在 62 摄氏度下孵育 2 小时。
蛋白酶 K 处理后，在 2% agros 凝胶上运行 20 微升样品。样品应呈现一条弥散条带，其中大部分 DNA 具有所需大小。如果测试了几个不同的周期，则应看到大小逐渐减小。
随着循环次数的增加，剩余样品量将用 kaya 快速 PCR 纯化试剂盒纯化，并使用 TER 的 NanoDrop 光谱进行定量以开始此过程。Fava 在冰上超声处理染色质样品，在 4 摄氏度下以 12， 000 RPM 离心 10 分钟。立即冰敷。
去除 SDS，它显示为白色颗粒。收集上清液并从每个样品中丢弃沉淀。如有必要，合并样品，根据先前的计算留出实验所需的量。
每次免疫沉淀需要 1 至 10 μg 染色质。将添加有蛋白酶抑制剂的染色质稀释 1 至 10 inchi 稀释缓冲液。每次免疫沉淀添加 100 μL 阻塞的 aro 速度，并在 4 摄氏度下旋转 1 小时。
通过在 4 摄氏度下以 800 RPM 离心样品 1 分钟，然后将每个上清液转移到新试管中来开始染色质免疫沉淀程序。将上清液以 800 RPM 离心 1 分钟，然后转移到另一根干净的试管中。在负 20 摄氏度下保存 20 微升上清液作为输入对照。
然后将其余染色质分装至实验所需的免疫沉淀数。对于每个样品，每 1 至 10 μg 染色质添加 2 μg 抗体，在 4 摄氏度下旋转孵育过夜第二天早上，向每个免疫沉淀样品中加入 100 μL 封闭的 aros 珠子。在 4 摄氏度下孵育 1 小时，1 小时后旋转。
以 800 RPM 的速度旋转 1 分钟，使珠子沉淀。丢弃尽可能多的上清液。洗涤珠子。
使用低盐免疫复合物洗涤缓冲液后，向每个试管中加入 1 毫升缓冲液。在室温下旋转 5 到 8 分钟，然后在丢弃上清液洗涤珠后以 800 RPM 离心 1 分钟，用高盐免疫复合物洗涤缓冲液离心一次，用氯化锂、免疫复合物洗涤缓冲液离心一次，用 TE 缓冲液离心两次，总共洗涤 5 次。随后，从每个免疫沉淀样品和输入样品中引入 DNA。
为了反转交联，将 8 微升 5 摩尔氯化钠添加到 200 微升每个 elu 和起始对照中。用 param 密封试管，并在 65 摄氏度的水浴中孵育过夜。第二天，用 1 微升 RNA 处理每个样品，在 37 摄氏度下处理 1 小时。
一小时后，向每个样品中加入 4 微升 0.5 摩尔 EDTA 和 8 微升 1 摩尔 tris HCL 并混合。然后加入 1 微升蛋白酶 K，在 45 摄氏度下孵育 2 小时。使用 kaya 快速 PCR 纯化试剂盒纯化样品。
样品可以保存在零下 20 摄氏度，直到通过 PCR 检查。染色质免疫沉淀的富集可以通过 PCR 或实时 PCR 检查对于 PCR 样品，电参考 agros 凝胶，使用目标蛋白质的抗体在输入和芯片样品泳道中应有条带，在这种情况下是转录因子 TCF 7 L 2。相反，阳性结合区的 IgG 阴性对照泳道中应该没有或最多有一个非常微弱的条带。
对于负性结合区。IgG 对照泳道和芯片泳道应该有一个非常微弱的条带或根本没有条带。input lane中应该有一个频段。
该图显示了通过实时荧光定量 PCR 检测的相同样品的结果。与之前的结果一样。与 IgG 对照相比，芯片样品的阳性结合区应该有显著的倍数富集。
此外，阴性结合区中的富集（如果有）应该非常少。观看此视频后，您应该对如何将结合蛋白与组织或细胞系中的染色质交联，以及沉淀目标蛋白的含义，然后分离 DNA 进行进一步分析有一个很好的了解。
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概览
本文概述了一种使用染色质免疫沉淀（ChIP）来识别蛋白质结合区域的程序。该方法包括将蛋白质与DNA交联、DNA剪切、蛋白质-DNA复合物的免疫沉淀以及DNA的分离用于测序。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因组学
- 分子生物学
背景
- 染色质免疫沉淀是一种用于研究蛋白质-DNA相互作用的技术。
- ChIP-seq允许对这些相互作用进行高通量测序。
- 了解蛋白质结合对于阐明基因调控至关重要。
- TCF7L2在这项研究中作为模型转录因子。
研究目的
- 识别并绘制特定组织或细胞系中的蛋白质-DNA相互作用。
- 生成高质量的ChIP模板用于测序。
- 以TCF7L2为例，展示ChIP-seq的适用性。
使用的方法
- 将蛋白质与DNA交联以稳定相互作用。
- 剪切DNA以创建可管理的片段。
- 免疫沉淀蛋白质-DNA复合物以分离目标。
- 逆转交联并分离DNA用于测序。
主要结果
- 成功识别了全基因组中的蛋白质结合区域。
- 证明了ChIP-seq方法的有效性。
- 提供了关于TCF7L2结合定位的洞见。
- 为未来的蛋白质-DNA相互作用研究建立了协议。
结论
- ChIP-seq是研究基因调控的强大工具。
- 该方法可以应用于TCF7L2之外的各种转录因子。
- 未来的研究可以在此协议基础上探索其他蛋白质-DNA相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-quality ChIP-seq DNA template generation is foundational for mapping genome-wide protein-DNA interactions, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Reliable identification of transcription factor binding sites, such as TCF7L2, enables predictive confidence in gene regulation studies and informs portfolio triage for complex disease targets. This workflow supports scalable, reproducible insights essential for advancing discovery-stage assets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables genome-wide mapping of transcription factor binding for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying direct regulatory interactions in disease-relevant cell lines.
- Provides high-resolution data to inform predictive confidence and early portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated DNA templates for downstream sequencing and quantitative analysis.
- Facilitates assay reproducibility through standardized chromatin preparation and immunoprecipitation controls.
- Enables robust screening of protein-DNA interactions across multiple conditions or compounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein-DNA interaction data with disease-relevant models, such as colorectal carcinoma cell lines.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by linking transcription factor binding to gene regulation in pathogenesis.
- Provides a platform for biomarker identification and mechanistic studies in translational research.
Pipeline & Workflow Integration
This ChIP-seq DNA template generation method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven mapping of protein-DNA interactions for pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative DNA templates for high-throughput sequencing and comparative analysis.
- Analytics: Supports quantitative PCR and sequencing readouts to compare binding enrichment across conditions.
- Translational Research: Connects transcription factor binding data to disease models for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes chromatin preparation and immunoprecipitation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on direct regulatory evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biology, immunoprecipitation, and sequencing workflows.
- Demands access to high-quality antibodies, cell culture, and sequencing infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample preparation and controls.
- Adaptable to various cell lines and transcription factors with protocol optimization.
- Dependent on quantitative validation steps, such as PCR and sequencing, for quality assurance.
