鸡胚脊髓切片培养方案

本实验的总体目标是培养鸡胚组织切片，以维持正常的神经元发育，特别是脊髓运动神经元的发育。该目标通过以下步骤实现：首先解剖鸡胚，去除内脏器官；第二步是将鸡胚包埋于琼脂糖块中，随后进行组织切片的制备。

接下来，小心地将胚胎切片从琼脂糖中取出。最后一步是将胚胎切片转移至培养基中，在37摄氏度下孵育24小时。最终，通过培养后对胚胎切片进行薄切片的免疫荧光显微镜检测，以显示脊髓运动神经元的存在及其定位。

因此，该方法有助于解决发育神经生物学领域中的关键问题，例如参与脊髓运动神经元迁移的机制和分子。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为在实验方案的解剖步骤中需要格外细致的操作。

将10枚受精卵水平放置于强制通风孵育箱中，使卵的长轴呈水平方向，在38摄氏度下孵育至发育至汉堡期及Hamilton 24期，通常需要约4天的孵育时间。在孵育的第二天，用浸有70%乙醇的纸巾擦拭卵壳进行消毒，然后使用连接在5毫升注射器上的21号针头小心刺穿卵的钝端，抽出5毫升蛋清。

这会使胚胎远离蛋壳，从而在打开蛋壳时避免损伤胚胎。将鸡蛋放回培养箱中，继续孵化两天。两天过后，使用钝头的。

进行更多操作。第五步，使用镊子小心刺破蛋壳顶部中央，并移除约9厘米见方的蛋壳。围绕胚胎进行切割，小心取出胚胎并置于HBSS中。

用于解剖。所使用的所有胚胎应接近24期。任何显示异常迹象的胚胎均应弃用。

将含有胚胎的培养皿置于解剖显微镜下。使用两把5号镊子去除羊膜。随后去除绒毛尿囊膜、卵黄囊，并用显微解剖剪沿胚胎腹侧中线剪开，以去除所有内脏器官。

然后用一对镊子夹住胚胎的头端躯干区域。抓住肠道的头端部分和心脏并轻轻牵拉。此时应能清晰观察到胚胎的体节。

现在使用显微解剖剪修剪胸壁。接下来，在上肢芽和下肢芽之间的位置横向将胚胎切成两半。用两把镊子轻轻夹住解剖好的胚胎的腰部一半，将其从解剖液中托出，并使用一段长约五厘米的一次性意大利面移液管转移至干燥的培养皿中。

从底部切取，吸取约 2 毫升熔融的 4%（质量/体积）PBS 中的琼脂糖，将约 0.5 毫升琼脂糖加到胚胎上方，然后用移液器吸入胚胎组织块。将胚胎和琼脂糖转移至可剥离的塑料模具中，注意避免在琼脂糖中引入气泡。

将胚胎轻轻放入塑料模具的琼脂糖孔中，使胸部朝下，并用25号针头确保胚胎保持笔直。琼脂糖孔中还应包含部分正在发育的肢体，因此重要的是将胚胎在琼脂糖孔中垂直放置，以利于肢体发育。将塑料模具置于冰上约两分钟以凝固琼脂糖。在凝固过程中，需注意防止胚胎发生方向改变。

设置 VT 1000 S 切片机，使样品室充满 HBSS 并用冰水包围。使用超级胶水将 aros 组织块固定在振动切片机平台上，然后用剃刀刀片修整组织块，使胚胎部分周围保留 1 至 3 毫米的 aros 组织。

启动振动切片机并开始切片胚胎。选择包含具有明显顶端正中外胚层嵴的肢芽切片，然后将其转移至含有HBSS的培养皿中。通常每个胚胎仅能获得一到两个合适的切片。

使用两根细针轻轻去除组织切片周围的琼脂糖。此步骤必须彻底且小心地进行。向24孔超低吸附组织培养板中所需数量的孔内各加入500微升培养液。

小心地将切片从HBSS溶液中转移至孔板中，每孔放置两到三片切片，然后将24孔板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的组织培养孵育箱中培养24小时。培养结束后，向每孔胚胎切片中加入500微升未缓冲的固定液，并将孔板置于冰上20分钟。随后小心吸除全部溶液，用PBS洗涤三次，每次间隔五分钟。接着向孔中加入含30%蔗糖的PBS溶液，将孔板置于4摄氏度环境中约六小时或更长时间，直至切片完全沉底。

待切片沉底后，将切片转移至洁净的10厘米培养皿中，并吸去多余的蔗糖溶液。随后加入1毫升OCT包埋剂，使切片在20摄氏度下平衡5分钟。将每个切片平整地置于充满OCT包埋剂的可剥离塑料模具中进行包埋。

将模具垂直置于干冰上以使OCT包埋块凝固，然后将OCT包埋块安装到冷冻切片机上，并在零下24摄氏度下平衡约20分钟。随后将每个样本切成15微米厚的切片，并贴附于超粘附载玻片（super frosts plus slides）上。载玻片可保存在零下80摄氏度，直至按照本实验方案文本部分所述进行免疫荧光染色时使用。本图像显示了汉堡-汉密尔顿24期（hamburger and Hamilton stage 24）侧支运动柱形成的状况。

左图中通过LH X one染色显示外侧运动柱的外侧部分。中间图通过Fox P one染色显示外侧运动柱，右图是两个通道的叠加图像。虚线表示中线，DV表示此处的背腹轴。

左侧图显示了LH X one染色结果，再次呈现外侧运动柱外侧部分的状态，中间图显示了Fox P one染色标记的外侧运动柱，右侧为合并图像。这些图像展示了发育至27阶段的情况。这些图像显示，在支持离解颅脑运动神经元细胞存活的培养基中培养的脑片切片中，左侧图显示LH X one的表达，中间图显示Fox P one的表达。

LH X1 在运动神经元中不再表达，尽管通过 Fox P1 的表达可以观察到部分 LMC 细胞的存活。DV 表示脊髓背腹轴的方向，ML 表示脊髓外侧运动柱内外侧轴的方向。在左侧面板中，外侧亚群细胞再次通过 LH X1 染色显示于腹角区域；在中间面板中，LMC 整体通过 Fox P1 染色显示，这些细胞可在含有 4% 小鸡血清和 100 纳克/毫升 CNTF 的培养基中培养的切片中观察到。

请注意，一些侧柱外侧分区运动神经元细胞位于脊髓腹角的外侧位置，如左图中箭头所示。该图像显示了先前所示胚胎在OVO中进行脑片培养后，胚胎切片中LH X1和Fox P1表达状态。该直方图显示了定量分析结果，即同时表达FOX P1和LHX1的侧柱外侧分区细胞所占百分比，与仅表达FOX P1和LHX1的侧柱细胞进行比较。

与在体保持的对照胚胎（代表100%）相比，在不同条件下培养的切片中细胞的阴性数据表明，数据采用学生t检验进行分析。三重星号表示显著性水平低于0.01。在执行本方案时，需特别注意胚胎解剖以及从切片中去除琼脂糖的过程，因为维持肢芽中运动轴突的完整性至关重要。