Name: 代高通量测序技术（ChIP-seq的高品质的染色质免疫沉淀DNA模板） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学习染色质免疫沉淀技术以制备高品质ChIP-seq测序模板，用于识别TCF7L2等转录因子在全基因组中的蛋白结合区域。该方法结合甲醛交联、超声破碎和免疫沉淀步骤，为功能基因组学研究提供可靠的蛋白-DNA相互作用分析方案。

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本工作获得了费城儿童医院研究所发展奖的支持。

1. 交联染色质
<ol>
 <li>在100×20 mm细胞培养皿中培养细胞。每皿细胞数量可根据细胞类型在100万至1000万个之间调整。每次免疫沉淀约需200万个细胞。</li>
 <li>在室温下用1%甲醛固定细胞10分钟，期间偶尔轻轻摇动。</li>
 <li>加入甘氨酸至终浓度为125 mM，以终止交联反应，并在室温下孵育5分钟。</li>
 <li>用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞两次，倾去PBS，然后加入0.2 ml PBS。</li>
 <li>使用塑料细胞刮刀将细胞刮下，并转移至微量离心管中。</li>
 <li>在4 °C下以2,000 rpm离心5分钟，沉淀细胞。</li>
 <li>吸除上清液。如需制备全细胞裂解液，则用SDS裂解缓冲液（1% SDS、10 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8.1）重悬细胞；如需进行核提取，则可将细胞沉淀保存备用。</li>
 <li>细胞沉淀可于-80 °C保存，或立即进行超声破碎处理。</li>
</ol>
2. 准备细胞核（如需制备全细胞裂解液，请转至步骤 3.5）
<ol>
 <li>每次实验时，在细胞裂解缓冲液（5 mM PIPES pH 8.0，85 mM KCl，0.5% NP-40）中添加1倍浓度的蛋白酶抑制剂。</li>
 <li>用约等于细胞沉淀体积10倍的细胞裂解缓冲液重悬解冻后的细胞沉淀。</li>
 <li>用Dounce匀浆器研磨10次，然后在冰上孵育10分钟。</li>
 <li>在4 °C下以4,000 rpm离心5分钟，弃上清，保留核沉淀。</li>
</ol>
3. 超声处理*
<ol>
 <li>预热 SDS 裂解缓冲液，并向将要使用的缓冲液体积中添加蛋白酶抑制剂。</li>
 <li>用 SDS 裂解缓冲液重悬核沉淀（每 1,000 万至 1,000 万个细胞约使用 0.5 ml 缓冲液）。</li>
 <li>冰上孵育 10 分钟。</li>
 <li>将 0.5 ml 的样品分装至微量离心管中。</li>
 <li>在冰水浴中使用 Misonix 超声破碎仪进行超声处理，设置振幅为 2，工作 30 秒，间歇 45 秒。为获得理想的片段大小，可先尝试不同循环次数（例如 2、4、8、12、16 或 20 次及以上）以确定最佳循环数。若使用其他品牌的超声破碎仪，条件可能不同，需通过实验优化循环次数以及工作与间歇时间，以确定最佳条件。</li>
 <li>取每份样品 20 μl 用于检测超声效果及定量分析，其余样品可储存于 -80 °C。</li>
 <li>向 20 μl 样品中加入 30 μl 0.1X TE 缓冲液进行稀释。</li>
 <li>加入 1 μl RNase A，在 37 °C 处理 1 小时，随后加入 1 μl Proteinase K，在 62 °C 孵育 2 小时。</li>
 <li>取 20 μl 样品在 2% 琼脂糖凝胶上电泳。</li>
 <li>使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒对剩余样品进行纯化，然后用 NanoDrop 分光光度计进行定量。</li>
</ol>
*对于天然染色质免疫沉淀（ChIP），可使用微球菌核酸酶消化法作为替代方法来剪切DNA。
4. 封闭琼脂糖珠*
<ol>
 <li>如果磁珠已封闭，请直接进行步骤 5.1。</li>
 <li>使用 Protein A 或 Protein G 琼脂糖。对于 5 次免疫沉淀（IP），使用 600 μl 的 50% 磁珠悬液（300 μl 磁珠沉淀）。</li>
 <li>洗涤磁珠时，在 4 °C 下以 800 rpm 离心 1 分钟，弃上清液。加入略多于 2 ml 的 ChIP 稀释缓冲液（0.01% SDS、1.2 mM EDTA、167 mM NaCl、1.1% Triton X-100、16.7 mM Tris-HCl pH 8.1），通过缓慢倒置离心管 10 次混匀。再次在 4 °C 下以 800 rpm 离心 1 分钟，弃上清液。重复此洗涤步骤 2 次。</li>
 <li>在封闭溶液中 4 °C 旋转孵育过夜以封闭磁珠。封闭溶液的配方见表 1。</li>
</ol>
5. 预清除染色质
<ol>
 <li>将超声处理的染色质在冰上解冻。</li>
 <li>在 4 °C 下以 12,000 rpm 离心 10 分钟，然后立即置于冰上以去除 SDS（白色沉淀）。</li>
 <li>收集上清液，弃去沉淀，必要时合并样品。</li>
 <li>根据计算结果取出实验所需的染色质量（每次免疫沉淀使用 1–10 μg 染色质）。</li>
 <li>用含有蛋白酶抑制剂的 ChIP 稀释缓冲液将染色质稀释 10 倍。</li>
 <li>每次免疫沉淀加入 100 μl 预封闭的磁珠。</li>
 <li>在 4 °C 下旋转孵育 1 小时。</li>
</ol>
6. 免疫沉淀
<ol>
 <li>将样品在800 rpm下离心1分钟，然后将上清液转移至新的离心管中。</li>
 <li>将上清液在800 rpm下离心1分钟，然后转移至另一干净的离心管中。</li>
 <li>取20 μl上清液作为输入对照，保存于-20 °C。</li>
 <li>根据实验中要进行的免疫沉淀（IP）数量，将染色质分装至相应份数。</li>
 <li>每1–10 μg染色质中加入2 μg抗体至各样品中。</li>
 <li>4 °C条件下旋转孵育过夜。</li>
 <li>向每个免疫沉淀样品中加入100 μl封闭的磁珠。</li>
 <li>4 °C条件下旋转孵育1小时。</li>
 <li>在800 rpm下离心1分钟使磁珠沉淀，并尽可能弃去上清液。</li>
 <li>用低盐免疫复合物洗涤缓冲液洗涤磁珠一次：每管加入1 ml缓冲液，室温旋转5–8分钟，800 rpm离心1分钟，弃去上清液。随后依次用高盐免疫复合物洗涤缓冲液、LiCl免疫复合物洗涤缓冲液各洗涤一次，并用TE缓冲液洗涤两次，共洗涤5次（表2）。</li>
</ol>
7. 洗脱
<ol>
 <li>将前一日的输入样品解冻，以便与洗脱液一同处理。</li>
 <li>新鲜配制洗脱缓冲液（表3）。</li>
 <li>配制足够量的洗脱缓冲液主混合液，用于IP样品和输入对照样品，并额外多准备1-2份样品的量。</li>
 <li>向每个IP样品中加入100 μl洗脱缓冲液，在室温下旋转孵育15分钟。</li>
 <li>以800 rpm离心1分钟，将上清液转移至新离心管中。</li>
 <li>向每管磁珠中再加入100 μl洗脱缓冲液，在室温下旋转孵育15分钟。</li>
 <li>孵育后涡旋振荡15秒；以5,000 rpm离心1分钟，然后将上清液与第一次洗脱的上清液合并。（确保上清液中无残留磁珠。若不确定，可将上清液再次以5,000 rpm离心1分钟，并将上清液收集至新的离心管中。）</li>
 <li>向20 μl输入对照样品中加入180 μl洗脱缓冲液。</li>
</ol>
8. 反向交联
<ol>
 <li>向200 μl洗脱液和输入对照中加入8 μl 5 M NaCl。</li>
 <li>用封口膜密封管子，并在65 °C水浴中孵育过夜。</li>
</ol>
9. DNA 纯化
<ol>
 <li>每个样品加入 1 μl RNase A，37 °C 下处理 1 小时。</li>
 <li>每个样品中加入 4 μl 0.5 M EDTA 和 8 μl 1 M Tris-HCl，混匀，然后加入 1 μl 蛋白酶 K，45 °C 下孵育 2 小时。</li>
 <li>使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化样品。样品可在 -20 °C 保存，PCR 检测可于后续日期进行。</li>
</ol>
*或者，免疫沉淀步骤中可使用适用于染色质免疫沉淀的磁珠替代琼脂糖。
10. PCR 检测
<ol>
 <li>进行PCR检测时，使用针对已知被目标蛋白结合的区域的引物。同时，使用针对非结合区域的引物作为阴性对照。</li>
 <li>配制反应所需的试剂。将Input样品按1:100稀释（表3）。</li>
 <li>运行反应。PCR程序：</li>
</ol>
步骤 1： 94 °C 3 分钟
步骤 2： 94 °C 20 秒 
59 °C 30 秒 
72 °C 30 秒 
（重复步骤 2 至少 30 个循环）
步骤 3：72 °C 2 分钟
<ol start="4">
 <li>在1%琼脂糖凝胶上电泳样品。</li>
 <li>也可通过实时PCR定量测定富集程度。</li>
</ol>

<ol><li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li>
<li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+STAT+nuclear+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li>
<li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li>
<li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li>
<li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+the+message+across%2C+STAT%21+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li>
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<li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations%3A+The+DiaGen+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF7L2%3A+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li>
<li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+TCF7L2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet.+Med%22%5BJournal%5D)">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li>
<li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+suspect%3A+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li>
<li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li>
<li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+TCF-4+gene+%28TCF7L2%29+to+human+chromosome+band+10q25.3%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li>
<li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li>
<li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li>
<li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li>
<li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

现在可以利用ChIP-seq技术对蛋白质-DNA相互作用进行全基因组范围的分析，这一点已在其他转录因子的研究中得到最新证实2,3。成功测序的关键在于获得高质量的染色质免疫沉淀DNA模板。
一旦生成DNA模板并确认其已充分富集，便可将其用于文库制备，以进行后续测序。例如，可采用测序仪供应商Illumina提供的文库制备方案。该文库的片段大小选择可通过凝胶电泳实现，随后切取并纯化大小约为200至700 bp的DNA片段。缩小从凝胶纯化中回收的DNA片段大小并收窄其范围，旨在提高ChIP-seq的定位分辨率。通过富集与目标因子结合的较小DNA片段，预期可提升结合位点的定位精度。更严格的大​​小选择还有助于提高Illumina测序平台上分子簇（colony）的大小均一性，而这种均一性可增加有效测序读长的数量。此外，较短的DNA输入片段在Illumina平台上可形成更稳定的分子簇，这意味着在给定样本的DNA片段分布中，较短的DNA片段在最终测序结果中的代表性可能高于较长的片段。
用于“下一代”测序分析的生物信息学方...

长期以来，人们一直迫切需要确定特定蛋白质在全基因组范围内结合并调控的基因集合，尤其是转录因子类蛋白质所调控的基因。
Odom 等1 采用染色质免疫沉淀（ChIP）结合启动子微阵列的方法，系统性地鉴定了人类肝脏和胰岛中由预先指定的转录调控因子占据的基因。随后，Johnson 等2 开发了一种基于直接超高通量DNA测序的大规模染色质免疫沉淀检测方法（ChIP-seq），以全面绘制整个哺乳动物基因组范围内的蛋白质-DNA相互作用图谱。作为验证案例，他们绘制了神经元限制性沉默因子（NRSF）在人类基因组中1946个位点的体内结合图谱。该数据对结合位置的分辨率极高（±50 个碱基对），有助于顺式作用元件的分离以及NRSF结合基序的鉴定。这些ChIP-seq数据还具有高灵敏度、高特异性和统计学置信度（P &lt; 10−4），这些特性对于推断新的候选相互作用至关重要。
Robertson 等人3 还使用了ChIP-seq技术，以绘制干扰素-γ（IFN-γ）刺激和未刺激的人类HeLa S3细胞中STAT1靶点的分布图谱 体内通过ChIP-seq分析，利用1510万和1290万条唯一比对的序列读长，并以低于0.001的假发现率估算，研究者分别在刺激和未刺激细胞中鉴定出41,582个和11,004个潜在的STAT1结合区域。在已知含有STAT1干扰素响应结合位点的34个基因座中4-8ChIP-seq 检测到24个（71%）。ChIP-seq 的靶序列在已知 STAT1 结合基序相似的序列中显著富集。与两组现有的 ChIP-PCR 数据集比较表明，ChIP-seq 的敏感性介于70%至92%之间，特异性至少为95%。此外，显然 ChIP-seq 具有较低的分析复杂性，且其敏感性随测序深度增加而提高。
因此，“下一代”基因组测序技术相比传统技术，可在成本效益相当的情况下将可生成的序列数据量提高1到2个数量级9。ChIP-seq 方法因而能够直接提供全基因组覆盖，从而有效分析哺乳动物的蛋白质-DNA 相互作用3。
2006年，转录因子7样2（TCF7L2）基因的变异被发现与某种疾病存在强关联TCF7L2) 基因与2型糖尿病之间的关联被发现10其他研究者已在不同种族群体中独立地重复验证了这一发现，有趣的是，该发现源自首批发表的2型糖尿病全基因组关联研究 自然11,12, 科学13-15 及其他地方16,17，最强的关联确实与 TCF7L2；这目前被认为是2型糖尿病领域迄今为止最重要的遗传学发现18-20此外，TCF7L2 已被证实与癌症风险相关 21,22；事实上，当全基因组关联研究揭示出8q24位点与包括结直肠癌在内的多种癌症相关时，这种关联变得更加明显，该位点的作用被证实是由于一个远端上游的TCF7L2结合元件驱动了转录过程 MYC23,24因此，人们非常关注确定由这一关键转录因子调控的下游基因。
以TCF7L2为例说明该方法学，本文概述了如何制备高质量的ChIP DNA模板。在结直肠癌细胞系HCT116中进行ChIP实验，随后进行测序，旨在构建TCF7L2结合基因的高分辨率图谱，以进一步揭示其在复杂性状发病机制中的关键作用25。

<table><tbody><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ChIP 试剂盒</td><td>Millipore</td><td>17-371</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Hot Start 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M5001</td><td></td></tr><tr><td>Misonix 超声破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>XL-2000</td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 分光光度计 </td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;阳性对照引物序列（TCF7L2-1）&lt;/strong&gt; &lt;br/&gt; 正向引物：5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' &lt;br/&gt; 反向引物：5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;阴性对照引物序列（CTRL-1）&lt;br/&gt; &lt;/strong&gt;正向引物：5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3' &lt;br/&gt; 反向引物：5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td></tr></tbody></table>

高质量染色质免疫沉淀dna模板的制备用于高通量测序（chip-seq）

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-测序（ChIP-seq）方法可直接提供全基因组覆盖，通过结合染色质免疫沉淀（ChIP）与大规模并行测序，可用于鉴定转录因子结合的哺乳动物DNA序列集合 体内“下一代”基因组测序技术相比传统技术，能够在成本效益相当的情况下将测序通量提高1至2个数量级，从而使得ChIP-seq方法可直接实现全基因组覆盖，有效解析哺乳动物蛋白质与DNA的相互作用。
为了成功进行ChIP-seq实验，必须制备高质量的ChIP DNA模板，以获得最佳的测序结果。本描述基于对2型糖尿病发病机制中作用最显著的基因所编码蛋白的研究经验，该基因编码的蛋白为转录因子7样2（transcription factor 7-like 2, TCF7L2）。该因子还被发现与多种癌症相关。
本文概述了如何从结直肠癌细胞系HCT116中制备高质量的ChIP DNA模板，以通过测序构建高分辨率图谱，确定被TCF7L2结合的基因，从而进一步揭示其在复杂性状发病机制中的关键作用。

染色质经超声处理并用RNase和蛋白酶处理后，样品在2%琼脂糖凝胶电泳中应呈现DNA片段弥散分布，且大部分DNA集中在目标大小范围内。若测试多个不同的循环次数，随着循环次数增加，片段大小应逐渐减小（图2）。
完成本方案的免疫沉淀步骤后，可通过PCR或实时PCR检测富集效果。进行PCR扩增后，在琼脂糖凝胶上观察结果时，阳性结合区域的Input和ChIP（使用针对目标蛋白的抗体，本例中为TCF7L2）样本泳道应出现条带，而IgG（阴性对照）泳道应无条带或仅有极微弱条带（背景噪音）。对于阴性结合区域，IgG对照和ChIP泳道应无条带或仅有极微弱条带，而Input泳道应可见条带（图3）。
图4展示了通过实时PCR检测的相同样品。与前一张图类似，ChIP样品在阳性结合区域的富集倍数应显著高于IgG对照组。此外，在阴性结合区域应几乎看不到富集，或富集程度极低。
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染色质免疫沉淀与超深度高通量测序（ChIP-seq）相结合，可识别并定位特定组织或细胞系中的蛋白质-DNA 相互作用。本文以转录因子 TCF7L2 为例，概述了如何制备高质量的 ChIP 模板用于后续测序。

高质量染色质免疫沉淀DNA模板的制备用于高通量测序（ChIP-seq）

ChIP-测序（ChIP-seq）方法可直接提供全基因组覆盖，通过结合染色质免疫沉淀（ChIP）与大规模并行测序……

本实验的总体目标是通过染色质鉴定蛋白质结合区域。首先将蛋白质与DNA进行交联，第二步是剪切DNA。接下来，将免疫沉淀与DNA结合的目标蛋白，然后进行洗脱。最后一步是逆转交联并分离DNA。最终，染色质免疫沉淀用于显示蛋白质结合在基因组上的定位。该方法有助于回答功能基因组学领域中的关键问题，例如在特定组织或细胞系中鉴定和绘制蛋白质与DNA的相互作用。本实验所用细胞在100乘以20毫米的细胞培养皿中培养。每个培养皿中的细胞数量根据细胞类型不同，可在100万至1000万个之间变化。大约200万个细胞即可满足一次免疫沉淀实验的需要，用于在细胞中交联蛋白质与染色质。加入甲醛至终浓度为1%，室温孵育10分钟，期间偶尔轻轻摇动。通过加入甘氨酸至终浓度为125毫摩尔/升以终止交联反应，继续孵育5分钟。室温下用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次；第二次洗涤后，倾去PBS，加入0.2毫升新鲜PBS，用塑料细胞刮刀收集细胞至微量离心管中。在4摄氏度下以2000转/分钟离心5分钟，沉淀细胞。吸取上清液用于核提取。将细胞以沉淀形式保留，用于制备全细胞裂解液，这将在下一节中进行演示。在预冷的冰上通过超声处理，将细胞重悬于SDS裂解缓冲液中，以制备交联细胞的全细胞裂解液。使用超声破碎仪获得理想的DNA片段大小时，必须通过尝试不同的超声条件来优化该实验步骤。整个操作过程中，样品必须始终置于冰上。每个样品的超声处理条件为：振幅设为2，超声30秒，间歇45秒。在此示例中，需要进行 12 个循环以获得理想的片段大小。收集每份样品的 20 微升用于检测超声处理结果及定量分析。剩余样品可保存于负 80 摄氏度。将20微升样品加入30微升0.1 XTE缓冲液进行稀释。然后加入1微升RNAs A，在37摄氏度处理1小时。接着加入1微升蛋白酶K，在62摄氏度孵育2小时。蛋白酶K处理后，取20微升样品在2%琼脂糖凝胶上电泳。样品应呈现弥散条带，大部分DNA位于预期大小位置。若测试多个不同循环次数，应观察到DNA片段大小逐渐减小。随着循环次数的增加，将使用 kaya 快速 PCR 纯化试剂盒对剩余样品进行纯化，并利用 NanoDrop 对 TER 的光谱进行定量，以开始此实验流程。将蚕豆超声处理的染色质样品置于冰上，在 4°C 条件下以 12,000 RPM 离心 10 分钟。离心后立即置于冰上。为了去除呈白色沉淀的SDS，收集各样本的上清液并弃去沉淀。如有必要，可将样本合并，并根据先前的计算结果留出实验所需的用量，其余部分暂存备用。每次免疫沉淀需要 1 至 10 微克的染色质。用含有蛋白酶抑制剂的稀释缓冲液将染色质稀释至一到十分之一。每次免疫沉淀加入 100 微升封闭的 Aro Speeds，在 4 摄氏度下旋转孵育一小时。以 800 RPM 的转速在 4 摄氏度下离心样品 1 分钟，开始染色质免疫沉淀实

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

代高通量测序技术（ChIP-seq的高品质的染色质免疫沉淀DNA模板）

Hi-C 方法能够无偏倚地在全基因组范围内鉴定染色质相互作用（1）。Hi-C...

Hi-C：一种研究基因组三维结构的方法

在本视频中，我们演示了染色质免疫沉淀技术，用于鉴定少突胶质前体细胞基因组DNA特定区域上的蛋白质结合位点 通过...

染色质免疫沉淀法鉴定基因组DNA上靶蛋白结合位点

用于定位的方法 在体 蛋白质-DNA 相互作用对于基因组研究的各个方面正变得至关重要，但这类实验通常耗时、费力且成本高昂。本文介绍了一种市售的自动化液体处理系统，可实现染色质免疫沉淀的自动化操作，用于绘制 体内...

自动化 ChIP-seq 实验以在 10,000 个 HeLa 细胞中生成表观遗传谱型

我们提出一种改进的天然染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）方法，用于生成适用于核小体密度ChIP-seq分析框架的序列数据集，该框架整合了微球菌核酸酶（MNase）可及性与组蛋白修饰检测。...

用于核小体密度分析的天然染色质免疫沉淀测序文库的构建

本文介绍了一种染色质免疫沉淀（ChIP）及ChIP-seq文库构建方案，用于从稀有鸡胚样本中生成全基因组表观基因组谱图。...

低丰度胚胎样本的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案

本文介绍了一种优化的高通量染色质免疫沉淀测序（ChIP-sequencing）实验方案及相应的计算分析流程，用于从冻存的肿瘤组织和细胞系中确定全基因组范围内的染色质状态模式。...

利用高通量ChIP-测序在肿瘤组织中进行全基因组染色质状态作图的整合平台

本文介绍了一种实验方案，旨在通过对少量细胞进行染色质免疫沉淀（ChIP）、文库构建、高通量测序及生物信息学数据分析，研究少突胶质细胞转录因子2（Olig2）在急性分离的脑少突胶质细胞前体细胞（OPCs）中的全基因组结合情况。...

通过低细胞量染色质免疫沉淀测序分析鉴定急性纯化的PDGFRα+细胞中转录因子Olig2的基因组结合位点

我们描述了一种串联染色质免疫沉淀测序（tChIP-Seq）的逐步实验方案，该方法可用于分析特定细胞类型的全基因组组蛋白修饰。...

TChIP-Seq：细胞类型特异性表观基因组分析

本文介绍了一种高效染色质免疫沉淀（ChIP）后接高通量DNA测序（ChIP-seq）的实验方案，适用于从小鼠分离的棕色脂肪组织（BAT）样本。该方案可用于全基因组范围内组蛋白修饰的定位分析，以及非组蛋白目标蛋白的全基因组定位研究。 体内.

小鼠棕色脂肪组织的染色质免疫沉淀

本文介绍了一种半自动化的微量染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）方案，该方案利用ChIP液体处理平台，针对与特定组蛋白修饰（H3K27ac）相关的DNA区域进行检测，随后采用标签化片段化（tagmentation）方法构建文库。该流程包含对产物质量和数量的质量控制评估步骤，且可适用于其他组蛋白修饰或转录因子的研究。...

一种用于大规模表观遗传学研究的半自动化ChIP-Seq实验流程

本方案描述了染色质捕获结合高通量测序（Capture...

通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

学习染色质免疫沉淀技术以制备高品质ChIP-seq测序模板，用于识别TCF7L2等转录因子在全基因组中的蛋白结合区域。该方法结合甲醛交联、超声破碎和免疫沉淀步骤，为功能基因组学研究提供可靠的蛋白-DNA相互作用分析方案。

高质量染色质免疫沉淀DNA模板的制备用于高通量测序（ChIP-seq）

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