通过微接触印刷的定向功能性心肌组织的产生

以下实验的目的是通过微接触打印生成对齐的功能性心肌组织。这是通过首先将纤连蛋白微接触打印到聚二甲基硅氧烷基材上来实现的。作为第二步，双重转基因。

胚胎干细胞系在体外分化并通过荧光激活细胞分选进行分离，从而获得高度纯化的强心源性祖细胞群。接下来，将分离的心脏祖细胞接种到微专利 PDMS 底物上，使其恶性并呈心肌细胞状。获得的结果表明，基于事实和免疫荧光分析，心脏祖细胞的成功分离和各向同性生长。

生成各向同性心肌组织可以提高开发疾病特异性细胞用于药物开发和发现的可能性，从而有助于干细胞生物学和组织生物工程领域的进步。并通过为心脏再生医学奠定基础。第一种 IL 保护剂，180 4 聚二甲基烯烃弹性体，以 10：1 的固化剂比例混合。

使用干燥剂对组件进行脱气以消除任何气泡。将 PDMS 倒入先前制造的母版中，母版宽 20 微米，工具脊之间间隔 20 微米，然后在室温下干燥固化两天，以获得微纹理 PDMS 印章。使用等离子清洗剂对 PDMS 印章表面进行亲水渲染后。

用 70% 乙醇对邮票消毒 1 分钟。在生物安全柜中，用压缩空气快速干燥。用纤连蛋白溶液覆盖无菌印章表面，使其在吸收后至少 10 分钟被吸收。

甩掉邮票上的纤连蛋白溶液，并用压缩空气快速干燥。按照文本协议中的说明，在印章和先前准备好的 PDMS 涂层玻璃盖玻片之间建立保形接触两分钟，然后用力按压。用蒸馏水冲洗微图案基材。

除非立即使用，否则将它们存放在 4 摄氏度的蒸馏水中最多两周。在蒸馏水中涂上无菌 0.1% 明胶，涂覆六个孔板，并在 37 摄氏度下吸收 15 分钟在此期间，将小鼠胚胎成纤维细胞添加到锥形管中的 50 毫升 PBS 中，从等分试样中制备小鼠胚胎成纤维细胞。将冰毒以 1000 RPM 离心 5 分钟，然后重新悬浮在冰毒培养基中。

孵育时间过后，吸出多余的明胶并将 mes 加入孔中。等待 MES 一天连接。通过在锥形管离心机中将胚胎干细胞或 ES 细胞加入 50 毫升 PBS 中，从等分试样中制备胚胎干细胞或 ES 细胞。

ES 细胞以 1000 RPM 的转速悬浮 5 分钟，然后 Resus 将其悬浮在 ESC 培养基中。将 E ES 细胞添加到含有神话的孔中，并保持在 ESC 培养基中，直到达到汇合以按摩汇合的 ES 细胞。首先吸出 ESC 培养基，然后用无菌 PBS 洗涤细胞一次。

然后吸出 PBS 并加入 500 微升行程。将板在 37 摄氏度下孵育 3 分半钟。上下移液 TRIPSIN 溶液数次。

首先分解 E es 细胞集落。然后通过向孔中加入 500 μL ESC 培养基来中和三曲素溶液。根据所需的比例按摩 ES 细胞，在这里，E ES 细胞以 1 比 30 的比例传代，这使它们在三天内达到汇合。

当 ES 细胞达到汇合时，开始体外分化。首先，在蒸馏水中涂上无菌的 0.1% 明胶，涂上 10 厘米的培养皿，并在 37 摄氏度下吸收 15 分钟。在此期间，像以前一样收获 ES 细胞。

15 分钟过后，吸出任何多余的明胶，并将大约 1/3 到 20 的 E ES 细胞悬液添加到含有驯化培养基的培养皿中。在驯化培养基中培养细胞两天后，使用 1.5 毫升胰蛋白酶将驯化的 ES 细胞收获到含有 PBS 的 50 毫升锥形管中。以 1000 RPM 离心 5 分钟，然后重新悬浮在分化培养基中。

在 15 厘米培养皿中，每 10 微升分化培养基滴制备约 1000 个细胞的胚胎体或 EBS。使用多通道移液器，倒置板和培养物。EBS 在 37 摄氏度下将液滴悬挂两天半。

两天半后，使用分化培养基将 EBS 从 6 到 8 个 15 厘米的培养皿中拉成一个，然后再培养 3 天半。再过三天半后，将 EBS 收集在 50 毫升锥形管中，并用无菌 PBS 洗涤板一次以收集所有 EBS。然后让它们沉到底部约 5 分钟。

然后去除脊髓突起并用无菌 PBS 洗涤 EBS。让 EBS 再次沉入底部约 5 分钟。加入 2.5 mL 胰蛋白酶解离 EBS，并在 37 摄氏度的水浴中轻轻摇晃试管 2 分钟。

然后将 2.5 毫升无菌 PBS 加入 tripsin 溶液中，并用 10 毫升血清移液管上下移液约 8 至 10 次，以分解细胞簇。用 10 毫升含有 7.5%E ES 细胞或分化级 FBS 和 0.01%DPI 的 PBS 离心机中和胰蛋白酶，以 1000 RPM 的速度解离 EBS 5 分钟。然后取出旋滑物，用 1 毫升移液器上下加入大约 1 毫升的传真缓冲移液器大约 8 到 10 次，以分解细胞簇。

将细胞转移到带有 35 微米细胞过滤器的无菌圆底管中，以获得单细胞悬液。使用 aria 流式细胞仪对分化的 ES 细胞进行分选，并获得定型脑室祖细胞的纯化群体。有关详细的门控策略，请参阅协议的文本部分。

含有 1%onic F1 27 的微图案底物在蒸馏水中食用 10 分钟。然后用无菌 PBS 洗涤 3 次。在图案区域周围安装 PDMS 垫圈并用力按压。

然后将心脏祖细胞接种到纤连蛋白微模式底物上。以下图像来自第 6 天体外分化 ES 细胞的代表性流式细胞术图表。该图显示了前向散射振幅 FSCA 和侧向散射振幅 SSCA 上的门控。

这允许将整个细胞与细胞碎片分离。这里可以看到 FSCA 上的门控和前向散射宽度 FSCW。这允许从双联体和其他细胞聚集体中分离细胞单体。

此图显示了 SSCA 上的门控和使用 SSCW 的散射。这增加了细胞单片体的纯度。该图显示了 FSCA 和 DPI 染色的设门，允许从非活细胞中分离活的 DPI 阴性细胞。

这里可以看到 DI 7 PE SI 7 中 fico、rine、PE 和 PE 青色的门控。这允许获得真红细胞、阳性细胞和真红阴性细胞，并排除自发荧光红阴性细胞。这些图像显示了异硫氰酸荧光素振幅拟合 CA 和 PEA 的门控，允许对红色、阳性和红色阴性群体中的真、绿色、阳性和真绿色阴性细胞进行分类。

分化的 ES 细胞的传真纯化揭示了四种不同的祖细胞群，如流式细胞术图所示。四个不同的祖细胞群是红色、正绿色、正红色、正绿色、负红色、负绿色、负绿色和红色负绿色。这张具有代表性的免疫荧光显微镜图像显示了微图案化的纤连蛋白底物。

比例尺代表 80 微米。该图像显示了胚胎衍生事实的代表性免疫荧光显微镜检查，顶部面板中的分离祖细胞和 ESL 衍生事实，在纤连蛋白微模式细胞核上额外培养 5 天后，下面板中分离的祖细胞染成蓝色。S-M-M-H-C-A 染色的红色肌节 α 肌动蛋白呈绿色。

比例尺为 40 微米。看完这个视频，你应该对如何从心脏原体的可再生细胞来源产生各向异性功能性心肌组织有一个很好的了解。