Name: 单个锥体神经元的高保真光遗传学控制方法在体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 44 s
Description: 了解光遗传学技术在体内精确操控单个锥体神经元的方法，通过病毒载体递送光敏蛋白并结合光纤电极同步记录，实现毫秒级时间分辨率的神经活动激活与抑制，为神经环路研究提供高保真工具。

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本工作由美国国家药物滥用研究所（NIDA）资助项目R01 DA24040（DCC）、科罗拉多大学创新种子基金（DCC）以及NIDA培训项目T32 DA017637（MVB）支持。

1. 病毒的保存与制备
<ol>
	<li>使用复制缺陷型AAV载体将视蛋白基因递送至啮齿类动物大脑的操作属于生物安全等级1（BSL-1）范畴，需遵循美国政府出版物《微生物学与生物医学实验室生物安全》中规定的适当防护和操作程序，该文件可在疾病控制中心网站获取（<a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a>）。</li>
	<li>为避免反复冻融，应在II级生物安全柜中将病毒从厂家原装瓶中分装至较小体积的工作 aliquot，并储存于-80 °C冰箱中。</li>
	<li>在立体定位注射前，将一份aliquot置于冰上解冻，随后使用台式离心机短暂离心沉降。</li>
	<li>缓慢用少量硅油或矿物油回填Hamilton玻璃注射器及针头，确保注射器筒内无可见气泡。将注射器插入微注射泵，并将泵直接连接至垂直立体定位臂（i.e. 立体定位操纵器）。</li>
	<li>降低立体定位臂，使针尖接触病毒aliquot管底部。使用微注射泵控制器吸取所需体积的病毒（1 μl注射量对应1.5 μl吸取量）。</li>
	<li>所有与病毒接触的材料和表面均应使用消毒剂（如10%含氯漂白剂）进行去污染处理。</li>
</ol>
2. 手术与病毒注射
<ol>
	<li>用氯胺酮（大鼠；125 mg/kg，腹腔注射）- 塞拉嗪（大鼠；10 mg/kg，腹腔注射）混合物麻醉动物。通过脚趾夹捏测试反射反应，以评估麻醉效果，必要时追加氯胺酮剂量。采用标准无菌外科技术，将动物固定于立体定位仪（David Kopf Instruments）中。</li>
	<li>使用小型手术剪刀或手术刀在动物颅骨顶部的皮肤上做正中切口。轻轻分离结缔组织，并用小型骨刮匙清洁颅骨顶部。</li>
	<li>验证动物头部是否水平，使前囟（bregma）和后囟（lambda）的 z 坐标相等。根据脑图谱确定目标脑区的立体定位坐标，例如 大鼠脑立体定位坐标 （George Paxinos 和 Charles Watson，学术出版社，2007）或 小鼠脑立体定位坐标 （Keith B.J. Franklin 和 George Paxinos，Academic Press，2007）。用外科记号笔标记预定注射位点。</li>
	<li>使用手持钻在目标区域上方小心地磨薄颅骨，当钻头到达颅骨底部时停止。用超细镊子去除磨薄的骨质，以暴露硬脑膜。</li>
	<li>将注射器针头置于目标区域上方，缓慢下放针头直至接触硬脑膜，并以此点确定 z 坐标。随后极缓慢地将注射针插入脑组织，直至达到预定的 z 位置。本方案中，以成年雄性 Sprague Dawley 大鼠（约 275 g）为实验对象，靶向部位为内侧前额叶皮层的前边缘区（bregma 前方 2.7 mm，中线两侧 ± 0.5 mm，硬脑膜下 -2.2 mm）或背侧下托（bregma 后方 6.0 mm，中线两侧 ± 3.0 mm，硬脑膜下 -2.0 mm）。</li>
	<li>以0.1 μl/min的速率注射病毒。注射完成后，等待10分钟再撤出针头，以避免病毒回流至脑表面。</li>
	<li>使用带缝合针的缝线缝合皮肤，并在伤口处涂抹抗生素。</li>
	<li>ChR2 和 NpHR 通过 AAV 载体实现功能表达的时间进程将根据实验设计和病毒滴度的不同而有所变化。本实验中， 体内 注射后18至21天进行记录。</li>
</ol>
3. ChR2 或 NpHR 表达神经元的光递送与体内记录
<ol>
	<li>使用快干胶将一根钨电极（~1-1.5 MΩ，MicroProbes）固定在玻璃毛细管（Fisher Scientific）上。</li>
	<li>使用光纤剥线工具（Thorlabs）暴露多模光纤（200 μm 直径纤芯，Thorlabs）的裸露端，并用乙醇清洁光纤端面。用楔形金刚石刀片（Thorlabs）极轻地在光纤端面划痕，然后小心去除多余的光纤部分例如 用精细镊子夹住）。光纤应在刻痕处轻易断裂。</li>
	<li>将光纤的FC端连接至200 mW单管激光器输出端口的PC接头<a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a>使用所需波长的激光器。操作激光器时，务必始终佩戴适当的护目镜。</li>
	<li>使用光功率计测量光纤尖端的激光强度（<a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ）。对于 体内 记录，光强低至 20–100 mW/mm2 可分别可靠地引发由ChR2或NpHR介导的神经元活动激活或沉默。</li>
	<li>将光纤插入毛细管中。使光纤尖端位于钨电极尖端上方约500 μm处，并在靠近尖端的若干位置用细缝合线缠绕两圈，确保电极与光纤保持平直。注意电极尖端与最近的结扎点之间的距离应足够长，以便插入目标区域。</li>
	<li>按照上述步骤 2.1 和 2.2 准备动物。利用初次开颅的位置作为参考，在颅骨上制作一个新的、干净的小窗口，用于定位光探针（optrode）<a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> 用细针在硬脑膜上做一个小切口。</li>
	<li>使用显微操作器（Narishige）将光遗传探针通过颅骨窗口缓慢插入脑内至转导区域，随后以10–50 μm为步长逐步推进，直至记录到光响应细胞信号。</li>
	<li>自定义软件用户界面（NeuroLux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a>) 使用 LabVIEW（National Instruments）编写的程序用于控制单个二极管激光器，并可视化和记录正在进行的神经活动。记录的信号通过 ExAmp-20K（Kation Scientific）放大器进行带通滤波（0.3–8 kHz），并由 National Instruments 模数转换板（NI USB-6009）采集。NeuroLux Pro 用户界面允许选择模拟输入通道（选择两个通道分别用于神经信号和 TTL 信号）以及数字输出。用户可定义采样率（20 kHz）、基线期（光照前）和光照后时期。用户可设定 TTL 激光刺激的脉冲宽度、频率和刺激持续时间（若频率为 20 Hz，刺激持续时间为 500 毫秒，则会输出 10 个设定脉冲宽度的激光脉冲）。用户还可选择连续光照模式（例如, 图1）。对于重复记录，用户还可设定脉冲序列的数量以及序列之间的间隔。数据可选择是否同时记录到磁盘。</li>
	<li>记录完成后，使用氯胺酮/赛拉嗪混合物对动物进行麻醉，并经心脏灌注生理盐水和4%多聚甲醛，以验证光探针放置位置及视蛋白表达情况。</li>
</ol>

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299(2007).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li>
<li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+the+nonhuman+primate%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li>
<li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li>
<li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2%2B%2Fcalmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li>
<li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li>
<li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li>
<li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+local+circuits+in+vivo%3A+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li>
<li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+optogenetic+silencing+of+orexin%2Fhypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li>
<li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在啮齿类动物中，存在多种技术可用于将微生物视蛋白基因特异性地靶向至特定脑区。病毒介导的基因递送是一种相对经济且快速的方法，可实现ChR2和NpHR在特定细胞类型中的表达。腺相关病毒（AAV）载体系统因其在储存期间可保持高滴度、无致病性以及能够实现长期基因表达等优势，已成为光遗传学实验中的常用选择10。许多带有细胞类型特异性启动子的视蛋白表达载体已可商业化获取，可从诸如宾夕法尼亚大学（<a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a>）或北卡罗来纳大学教堂山分校（<a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a>）等载体核心平台获得多种AAV血清型。AAV技术的一个局限在于其包装容量有限（约4.7 kb），这限制了可用于细胞特异性靶向的转基因表达盒的大小。作为替代方案，慢病毒载体具有更大的包装容量，因此能够容纳由较大启动子序列调控的视蛋白靶向表达。
使用光遗传探针（optrode）可实现电生理信号的可靠检测，并同时进行时间上精确的光传递。然而，如上所述，其制作过程中需格外小心。由于切割后的光纤较为脆弱，结扎缝合线时若过紧，可能导致光纤断裂。尽管该光遗传探针可用于多次记录，但在每次插入前仍应对电极和光纤进行清洁（对于裸露端面的光纤，需手动重新切割），因为电极的阻抗和所传递光的质量会随着重复使用而下降。
在进行电生理记录时，必须缓慢推进光电极。此处使用的光电极总厚度约为 350 μm（钨电极：125 μm；光纤核心：200 μm），若推进过快可能导致脑组织移位。此外，在特定的记录与光传递装置中，还需考虑光诱导伪迹的可能性 11-12。尽管我们在实验条件下未观察到光诱导伪迹，但记录转导脑区以外的神经活动可作为光伪迹的对照。记录过程中另一个需要考虑的因素是观察 ChR2 或 NpHR 表达神经元变化所需的光强，尤其是在长时间记录时。高强度激光照射和长时间光照可能导致组织损伤和/或对后续光照刺激的反应减弱12-13。在行为学实验中，必须使用对照病毒载体以排除光纤传递热量所造成的影响。对于许多 commercially available 的光遗传学工具，已有相应的对照载体，其视蛋白基因序列已被移除。
需要注意的是，目前已开发出具有更优特性和动力学性能的ChR2工程化变体，以及其他可能更适用于特定科学问题的抑制性视蛋白。 14-15例如，一种新的ChR2变体已建立 通过 靶向突变技术，称为“ChETA”，可驱动神经元产生高保真放电，其频率（高达至少200 Hz）超过原始ChR2的放电频率 14.
在建立基因靶向细胞群的模式化活动与相应时间锁定的行为事件之间的因果关系时，体内光传递与神经元反应同步记录的结合是一个关键步骤。本文所述的方法与硬件为在啮齿类动物中实施用于体内固定头部记录的光遗传学技术提供了简明可行的方案。

以精确的时间控制方式激活或沉默神经环路中特定细胞类型的能力，对于理解神经环路如何处理情绪与认知相关的信息至关重要。以往对完整神经活动的实验操控依赖于功能缺失/获得工具（例如，电刺激、药物调节、损毁），但这些方法在时间或空间尺度上均无法实现对特定神经元群体的精准调控。为直接应对这些技术挑战，可遗传编码的光敏感工具的开发与应用使神经科学家能够在明确定义的行为事件期间控制特定细胞类型的电活动。这些光敏感蛋白大多来源于微生物，其中应用广泛的是光门控阳离子通道——通道视紫红质-2（ChR2）1，以及光驱动氯离子泵——盐视紫红质（NpHR）2,3。
光遗传学的一个主要优势是能够在异质性脑区中对特定细胞群体进行基因靶向，该技术已成功应用于多种模式生物（从无脊椎动物到非人灵长类动物）4-6。目前已开发出多种光遗传学转基因动物，并可商业化获取7,8，但建立转基因品系往往耗时耗力且成本高昂。本文介绍一种利用重组腺相关病毒（AAV）载体，在大鼠前边缘皮层和背侧下托中通过CaMKIIα启动子驱动ChR2和NpHR基因表达的病毒介导递送方案。在前脑中，CaMKIIα的表达特异性地局限于谷氨酸能锥体神经元9。AAV因其生产相对简便、无致病性以及能够实现强而持久的外源基因表达，已被广泛用于基础研究10。此外，我们还概述了在麻醉固定头部的大鼠中同步进行光递送与电生理记录的操作步骤及相关硬件配置。

<table><tbody><tr><td>注射器 </td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>可拆卸针头</td><td>Hamilton</td><td>7803-03</td><td>31 规格，斜面尖端</td></tr><tr><td>微量注射泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>泵控制器</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>硅油</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12728</td><td></td></tr><tr><td>激光防护眼镜</td><td>Kentek</td><td>KMT-4501</td><td></td></tr><tr><td>多模光纤</td><td>Thorlabs</td><td>BFL37-200</td><td>200 &amp;mu;m 直径纤芯，0.37 数值孔径</td></tr><tr><td>光纤剥线工具</td><td>Thorlabs</td><td>T12S21</td><td>适用于 200 &amp;mu;m 直径纤芯的多模光纤</td></tr><tr><td>光功率计</td><td>Lumiphy LLC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lumiphy.com/&quot; target=&quot;_blank">www.lumiphy.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>光电探测器</td><td>Newport</td><td>818-SL/DB</td><td></td></tr><tr><td>蓝光激光器（445–473 nm，100–200 mW）</td><td>Lumiphy LLC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lumiphy.com&quot; target=&quot;_blank">www.lumiphy.com&lt;/a&gt;</td><td>通过 FC/PC 适配器耦合至 200 &amp;mu;m 多模光纤</td></tr><tr><td>绿光激光器（532 nm，100–200 mW）</td><td>Lumiphy LLC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lumiphy.com&quot; target=&quot;_blank">www.lumiphy.com&lt;/a&gt;</td><td>通过 FC/PC 适配器耦合至 200 &amp;mu;m 多模光纤</td></tr><tr><td>钨/光纤光记录电极</td><td>Lumiphy LLC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lumiphy.com/&quot; target=&quot;_blank">www.lumiphy.com&lt;/a&gt;</td><td>Lumitrode</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-566</td><td></td></tr><tr><td>液压显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MO-22</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Kation Scientific</td><td>ExAmp-20K</td><td></td></tr><tr><td>数据采集设备</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6009</td><td></td></tr><tr><td>记录用啮齿类动物头部固定装置</td><td>Lumiphy LLC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lumiphy.com/&quot; target=&quot;_blank">www.lumiphy.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>小型动物立体定位仪</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 963</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

光遗传学方法已成为阐明多种物种中与各种行为相关的神经环路活动的有力工具。源于微生物的光遗传学工具包含光敏感的膜蛋白，可在与行为相关的时间尺度上，对特定基因型定义的细胞类型实现神经活动的激活（例如，通道视紫红质-2，ChR2）或抑制（例如，盐视紫红质，NpHR）。我们首先展示了一种简单的方法，通过腺相关病毒介导将ChR2和NpHR转基因递送至大鼠的背侧下托区和前额叶皮层的前边缘区域。由于ChR2和NpHR具有基因靶向性，我们描述了如何利用该技术以高时间精度调控嵌于异质组织中特定神经元群体（即，锥体神经元）的电活动。本文介绍了相关硬件、定制软件用户界面以及实验流程，可在麻醉状态下的活体in vivo制备中，实现对转导的锥体神经元同步进行光刺激和电生理记录。这些光响应工具为明确不同类型细胞在信息处理和行为中的因果性作用提供了可能。

图1展示了在LabVIEW环境（National Instruments）中开发的定制软件（NeuroLux Pro）的截图，该软件用于同时记录神经元活动并控制光脉冲参数（即脉冲频率、脉冲宽度、刺激时长）。该软件向数字采集设备发送指令信号，以生成TTL脉冲，从而控制单个二极管激光器。此外，该软件还显示并存储记录的神经元活动信号以及输出的TTL信号。这些信号通过采集设备以设定的采样率（例如，20 kHz）进行数字化处理，并以二维双精度数组的形式保存为二进制文件。
图2显示了定制的光探针，其由附接光学纤维的钨电极组成。使用细缝合线在三个点位将光纤固定到电极上。如有需要，可使用少量瞬间胶粘合。但应避免将光纤永久性地固定在电极上，因为尽管电极可重复使用多次，光纤的光传输性能会随着重复使用而下降，每次插入脑组织前均应切割并清洁光纤端面，或予以更换。
左侧面板 图3 显示增强型黄色荧光蛋白的荧光图像，以指示 ChR2 和 NpHR 的实际表达。这些照片展示了大鼠背侧下托中具有代表性的 NpHR 表达情况（图 3A) 以及前边缘皮层中 ChR2 的表达（图3B）。病毒表达主要局限于背侧下托和前边缘皮层（例如 在齿状回中观察到一些荧光（图 3A，左图）。还可观察到电极的轨迹（细轨迹，箭头）和光纤的轨迹（粗轨迹，箭头）。
左侧面板 图4 表明ChR2可在大鼠前边缘皮层诱导出时间上精确的神经元放电。 图 4A 是ChR2触发的动作电位示例轨迹，响应对大鼠前边缘皮层以20 Hz频率递送的10毫秒蓝光脉冲。点阵图（图 4B) 显示了ChR2诱导的六个代表性神经元的激活情况。所有记录的神经元均表现出由光刺激引发的动作电位，且响应具有完美的保真度。与ChR2相反，NpHR可快速且可逆地抑制神经元的自发活动。 体内 大鼠前边缘皮层（右侧面板） 图4). 图 4C 是一条示例轨迹，显示在CaMKllα启动子驱动下表达NpHR的前边缘皮层在持续532 nm光照（10秒）条件下，自发的单单位放电活动被消除 体内请注意，前边缘区锥体细胞活动的完全沉默与持续10秒的光传递在时间上精确同步。下方的点阵图（图 4D) 显示了NpHR诱导的六个代表性神经元的沉默。两者 体内 记录来自成年Sprague-Dawley大鼠，这些大鼠在18至21天前接受了腺相关病毒介导的微生物视蛋白基因递送。
图5展示了对大鼠前边缘区锥体神经元重复进行ChR2刺激的结果。以20 Hz的频率给予持续5秒的蓝光脉冲刺激（共100次脉冲，每次10毫秒）。在2小时的记录过程中，每隔2分钟重复采集一次光诱发的动作电位电压轨迹（共61次重复）。即使采用这种重复刺激方案，ChR2仍能对光刺激产生稳定且强烈的放电反应。
图6和图7展示了NpHR诱导的光抑制和ChR2驱动的光激活对大鼠下托神经元活动的影响结果。与前边缘皮层的情况类似，NpHR和ChR2能够以高度可重复的方式介导光诱导的、时间锁定的抑制和激活，从而调控表达视蛋白的下托神经元活动。
<img alt="光遗传学波形分析，显示振幅随时间变化的图表，光刺激研究。" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. NeuroLux Pro 软件界面的截图，用于同步光传递与电生理记录。图中迹线显示，在持续10秒的532 nm光照下，NpHR诱导大鼠前边缘区锥体细胞的自发放电活动被抑制。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="静态平衡示意图；玻璃毛细管、钨电极、光纤、结；2 mm 比例尺。" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 自制光遗传电极的高倍图像。将一根光纤插入连接至钨电极的玻璃毛细管中，并使用缝合线将其固定在电极上。电极尖端与光纤尖端之间的中心间距约为 500 μm。
<img alt="脑切片荧光显微镜图像及示意图；突出显示海马体中的CA1、DG、SUB和PL区域。" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 病毒表达与光电极放置。（左）照片显示背侧下托（A）中NpHR的代表性表达以及前边缘皮层（B）中ChR2的表达。（右）示意图表示每张照片所拍摄位置。每张照片中的箭头和箭分别指示钨电极和光纤的位置。SUB：下托，DG：齿状回，PL：前边缘皮层。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="神经元信号图与带有微伏（μV）和时间刻度的峰电位时序图；电生理学数据。" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 来自转导 ChR2 或 NpHR 的大鼠前边缘皮层的体内电生理记录。（A）在蓝光（473 nm）脉冲刺激（10 毫秒，蓝色条）下，ChR2 触发的动作电位示例轨迹。（B）光栅图显示六个代表性神经元中由 ChR2 诱导的放电活动，每个神经元的活动以点表示。（C）在持续绿光（532 nm）照射（10 秒，绿色条）期间，NpHR 诱导自发活动抑制的示例轨迹。（D）光栅图显示六个代表性神经元中由 NpHR 诱导的沉默效应，每个神经元的活动以点表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="Neural activity recording; waveform chart and spike raster plot; electrophysiology analysis." src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 大鼠前边缘区锥体神经元由ChR2介导的20 Hz重复性放电 体内. (A) 光刺激诱发的放电活动电压迹线，记录于开始记录后的 0、30、60、90、120 分钟时间点。B光诱导激活的点阵图，显示全部61次重复（试次间间隔2 min，总计120 min）。每个神经元活动以点表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.
<img alt="神经信号分析；动作电位波形与峰电位序列；电生理结果。" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 来自表达NpHR的大鼠背侧下托区的体内电生理记录。（A）示例轨迹显示，对表达NpHR的背侧下托区进行10秒连续532 nm光照（绿色条）可消除自发性活动。（B）来自上述轨迹中两个记录单元的平均波形。采用振幅阈值来识别两个不同的神经元。（C）栅格图显示NpHR诱导的这些单元沉默的五次重复结果。每个单元的活动以一个点表示。
<img alt="Neural activity graph and spike raster plots showing electrical bursts over time intervals." src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 大鼠背侧下托神经元在重复20 Hz CR2驱动下的放电活动 体内. (A) 光诱导放电的电压迹线，记录于开始记录后的 0、30、60、90、120 分钟时间点。插图：该细胞典型的簇状放电活动。B光诱导激活的栅格图，显示了全部61次重复（试次间间隔2分钟，总计120分钟）。每个神经元活动以点表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.

神经科学领域近期发展出了一种结合遗传学与光学技术的工具，称为“光遗传学”，该技术能够以前所未有的空间和时间分辨率调控神经环路的活动。本文提供了一种整合光遗传学 体内 利用光遗传学操控前额叶皮层和下托中基因定义的锥体神经元亚群并进行记录。

光遗传学方法已成为揭示广泛行为背后神经环路活动的有力工具……

以下实验的总体目标是在生理学相关的时间尺度上快速激活或抑制特定基因定义的神经元群体。该目标通过递送携带转基因的病毒载体实现，这些转基因编码蓝光激活神经元的通道视蛋白或绿光抑制神经元的卤视蛋白，靶向特定基因定义的神经元。第二步是构建一个发光的光路装置，该装置由固定在记录电极上的光纤组成，可同时实现光递送和电生理记录。接下来，将TRO定位并降低至视蛋白转导的脑区。为了诱发通道视蛋白和ha视蛋白介导的反应，通过单细胞记录技术获得结果，该技术可记录单个神经元的活动，从而显示光诱导的通道红视蛋白和ha哈啉转导神经元的激活与抑制效应。该方法通过毫秒级时间分辨率，在特定神经元亚型中精确确定光驱动神经元活动的有效性，满足了神经科学领域的一项基本需求，而这一演示将由Chin Nakamura完成。我实验室的一名博士后。在准备和处理病毒时，确保遵循生物安全一级操作规程，并遵守所有与动物相关的本地和政府指南。在进行立体定位注射前，将一份病毒溶液置于冰上解冻，然后短暂离心。在台式离心机中，用少量硅油或矿物油缓慢回填 Hamilton 玻璃注射器和针头。确保注射器筒内无可见气泡。将注射器插入微型注射泵，并将泵直接连接至垂直立体定位臂。将病毒分装管固定于稳定位置后， lowering the stereotaxic arm until the tip of the needle touches the bottom of the virus aliquot tube.使用显微注射泵的控制器抽取所需体积的病毒。用氯胺酮和赛拉嗪麻醉大鼠后，通过夹捏脚趾检查其反射反应，以确保麻醉深度达到标准无菌操作要求。用小型手术剪刀或解剖刀在动物颅骨顶部的皮肤上做正中切口后，将动物固定于立体定位仪中。轻轻分离结缔组织，用小型骨刮匙清理颅骨顶部。降低针头，确认前囟（bgma）和后囟（lambda）的Z坐标相等，以确保头部处于水平位置。然后将立体定位仪的机械臂移至对应目标脑区的坐标位置。使用手术笔标记预定的注射位点。用手持钻在目标区域上方小心地磨薄颅骨。当钻头到达颅骨底部时停止操作，然后使用一把超细镊子去除磨薄的骨片。暴露硬脑膜后，将注射器针头置于目标区域上方，缓慢下放针头直至接触硬脑膜。利用此接触点确定Z坐标，随后非常缓慢地将注射针插入脑组织，直至达到正确的Z位置。在本方案中，靶向内侧前额叶皮层的前肢区域。以每分钟0.1微升的速度注射病毒。注射完成后，等待10分钟再撤出针头，以避免病毒回流至脑表面。使用带针缝合线缝合皮肤后，对伤口涂抹抗生素。首先，使用超级胶水将一个1至1.5兆欧的钨电极固定在玻璃毛细管上。然后使用光纤剥线工具暴露多模光纤的裸露端，并用乙醇轻轻清洁光纤端面。用楔形金刚石刀在光纤末端刻痕，并使用精细镊子小心去除多余的光纤。光纤应在刻痕处轻易断裂。使用光功率计测量光纤末端的激光强度。对于体内记录，低至20至100毫瓦每平方毫米的光强即可可靠地分别诱导红光敏感通道蛋白channel redsin或hallin介导的神经元活动激活或抑制。接下来，将光纤插入毛细管中。将光纤尖端置于钨电极尖端上方约500微米处，并在靠近尖端的几个位置用细缝合线缠绕两圈，使电极与光纤保持平直。确保电极尖端与最近的结之间有足够的距离，以便插入到目标区域，如图所示。按照之前的方法准备动物进行手术。然后以最初的开颅位置为引导，在颅骨上制作一个新的、干净的小窗口。进行TRO定位时，使用细针在硬脑膜上做一个小切口。利用显微操作仪，小心地将TRO通过颅骨窗口缓慢下降至脑内已转导的区域。然后以10至50微米的步长缓慢推进离焦位置，直至出现对光有反应的细胞。此处使用基于LabVIEW编写的自定义软件用户界面，用于控制单二极管激光器，并实时可视化和记录神经活动。记录的信号通过ExAmp 20K放大器采集，经0.3至8千赫兹的带通滤波，并由国家仪器公司（National Instruments）的模拟-数字转换板进行数字化处理。神经光 Pro 用户界面允许选择模拟输入和数字输出。为神经信号和晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号各选择两个模拟通道。将采样率设置为 20 千赫兹，光照前基线期设置为 2 秒，光照后时期设置为 2 秒。然后设置TTL激光刺激的脉冲宽度、频率和刺激持续时间。此处频率为20赫兹，刺激持续时间为500毫秒，即在此期间将递送10个具有特定脉冲宽度的激光脉冲。用户可选择连续光照或重复记录模式。他们可以选择脉冲之间的间隔以及脉冲序列的数量。数据可以在记录到磁盘的同时或不同时进行采集。记录结束后，按照批准的程序处死动物，并处理脑组织以验证电极植入位置和视蛋白表达，如下图所示。该图显示 Neuro LX Pro 软件界面的截图，设置用于同步进行光刺激和电生理记录，展示了 Hall Rod Dobson 实验中，持续 10 秒、波长为 532 纳米的光刺激诱导背外侧下托前边缘旁体细胞自发活动沉默的现象。该照片展示了背侧海马伞部具有代表性的 hallo redsin 表达。右侧示意图表示该照片拍摄的位置。箭头表示光纤的位置，箭头指示了钨电极的位置。该照片显示了前肢皮层中通道视紫红质的代表性表达情况。右侧的示意图表示该照片的拍摄位置。箭头指示钨电极的位置，箭头指示光纤的位置。此示例迹线记录自大鼠前肢皮层，显示在蓝色条形标记处，以每秒20次（20赫兹）、每次持续10毫秒的频率递送473纳米蓝光脉冲后，channel redsin引发的两次触发动作电位。下方的点阵图显示了channel redsin在六个代表性神经元中诱导的放电活动。每个单元的活动以点的形式绘制。该示例轨迹显示，在持续的绿色 532 纳米光照（如绿色条所示，持续 10 秒）下，同一脑区中视蛋白诱导的自发活动受到抑制。列阵图显示了六种代表性神经元中视蛋白诱导的沉默效应。每个单位的活动以点的形式绘制。该图像显示了大鼠前边缘副边缘神经元在体内由20赫兹通道视蛋白驱动的重复性放电。左侧展示了记录开始后0、30、60、90和120分钟时间点采集的光诱发放电的电压轨迹。右侧的点阵图展示了光诱导激活的全部61次重复。每个单位的活动以一个点表示。上方显示的是来自表达Haller Dossin的转导大鼠背侧脊髓的体内电生理记录。示例轨迹表明，由绿色条形指示的对表达Haller Dobson的背侧脊髓进行532纳米连续光照10秒，可消除自发性活动。以下是来自上述记录的两个记录单元的平均波形。采用振幅阈值来识别两个不同的神经元。最后，点阵图显示了Haller dossin诱导这些单元沉默的五次重复结果。每个单位的活动以点的形式绘制。最后，该图像显示了大鼠背侧下丘脑神经元在体电压记录中，由20赫兹重复光敏通道蛋白驱动的放电情况，这些光诱发的放电活动分别在记录开始后的0、30、60、90和120分钟时间点采集。图像左侧展示了记录开始后的整体活动，下方插图显示了该细胞典型的簇状放电活动。右侧的点阵图显示了光诱导激活的全部61次重复。每个神经元的活动以点表示。该技术的重要性在于，它证明了特定的神经元亚型可以被长期激活或抑制。事实上，我们已经证明，可以激活神经元超过两个小时，并将其应用于动物。最终目标是将该技术应用于执行注意力或记忆任务的动物，以便我们能够激活特定的神经环路，并观察其如何调控不同的记忆功能。

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单个锥体神经元的高保真光遗传学控制方法<em&gt;在体内</em

本视频展示了利用光遗传学方法，通过激活小鼠脑切片中经基因改造的光敏感性中间神经元，调控海马网络动态，增强θ振荡同步性，并研究神经环路行为的技术流程。...

光遗传学调控海马网络动态

本文描述了一种在新皮层预定义的功能微区中用荧光染料标记神经元的方法。首先，利用内在信号光学成像获取功能图谱；然后，采用双光子显微镜对图谱中特定微区内的神经元进行标记和成像。...

结合内在信号成像与双光子成像技术实现新皮层特定功能微区神经元的靶向标记

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in vivo 光遗传学刺激啮齿类动物中枢神经系统

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光遗传学鉴定皮层抑制性中间神经元的体内单细胞记录指南

本文介绍了一种从离体全海马组织中记录节律性神经元网络theta和gamma振荡的实验方案。我们详细描述了从海马提取到局部场电位、单细胞单位放电以及全细胞膜片钳记录的实验步骤，同时涵盖了theta节律的光遗传学调控方法。...

调节海马θ节律频段 体外：记录离体啮齿类动物隔-海马环路的方法

本方案描述了一组利用离体脑片中的光遗传学刺激，鉴定来自远端脑区的长程输入的细胞类型特异性功能连接的方法。...

在体小鼠脑切片中长程投射通路的光遗传学刺激：颅内立体定位注射方法

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可在自由活动的动物中以高时空分辨率调控其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控及行为学检测。...

光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

本实验方案描述了如何在自由活动的小鼠中，将无线光遗传学技术与高速视频记录相结合，用于单颗粒取食抓握任务，以表征参与精细运动行为的神经环路。...

在体 无线光遗传学控制精细运动行为

我们开发了一种简化且经济高效的电极制备方法，并在自由活动的小鼠中实现了多个脑区信号的记录。结合光遗传学、多脑区电生理记录和钙信号记录，揭示了癫痫点燃模型中跨脑区的神经元活动特征。...

一种用于多区域体内记录的灵活便捷电生理光导电极的集成制备方法

了解光遗传学技术在体内精确操控单个锥体神经元的方法，通过病毒载体递送光敏蛋白并结合光纤电极同步记录，实现毫秒级时间分辨率的神经活动激活与抑制，为神经环路研究提供高保真工具。

一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

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