Name: 通过微接触印刷的定向功能性心肌组织的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 了解利用微接触印刷技术制备定向功能性心肌组织的方法。该技术通过控制胚胎干细胞来源的心脏祖细胞形态，为心脏修复和再生医学提供新的研究工具。

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本工作部分在国家纳米技术基础设施网络（NNIN）成员——纳米尺度系统中心（CNS）完成，NNIN 在美国国家科学基金会 NSF 资助号 ECS-0335765 支持下运行。CNS 隶属于哈佛大学。

生成取向功能性心肌组织的方案可分为三个主要部分。使用软光刻技术制备微图案化模板不属于以下方案的内容，但可根据已建立的方法进行制备6。
1. 将纤连蛋白微接触印刷至PDMS基底
<ol>
	<li>按10:1的基料与固化剂比例混合Sylgard 184（Dow Corning）PDMS弹性体，并使用真空干燥器脱气以去除所有气泡。</li>
	<li>将PDMS置于先前制备的模具上固化，该模具具有20 μm宽、2 μm高、间距为20 μm的脊状结构，在室温下固化2天或在65 °C下固化4小时，以获得微结构化的PDMS印章。</li>
</ol>
* 建议在干燥器中固化，以消除任何气泡。
<ol start="3">
	<li>将PDMS旋涂在玻璃盖玻片上（例如 使用Headway匀胶机以5,000 rpm转速离心2分钟，制备厚度为15 μm的薄而均匀的PDMS基底（22×22 mm）。</li>
	<li>用70%乙醇清洁印章以去除灰尘和污物颗粒，然后让其自然晾干。</li>
</ol>
* 印章可多次使用，但由于随时间推移表面会发生磨损，建议定期更换PDMS印章。
<ol start="5">
	<li>将印模放入 SPI Plasma-Prep II 等离子清洗仪中，在 275 mTorr 条件下处理 1 分钟，使 PDMS 表面亲水化。</li>
</ol>
* 应密切观察氧气等离子体处理过程。处理时间过长可能导致弹性体开裂。
<ol start="6">
	<li>用70%乙醇对印章消毒1分钟，然后用压缩空气快速吹干。</li>
</ol>
* 为保持无菌状态，后续步骤应在生物安全柜中进行。
<ol start="7">
	<li>用纤连蛋白溶液（50 μg/ml，溶于ddH2O）覆盖印章表面，使其吸附至少10分钟。</li>
	<li>甩去印章表面的纤连蛋白溶液，并用压缩空气快速吹干。</li>
	<li>将印章与PDMS基底紧密贴合接触2分钟，并施加适当压力。</li>
	<li>用ddH2O冲洗微图案化基底。若非立即使用，可将其保存在ddH2O中，4 °C下最多保存2周。PDMS印章也应存放在ddH2O中。</li>
</ol>
2. 双转基因胚胎干细胞系的维持
首先，准备以下培养基用于培养小鼠胚胎干细胞：
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基：Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），10% 胎牛血清（FBS）（胚胎干细胞级或分化级），1% 青霉素-链霉素（P/S）
胚胎干细胞（ESC）培养基：DMEM，15% 胚胎干细胞级胎牛血清（FBS），1% 非必需氨基酸（NEAA），0.5% 青霉素-链霉素（P/S），0.2% 白血病抑制因子（LIF），0.0007% 2-巯基乙醇（2-ME）
<ol>
	<li>用无菌的 ddH2O 中 0.1% 明胶包被 6 孔板，在 37 °C 下吸附 15 分钟。</li>
	<li>将解冻后的 MEFs 加入含 50 ml PBS 的锥形管中，于 1,000 rpm 离心 5 分钟。用 MEF 培养基重悬 MEFs。</li>
	<li>吸附完成后，吸除多余的明胶，将 MEFs 加入孔中。静置 1 天使 MEFs 贴壁。</li>
</ol>
* 1000万个MEF细胞的等分试样足以用于3块6孔板。
<ol start="4">
	<li>待MEF贴壁后，将冻存的ES细胞取出，加入50 ml PBS至锥形管中，1,000 rpm离心5 min。用ESC培养基重悬ES细胞，然后加入含有MEF的孔中。在ESC培养基中培养ES细胞，直至细胞融合。</li>
</ol>
* 胚胎干细胞（ES细胞）达到汇合状态后，需进行传代培养，以避免过度生长并维持ES细胞集落。
<ol start="5">
	<li>准备 ES 细胞进行传代。吸除 ESC 培养基，并用无菌 PBS 洗涤一次。</li>
	<li>吸除 PBS，加入 500 μl 胰蛋白酶。在 37 °C 下处理 3.5 分钟。</li>
	<li>将胰蛋白酶溶液反复吹打数次以分散 ES 细胞集落，并加入 500 μl ESC 培养基中和反应。</li>
	<li>按所需比例传代 ES 细胞，例如，取 33 μl 接种至预先准备有 MEF 的新孔中，实现 1/30 的传代比例。将 ES 细胞维持在 ESC 培养基中培养。</li>
</ol>
* 1/30 的传代比例可使 ES 细胞在 3 天内达到汇合状态。请根据您的体外分化时间表进行 ES 细胞传代。
3. 体外 双转基因胚胎干细胞系的分化及心脏前体细胞的分离与接种
首先，准备以下实验所需的培养基 体外 胚胎干细胞的分化：
适应培养基：伊氏改良杜尔贝科培养基（IMDM），15% 胎牛血清（ES 细胞级），1% 非必需氨基酸（NEAA），0.5% 青霉素-链霉素（P/S），0.2% 白血病抑制因子（LIF），0.0007% 2-巯基乙醇（2-ME）
分化培养基： IMDM，15% 胎牛血清（分化级），1% 非必需氨基酸（NEAA），0.5% 青霉素-链霉素（P/S），0.35% 0.1 M 抗坏血酸，0.0007% 2-巯基乙醇（2-ME）
<ol>
	<li>开始 体外 当 ES 细胞达到汇合时进行分化。用无菌的 0.1% 明胶 ddH₂O 溶液包被 10 cm 培养皿。2O，并在37 °C下吸附15分钟。</li>
</ol>
* 请注意体外分化过程的持续时间。从开始到能够分离出心脏前体细胞需要 8 天。请据此合理规划实验。
<ol start="2">
	<li>按照之前的方法收获 ES 细胞。吸附后，吸去多余的明胶，将约三分之一至二分之一的 ES 细胞悬液加入含适应培养基的预处理培养皿中。培养细胞 2 天。</li>
</ol>
* 根据您的实验选择适应的 ES 细胞数量。
<ol start="3">
	<li>使用1.5 ml胰蛋白酶将适应后的ES细胞收集至含有PBS的50 ml锥形管中。将解离的ES细胞以1,000 rpm离心5分钟，并用分化培养基重悬。</li>
	<li>使用多通道移液器在15 cm培养皿中，以每10 μl液滴约含1,000个细胞的比例形成拟胚体（EBs）。将培养皿倒置，于37 °C培养2.5天，使EBs以悬滴方式生长。</li>
	<li>培养2.5天后，将6–8个15 cm培养皿中的EBs用分化培养基合并至一个培养皿中，继续在37 °C培养3.5天。</li>
	<li>培养3.5天后，将EBs收集至一个50 ml锥形管中，静置约5分钟使其沉降至管底。吸除上清液，并用无菌PBS洗涤EBs，再次静置约5分钟使其沉降。</li>
	<li>在37 °C水浴中加入2.5 ml胰蛋白酶处理EBs 2分钟，同时轻轻振荡管子以解离EBs。然后向胰蛋白酶溶液中加入2.5 ml无菌PBS，使用10 ml血清移液器反复吹打约8–10次以打散细胞团块。加入含7.5% FBS（ES细胞级或分化级）和0.01% DAPI的PBS配制的FACS缓冲液10 ml以中和胰蛋白酶。</li>
	<li>将解离后的EBs以1,000 rpm离心5分钟，弃上清，用约1 ml FACS缓冲液重悬。使用1 ml移液器反复吹打约8–10次，进一步打散细胞团块。</li>
</ol>
* 根据估计的解离拟胚体数量加入FACS缓冲液。细胞浓度过高可能导致流式细胞分选（FACS）过程中堵塞，而浓度过低则可能不必要地延长FACS时间。
<ol start="9">
	<li>将细胞转移至无菌圆底管中，使用35 μm细胞筛网过滤，以获得单细胞悬液。</li>
	<li>使用FACSAria流式细胞仪分选已分化的ES细胞，获得纯化的CVP细胞群。</li>
</ol>
*我们开发了一种多步设门策略，用于分离高纯度的有色细胞。简而言之，我们首先根据前向散射振幅（FSC-A）和侧向散射振幅（SSC-A）进行设门（图1A），以将完整细胞与细胞碎片区分开来。接着，我们根据FSC-A和前向散射宽度（FSC-W）进行设门（图1B），以从双联体及其他细胞聚集体中分离出单细胞。随后，我们根据SSC-A和侧向散射宽度（SSC-W）进行设门（图1C），以进一步提高单细胞的纯度。然后，我们根据DAPI染色情况进行设门，将活细胞（DAPI阴性）与非活细胞（DAPI阳性）分离（图1D）。接下来，我们根据藻红蛋白振幅（PE-A）和藻红蛋白-花青素7染料振幅（PE-Cy7-A）进行设门，以获得真正的红色阳性（R+）和真正的红色阴性（R-）细胞，并排除自发荧光的红色阴性细胞（图1E）。随后，将R+和R-细胞分别根据异硫氰酸荧光素振幅（FITC-A）和PE-A进行设门，以在这两类细胞群中进一步分选出真正的绿色阳性（G+）和真正的绿色阴性（G-）细胞（图1F+1G）。最终得到四类细胞群体：R+G+、R+G-、R-G+和R-G-（图1H）。
<ol start="11">
	<li>用1% Pluronic F-127溶于ddH2O中，对微图案化基底进行10分钟的钝化处理，随后用无菌PBS洗涤3次。</li>
</ol>
* Pluronic F-127 是一种可阻断细胞黏附的表面活性剂，有助于将细胞黏附限制在微图案化区域。
<ol start="12">
	<li>在图案化区域周围安装PDMS垫圈并压紧。随后，将CVP细胞接种到纤连蛋白微图案基底上。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在此方案中，我们介绍了一种分离纯化的心源性前体细胞群体的方法，并将其接种于微图形化纤维连接蛋白基质上，使其能够排列整齐并呈现类似心肌细胞的杆状形态。正常的细胞排列对于组织的正常功能至关重要。8,10 ，尤其是心肌组织。研究表明，心肌细胞在力学性能方面得到显著改善11,12 以及电生理特性11,13 在形成各向异性细胞阵列时，由于在微图形化纤连蛋白基底上培养的心脏前体细胞会分化为杆状心肌细胞 体外，这代表了心脏组织生物工程中的一个关键步骤。
微接触印刷是一种简单且低成本的工具，可用于制备模拟心肌组织的二维模板 体外然而，细胞外基质蛋白的有效且成功的图案化在很大程度上依赖于所选蛋白的种类。尽管已有多种不同的蛋白被成功地印迹到PDMS基底上，但某些蛋白（如I型胶原）在进行微接触印刷前，需要对PDMS基底进行表面修饰。14此外，施加在印章上的压力大小以及压印时间的长短也会显著影响微接触印刷的效率和保真度。
该方案...

尽管医学治疗取得了近期进展，晚期心力衰竭仍然是发达国家发病率和死亡率的主要原因。该临床综合征源于功能性心肌组织的丧失，进而导致衰竭的心脏无法满足患者的代谢需求。由于心脏的再生能力有限，自体心脏移植是目前唯一被临床认可、旨在补充丧失的功能性心肌组织的治疗方法。然而，心脏移植存在诸多显著局限，包括供体心脏数量有限以及需要长期免疫抑制治疗，因而限制了该疗法的广泛应用。因此，药物治疗仍是心脏病患者的主要治疗手段。在药物研发过程中，一个重大挑战在于鉴定能够准确模拟正常和病变心肌生理状态的细胞检测方法。 体外.
干细胞生物学与组织工程技术的最新融合为心脏再生开辟了新的前景。利用可再生的患者特异性来源生成具有功能的心肌组织将是该领域的一项重大进展。这将有助于开发针对药物研发与发现的疾病特异性细胞检测方法，并为心脏再生医学奠定基础。人类胚胎干细胞（ES细胞）以及更为重要的人类诱导多能干细胞（iPS细胞）代表着一种潜在的、可再生的患者特异性心室前体细胞及成熟心室肌细胞来源。结合干细胞生物学与组织工程策略，有望实现功能性心肌组织的构建 体外 可用于药物发现的细胞检测方法开发，或用于治疗晚期心力衰竭的心脏再生策略。
心脏再生领域的一个核心挑战是确定一种最佳的细胞类型。已有大量不同类型的细胞被研究1然而迄今为止，尽管已发现来自不同来源的多种多能心脏前体细胞，但尚未明确一种能够满足关键要求的细胞来源，例如具有向肌源性细胞命运分化的特性，同时维持扩增能力 体内 或 体外 且构建出具有功能性的心肌组织已被证明是一个核心难题2我们此前描述了一种双转基因小鼠系统，该系统能够从正在分化的胚胎干细胞中分离出高度纯化的已定型心室前体细胞（CVP）群体 体外我们构建了一种新型的双转基因小鼠，该小鼠在MEF2c基因的Isl1依赖性增强子调控下表达红色荧光蛋白dsRed，并在心脏特异性Nkx2.5增强子调控下表达增强型绿色荧光蛋白。基于这一双色荧光报告系统，可通过荧光激活细胞分选（FACS）技术，根据MEF2c和Nkx2.5基因的表达情况，从发育中的胚胎干细胞中分离出第一和第二心区前体细胞。CVP在心肌标志物的表达模式以及结构和功能特性方面均类似于心肌细胞。3在心脏组织再生方面具有广阔的应用前景。
尽管组织工程领域已取得诸多进展，模拟天然细胞结构仍是关键挑战。解决这一挑战的传统方法包括将细胞接种于生物性或合成支架上 体外由于支架存在诸多缺点，包括降解过快、物理和机械稳定性有限以及细胞密度较低1,4,5 我们尝试构建无支架的组织。尽管心肌细胞可通过分泌细胞外基质蛋白来修饰其局部微环境，但在缺乏细胞外信号提示的情况下，它们自主排列为杆状心肌细胞的能力较为有限。因此，需要一种能够为细胞提供适当空间和生物学信号的模板，以形成具有功能的心肌组织。微接触印刷技术通过提供一种简单且经济的方法，可精确控制细胞的形态、排列和功能，从而应对这一挑战。6-8，这些因素对于生成取向排列的功能性心肌组织至关重要。该方法采用微结构化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章，其特征尺寸可小至2 μm9 可在PDMS基底上以精确图案沉积细胞外基质蛋白，从而在空间上调控细胞黏附。
本文中，我们提出将组织生物工程技术与干细胞生物学相结合，以构建各向异性的功能性心肌组织。为此，我们在此展示我们近期发表的方法，具体包括以下步骤：（1）通过微接触印刷技术在PDMS基底上制备微图案化蛋白表面，从而形成用于定向心肌组织生长的模板；（2）从正在分化的小鼠胚胎干细胞中分离高纯度的心脏前体细胞 体外以及（3）结合这两种技术以生成取向排列的功能性心肌组织。

<table><tbody><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>配制 0.1 M 的 ddH₂O 溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>真空干燥器，10 英寸</td><td>Nova-Tech International, Inc.</td><td>55206</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II 流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 ES细胞级</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 分化级</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆来源的纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4759</td><td>溶解至 ddH₂O 中，浓度为 1 mg/ml&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Fisherfinest 高级盖玻片 22x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>制备 0.1% 的 ddH₂O 溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Headway 旋涂仪</td><td>Headway Research, Inc.</td><td>PWM32-PS-CB15</td><td></td></tr><tr><td>Iscove改良的Dulbecco培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30228.01</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>由分泌LIF的细胞系自备</td><td></td><td>配制500倍浓缩液</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞</td><td>从小鼠胚胎第12至15天采集</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>在ddH₂O中配制1%溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O </td></tr><tr><td>圆底管配35 &amp;mu;m细胞滤筛</td><td>BD 生物科学</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>SPI Plasma-Prep II 等离子清洗机 </td><td>SPI Supplies</td><td>11005-AB</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td>道康宁</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>真空计</td><td>SPI Supplies</td><td>11019-AB</td><td></td></tr></tbody></table>

通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

晚期心力衰竭是一种主要的未被满足的临床挑战，源于有活力和/或功能完整的心肌细胞的丧失。尽管已有最佳药物治疗，心力衰竭仍是发达国家中导致死亡和疾病负担的主要原因。在药物研发中，一个主要挑战在于鉴定能够准确模拟正常与病变人心肌生理的细胞检测方法。 体外同样，再生心脏生物学面临的主要挑战集中在临床相关数量下，识别并分离患者特异性的心脏前体细胞。随后，这些细胞需要被组装成功能性组织，以模拟天然心脏组织的结构。. 微接触印刷技术能够创建出精确的微图案化蛋白质结构，这些结构类似于心脏的组织架构，从而为空间控制细胞黏附提供几何学线索。本文中，我们描述了一种从多能干细胞分化过程中分离高纯度心肌细胞的方法 体外细胞生长表面的微图形化制备，该表面经细胞外基质蛋白修饰，以及由干细胞衍生的心肌细胞组装成各向异性的心肌组织。

FACS 分选纯化 体外 分化的ES细胞揭示了四种不同的前体细胞群体（图1）。通过免疫荧光显微镜确认了微图案化纤连蛋白的存在，结果显示连续的纤连蛋白条带被完整转移（图2). 将FACS分选的前体细胞接种至纤维连接蛋白微图案上，可导致R的排列+G+ 以及R的一部分-G+ 群体。尽管使用了Pluronic F-127作为抑制细胞黏附的辅助阻断剂，但R+G- 和 R-G- 细胞群体未遵循纤连蛋白的各向异性结构，而是生长进入相邻蛋白线条之间的区域（图3).
<img src="/files/ftp_upload/50288/50288fig1.jpg" alt="Flow cytometry scatter and gat...

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。

晚期心力衰竭是一种重大的未满足临床需求，源于存活心肌细胞和/或功能完整心肌细胞的丧失。

以下实验的目的是通过微接触印刷技术生成排列有序的功能性心肌组织。首先在聚二甲基硅氧烷基底上进行纤维连接蛋白的微接触印刷，然后进行双转基因操作。胚胎干细胞系在体外进行分化，并通过荧光激活细胞分选技术进行分离，从而获得高度纯化的强心源性前体细胞群体。随后，将分离得到的心脏前体细胞接种到微图案化的PDMS基底上，以促使其排列整齐并呈现类似心肌细胞的杆状形态。实验结果表明，基于事实和免疫荧光分析，成功实现了心脏前体细胞的分离及其各向同性生长。生成各向同性心肌组织有助于推动干细胞生物学和组织生物工程领域的发展，为药物研发和发现提供疾病特异性的细胞检测方法，并为心脏再生医学奠定基础。首先，取180份IL guard与4份聚二甲基硅氧烷弹性体，按10:1的基剂与固化剂比例混合，并充分搅拌均匀。使用干燥器对组装件进行脱气，以去除任何气泡。将PDMS倒入先前制备的模具中，该模具具有20微米宽、2微米高的凸脊，凸脊之间间隔20微米，然后在室温下的干燥器中固化两天，得到具有微结构纹理的PDMS印章。使用等离子清洗仪使PDMS印章表面变为亲水性后。用70%乙醇对印模进行消毒，持续一分钟。在生物安全柜中，用压缩空气快速吹干。在印模的无菌表面覆盖纤连蛋白溶液，吸收至少10分钟。将纤连蛋白溶液从印章上甩掉，并用压缩空气快速吹干。按照文本方案所述，将印章与先前制备的PDMS包被的玻璃盖玻片紧密贴合接触两分钟，并用力按压。用蒸馏水冲洗微图案基底。若非立即使用，将它们置于4°C的蒸馏水中保存，最多不超过两周。用无菌的0.1%明胶蒸馏水溶液包被六孔板，在37°C下孵育15分钟使其充分吸收。在此期间，取一份冻存的小鼠胚胎成纤维细胞，将其加入50毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的锥形管中进行准备。以1000转/分钟离心5分钟，随后将细胞重悬于甲基培养基（meth medium）中。孵育时间结束后，吸除多余的明胶，并将 MES 加入孔中。让 MES 附着一天。取适量冻存的胚胎干细胞（ES 细胞），加入 50 毫升 PBS 至锥形管中，混匀后离心。将ES细胞以1000 RPM离心五分钟，然后用ESC培养基重悬。将ES细胞加入含有基质的孔中，并在ESC培养基中培养至细胞融合，以获得融合的ES细胞。首先吸除ESC培养基，再用无菌PBS洗涤细胞一次。然后吸去PBS，向孔中加入500 µL胰蛋白酶溶液。在37°C下孵育3.5分钟。用移液器将胰蛋白酶溶液上下吹打数次。首先将ES细胞集落打散。然后加入500微升ES细胞培养基至孔中，以中和胰蛋白酶溶液。根据所需比例传代ES细胞，此处ES细胞以1:30的比例进行传代，使其在三天内达到汇合状态。当 ES 细胞达到汇合状态时，开始体外分化。首先用无菌的 0.1% 明胶溶于蒸馏水，包被 10 厘米的培养皿，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟使其充分吸收。在此期间，按之前方法收获 ES 细胞。15 分钟结束后，吸除多余的明胶，并将约三分之一至一半的 E ES 细胞悬液加入含有适应性培养基的培养皿中。在适应性培养基中培养细胞两天后，用 1.5 毫升胰蛋白酶将适应后的 ES 细胞收集至含有 PBS 的 50 毫升锥形管中。以 1000 转/分钟离心 5 分钟，然后重悬于分化培养基中。在15厘米培养皿中，用分化培养基以每10微升液滴约1000个细胞的密度制备胚胎体（EBS）。使用多通道移液器将培养皿倒置后进行培养。胚胎体在37摄氏度下以悬滴方式培养两天半。两天半后，使用分化培养基将六到八个15厘米培养皿中的EBS收集到一个培养皿中，并继续培养三天半。再经过三天半后，将EBS收集至一个50毫升锥形管中，并用无菌PBS洗涤培养皿一次，以收集所有EBS。然后静置约五分钟，使其沉降到管底。然后去除上清液，用无菌 PBS 清洗 EBS。让 EBS 再次沉降至底部，约五分钟。加入 2.5 毫升胰蛋白酶消化液，于 37°C 水浴中轻轻振荡孵育两分钟，以解离 EBS。然后向胰蛋白酶溶液中加入 2.5 毫升无菌 PBS，用 10 毫升血清移液管上下吹打约 8 至 10 次，以分散细胞团块。用含有 7.5% ES 细胞或分化级 FBS 和 0.01% DPI 的 10 毫升 Fax 缓冲液中和胰蛋白酶，将解离的 EBS 在 PBS 中以 1000 RPM 离心 5 分钟。随后弃去上清液，加入约 1 毫升 Fax 缓冲液，用 1 毫升移液器上下吹打约 8 至 10 次，以进一步分散细胞团块。将细胞转移至含有35微米细胞筛网的无菌圆底管中，以获得单细胞悬液。使用Aria流式细胞仪分选已分化的ES细胞，获得纯化的定向心室前体细胞群体。详细的设门策略请参见实验方案的文本部分。用1% Pluronic F127的蒸馏水溶液处理微图案基底10分钟，然后用无菌PBS洗涤三次。在图案区域周围安装PDMS垫圈并压紧。然后将心脏前体细胞接种到纤连蛋白微图案基质上。以下图像来自体外分化第6天胚胎干细胞的代表性流式细胞术图谱。该图像显示了对前向散射幅度（FSCA）和侧向散射幅度（SSCA）的设门。这可以实现完整细胞与细胞碎片的分离。此处显示的是基于FSCA和前向散射宽度FSCW的设门。这能够将单个细胞从双联体及其他细胞聚集体中分离出来。该图像显示了基于SSCA和SSCW散射的门控，这可提高单细胞的纯度。该图像还显示了基于FSCA和DPI染色的门控，从而能够从非活细胞中分离出存活的DPI阴性细胞。此处显示了在 DI 七号 PE SI 七号中对菲可、利奈、PE 和 PE 氰的设门。这使得可以获得真正的红色阳性细胞和真正的红色阴性细胞，并排除自发荧光的红色阴性细胞。这些图像显示了对异硫氰酸荧光素、振幅拟合钙以及 PEA 的设门，从而可在红色阳性和红色阴性细胞群中分选出真正的绿色阳性与真正的绿色阴性细胞。通过流式细胞术纯化体外分化的胚胎干细胞，从该流式细胞图中可见四种不同的前体细胞群体。这四种不同的前体细胞群体分别为红色阳性、绿色阳性红色阳性、绿色阴性红色阴性、绿色阳性红色阴性和绿色阴性红色阴性。该代表性免疫荧光显微镜图像显示了微图案化的纤维连接蛋白基底。比例尺代表80微米。该图像显示了胚胎来源的细胞团块（facts）的代表性免疫荧光显微照片，上图显示分离的前体细胞；下图显示在纤连蛋白微图案上再培养五天后的ESL来源的细胞团块（facts）及分离的前体细胞，细胞核染成蓝色。S-M-M-H-C-A染成红色，肌节α-辅肌动蛋白呈绿色。比例尺为40微米。观看本视频后，您应能够充分理解如何从可再生的心脏前体细胞来源生成各向异性的功能性心肌组织。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

通过微接触印刷的定向功能性心肌组织的产生

在本实验方案中，我们展示了利用毛细力光刻技术，采用两种不同的高分子材料制备仿生心脏细胞培养基质的方法。in vitro 和 in vivo...

毛细力光刻技术在心肌组织工程中的应用

本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。...

构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

本方案描述了无需使用生物材料的三维心脏组织生物打印技术。三维生物打印的心脏补片表现出组分球状体之间的机械整合，在心脏组织再生及作为心脏疾病的三维模型方面具有广阔的应用前景。...

利用3D生物打印技术构建表现出类球体机械整合的心脏组织

我们提供一种基于微流控生物打印策略的通用方案，用于构建微纤维血管床，其中可进一步将第二种细胞类型接种于该微纤维结构的间隙空间，以生成带血管化的组织和类器官。...

用于构建血管化组织和类器官的微流控生物打印技术

本方案描述了一种基于网状模具的方法，用于构建具有满意结构完整性和同步搏动行为的三维无支架心肌组织。...

一种基于网状模具的无支架三维心脏组织构建方法

本文介绍了一种利用模拟心脏生理环境的电刺激和机械刺激来训练细胞群体的实验方案。这种电机械刺激可增强经处理细胞的心肌生成潜能，是在细胞治疗、疾病建模及药物筛选领域具有前景的策略。...

同步电刺激与机械刺激以增强细胞的心肌生成潜能

本方案旨在生成含有源自人诱导性多能干细胞的心血管细胞的网状工程化心肌组织，以用于心脏疾病细胞移植治疗的研究。...

由人iPS细胞衍生的网格状工程化心肌组织制备及其在体内心肌修复中的应用

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。...

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

利用光来控制心肌细胞和组织可实现非接触式刺激，从而保持细胞的自然状态和功能，这一方法在基础研究和治疗应用中均具有重要价值。...

一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（Ca2+）传导的心脏微生理系统

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

了解利用微接触印刷技术制备定向功能性心肌组织的方法。该技术通过控制胚胎干细胞来源的心脏祖细胞形态，为心脏修复和再生医学提供新的研究工具。

通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

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