一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

以下实验的总体目标是在生理相关的时间尺度上快速激活或抑制基因定义的神经元群体。这一目标通过递送携带转基因的病毒载体来实现，这些转基因编码蓝光激活神经元的通道视蛋白或绿光抑制神经元的卤视蛋白，作用于特定基因定义的神经元。第二步是构建一个发光的光路，该光路由固定在记录电极上的光纤组成，可同时实现光递送和电生理记录。

接下来，将TRO置于视蛋白转导的脑区上方并缓慢下放。为了诱发通道视蛋白和ha视蛋白介导的反应，通过单细胞记录技术获得结果，该技术可记录单个神经元的活动，从而显示光诱导的通道红视蛋白和ha哈啉转导神经元的激活与抑制效应。该方法满足了神经科学领域的一项基本需求，使我们能够精确确定光在毫秒级时间分辨率下驱动特定神经元亚型活动的有效性， Chin Nakamura 将对此进行演示。

我实验室中的一名博士后。在准备和处理病毒时，确保遵循生物安全一级操作规程，并遵守所有与动物相关的当地和政府规定。在进行立体定位注射前，将一份病毒样品置于冰上融化，然后短暂离心。在台式离心机中，用少量硅油或矿物油缓慢回填 Hamilton 玻璃注射器及针头。

确保注射器筒内无可见气泡。将注射器插入微量注射泵，并将泵直接连接至垂直立体定位臂。将病毒分装管固定于稳定位置后， lowering the stereotaxic arm until the tip of the needle touches the bottom of the virus aliquot tube.

使用显微注射泵的控制器吸取所需体积的病毒。用氯胺酮和赛拉嗪麻醉大鼠后，通过夹捏脚趾检查其反射反应，以确保麻醉深度达到要求，并采用标准无菌方法操作。用小型手术剪刀或手术刀在动物颅骨顶部的皮肤上做正中切口后，将动物置入立体定位仪中。

轻轻分离结缔组织，并用小型骨刮匙清洁颅骨顶部。降低针头，确认bgma和lambda的Z坐标相等，以确保头部处于水平位置。然后将立体定位仪的机械臂移至对应于目标脑区的坐标位置。

使用手术笔标记预期的注射位点。使用手持钻在目标区域上方小心地磨薄颅骨。当钻头到达颅骨底部时停止，并使用超细镊子去除磨薄的骨质。

硬脑膜暴露后，将注射器针头置于目标区域上方，缓慢下放针头直至接触硬脑膜。以此点确定Z坐标，随后非常缓慢地将注射针插入脑组织，直至达到正确的Z位置。

在本实验方案中，靶向内侧前额叶皮层的前肢区域。以每分钟0.1 µL的速度注射病毒。注射完成后，等待10分钟后再撤出针头，以避免病毒回流至脑表面。

使用带针缝合线缝合皮肤后，对伤口涂抹抗生素。首先，用瞬间胶将一个1至1.5兆欧的钨电极固定在玻璃毛细管上。然后使用光纤剥线工具露出多模光纤的裸露端，并用乙醇轻轻清洁光纤端面。

用楔形金刚石刀在光纤端面划痕，并用精细镊子小心去除多余的光纤。光纤应在划痕处轻易断裂。使用光功率计测量光纤尖端的激光强度。

对于体内记录，低至每平方毫米20至100毫瓦的光强度即可可靠地分别激活或抑制神经元活动，该过程由红光敏感通道蛋白（channel redsin）或哈林蛋白（hallin）介导。接下来，将光纤插入毛细管中。使光纤尖端位于钨电极尖端上方约500微米处，并在靠近尖端的几个位置用细缝合线缠绕两圈，以确保电极与光纤保持平直。

确保电极尖端与最近的结节之间的距离足够长，以便插入到目标区域，如图所示。按之前的步骤准备动物进行手术。然后以最初的开颅位置为引导，在颅骨上制作一个新的、干净的小窗口。

用于定位探针。使用细针在硬脑膜上做一个小切口。借助显微操作器，将TRO通过颅骨窗小心地插入脑内，直至转导区域。

然后以10至50微米的步长缓慢推进离轴位置，直至出现对光有反应的细胞。此处使用基于LabVIEW编写的自定义软件用户界面来控制单二极管激光器，并实时可视化和记录神经活动。记录到的信号通过Ex AMP 20 K放大器进行采集，带通滤波范围为0.3至8千赫兹，并由国家仪器公司（National Instruments）的模拟-数字转换板进行采样。

Neuro Lux Pro 用户界面允许选择模拟输入和数字输出。为神经信号和晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号各选择两个模拟通道。将采样率设置为 20 千赫兹，光照前基线期设置为 2 秒，光照后时期设置为 2 秒。

然后设置TTL激光刺激的脉冲宽度、频率和刺激持续时间。此处频率为20赫兹，刺激持续时间为500毫秒，即会输送10个具有特定脉冲宽度的激光脉冲。用户可选择连续光照输出，或进行重复记录。

他们可以选择脉冲之间的间隔以及脉冲序列的数量。数据可以在记录到磁盘的同时或不记录到磁盘的情况下进行采集。记录完成后，根据批准的程序处死动物，并对脑组织进行处理，以验证探针放置位置和视蛋白表达，如下图所示。

该图显示了 Neuro LX Pro 软件界面的截图，设置用于同步进行光刺激和电生理记录，图中展示了 Hall Rod Dobson 实验条件下，持续 10 秒 532 纳米光照诱导的背侧下边缘前边缘副中线细胞自发活动的抑制。该照片展示了背侧 ulu 区域典型的 hallo redsin 表达。右侧示意图表示该照片拍摄的位置。

箭头表示钨电极的位置，箭头指示光学纤维的位置。该照片显示了前边缘皮层中通道视紫红质的代表性表达情况。右侧示意图表示该照片拍摄位置的示意图。

箭头表示光学纤维的位置，箭头指示钨电极的位置。此示例轨迹记录自大鼠前肢皮层，显示在蓝色条所示条件下，以 20 赫兹频率递送每次持续 10 毫秒的蓝色 473 纳米光脉冲，引发通道红菌视蛋白（channel redsin）两个触发的动作电位。下方的列点图显示通道红菌视蛋白在六个代表性神经元中诱导的放电活动。

每个神经元的活动以点的形式绘制。该示例轨迹显示，在持续10秒的绿色532纳米光照下（由绿色条指示），同一脑区中hAll视蛋白诱导的自发活动受到抑制。散点图显示了hAll视蛋白在六个代表性神经元中诱导的沉默效应。

每个单位活动以一个点表示。该图像显示了在活体中由20赫兹通道视蛋白驱动的大鼠前额顶叶后部神经元重复性放电。在记录开始后的0、30、60、90和120分钟时间点采集到的光诱发放电电压轨迹显示在左侧。右侧的列阵图展示了光诱导激活的全部61次重复。

每个神经元活动以一个点表示。上方显示的是来自转导了Haller Dossin的雄性大鼠背侧海马区的体内电生理记录。示例轨迹表明，由绿色条指示的对表达Haller Dobson的背侧亚区持续532纳米光照10秒可消除自发性活动。

以下是上述记录轨迹中两个记录单元的平均波形。采用幅度阈值来识别两个不同的神经元。最后，列点图显示了五次重复的Haller dossin诱导的这些单元沉默效应。

每个单位活动均以一个点表示。最后，该图像显示了在体内记录的大鼠背侧下丘脑神经元的重复性20赫兹通道视蛋白驱动的放电活动，即在记录开始后的0、30、60、90和120分钟时间点获取的光诱发放电的电压轨迹。左侧显示的是记录开始后的数据，下方插图展示了该细胞典型的簇状放电活动。

右侧的点阵图显示了光诱导激活的全部61次重复。每个神经元的活动以一个点表示。该技术的重要性在于，它证明了特定的神经元亚型可以被长期激活或抑制。

事实上，我们已经证明可以激活神经元超过两个小时，并将其应用于动物。最终目标是将该技术应用于执行注意力或记忆任务的动物，以便我们能够激活特定的神经环路，并观察其如何调控不同的记忆功能。