鸡胚胎脊髓片培养协议
March 25th, 2013
切片文化促进胚胎发育的基因和药理学的扰动操作。然而，文化条件必须确保可以继续正常发展的片内减少环境。我们说明了一个协议，有利于脊髓发育正常进行至少24小时。
该程序的总体目标是培养鸡胚胎切片以维持正常的神经元发育，尤其是脊髓运动神经元的发育。这是通过首先解剖鸡胚胎以去除内脏器官来实现的。第二步是准备并切片嵌入 agarro 块中的胚胎。
接下来，小心地从 agarro 中取出胚胎切片。最后一步是将胚胎切片转移到培养基中，在 24 摄氏度下孵育 37 小时。最终，胚胎切片薄片上的免疫荧光显微镜用于显示培养期后脊髓运动神经元的存在和位置。
因此，这种方法可以帮助解决发育神经生物学领域的关键问题。例如，参与脊髓运动神经元迁移的机制和分子。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在方案的解剖阶段需要很多照顾。
将 10 个受精蛋（最长边）水平放入 38 摄氏度的强制通风孵化器中，直到它们发育到汉堡包和汉密尔顿阶段 24。这通常需要大约四天的孵化。在孵化的第二天，用浸泡在 70% 乙醇中的薄纸擦拭蛋壳消毒，使用连接到 5 毫升注射器的 21 号针头小心刺穿蛋壳的平坦端，并去除 5 毫升白蛋白。
这会使胚胎远离外壳，以便在打开外壳时不会损坏胚胎。将鸡蛋放回孵化器中，再孵化两天。两天过后，使用 blunted。
做更多。第五，用镊子小心地刺穿蛋壳的顶部中间，取出大约 9 厘米见方的蛋壳。切开胚胎周围，小心地取出胚胎并放入 HBSS 中。
用于解剖。使用的所有胚胎都应接近第 24 阶段。任何出现任何异常迹象的胚胎都应丢弃。
将含有胚胎的培养皿置于解剖显微镜下。使用两个 1 号 5 镊子去除羊膜。绒毛膜 Alan 到膜，Alan Tous 和头部接下来通过使用微型解剖剪刀打开胚胎的腹侧中线来去除胚胎的内脏以去除所有内脏。
然后用一对镊子将胚胎固定在喙骨干区域周围。抓住内脏和心脏的喙部并拉动。季刊。您应该能够清楚地看到胚胎体节。
现在使用显微解剖剪刀修剪胸体壁。接下来，在上下肢芽之间横向将胚胎切成两半。使用两个镊子轻轻取出解剖胚胎的腰部一半，将胚胎从解剖溶液中取出，并使用约 5 厘米的一次性意大利面移液器放入干燥的培养皿中。
从底部切开，吸出每体积约 2 毫升熔融 4% 重量。PBS 中的 Aros 在胚胎顶部吸取大约 0.5 毫升的 aros，然后将胚胎块吸入移液器中。将胚胎和 aros 转移到可剥离的塑料模具中，不要在 aros 中引入气泡。
轻轻地将胚胎降低到塑料模具中 aros 的底部，胸段朝下，并使用 25 号针头确保胚胎笔直。agros 还将包含发育中的肢体的一部分，重要的是胚胎垂直放置在 aros 中，以便将塑料模具放在冰上约两分钟。要设置 aros，请注意胚胎在此期间不要改变方向。
设置类似 VT 1000 S foma 的装置，使腔室充满 HBSS 并被冰包围。冷水。使用强力胶将 aros 块固定在 Vibram 平台上，然后用剃须刀片修剪块，使胚胎块周围有 1 到 3 毫米的 aros。
启动颤音并开始切片胚胎。选择包括具有清晰顶端皮肤电脊的肢芽切片，然后将其转移到 HBSS 培养皿中。一般来说，每个胚胎只有一到两个合适的切片。
用两根针轻轻去除组织切片周围的琼脂糖。必须彻底和仔细地完成这项工作。将 500 微升培养液添加到 24 孔超低附着组织培养物所需孔数中。
小心地将切片从 HBSS 溶液转移到孔中，在每个孔中放置两到三个切片，然后将 24 孔板放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的组织培养箱中 24 小时，培养期后以 500 微升无缓冲固定到胚胎切片的每个孔中，并在冰上放置 20 分钟。然后小心吸出总溶液，并在 PBS 中洗涤 3 次，间隔 5 分钟。然后将 30% 蔗糖的 PBS 溶液添加到孔中，将板置于 4 摄氏度下约 6 小时或更长时间，直到切片下沉。
切片下沉后，将切片移至干净的 10 厘米培养皿中，并轻拍多余的蔗糖溶液。然后加入 1 毫升 OCT，让切片在 20 摄氏度下平衡 5 分钟。将每片切片平放在填充有 OCT 的容器中，贴样后剥去塑料模具。
将模具垂直放在干冰上凝固，将 OCT 块安装到低温恒温器上，并在零下 24 摄氏度下平衡块约 20 分钟。然后将每片切成 15 微米的切片，并安装在超级糖霜和载玻片上。载玻片可以储存在零下 80 摄氏度，直到需要进行免疫荧光染色，如方案的文本部分所述，该图像显示了汉堡和汉密尔顿阶段 24 时外侧运动柱的生成状态。
外侧运动柱的横向分裂通过左面板中的 LH X one 染色可视化。侧向运动柱通过用 Fox P 染色来可视化，一个在中央面板，右面板是两个通道的合并。中线显示为虚线，DV 表示这里的背腹轴。
外侧运动柱的横向分裂状态再次由左图中的 LH X one 染色显示，外侧运动柱在中图中由 Fox P one 染色显示，合并图像在右侧。这些图像显示了第 27 阶段的发展。这些图像在支持解离颅运动神经元细胞存活的培养基中培养的切片切片中，左侧显示 LH X 表达，中图显示 Fox P 表达。
LH X one 不再在运动神经元中表达，尽管 Fox P one 表达证明了 LMC 细胞有一些存活。DV 表示脊髓背腹轴的方向，ML 表示脊髓外侧运动柱的中侧轴方向。在含有 4% 鸡血清和 100 纳克/毫升 CNTF 的培养基中，可以观察到侧向分裂细胞，在左图腹角中再次对 LH X one 进行 LH X one 染色，在中图中对 LMC 进行一般染色
。请注意，一些外侧运动柱外侧分裂细胞位于腹角的外侧位置，如左面板中的箭头所示。该图像显示了在先前显示的胚胎切片培养期间保存在 OVO 中的胚胎切片中 LH X one 和 Fox P one 的表达状态。该直方图显示了外侧运动柱侧向分裂细胞（FOX P 1 阳性和 LHX 1 阳性染色）与外侧运动柱细胞（FOX P 1 阳性和 LHX 1 阳性染色）百分比的定量结果。
与保存在卵中的对照胚胎相比，在不同条件下切片培养物中发现的细胞显示阴性数据，代表 100% 数据是使用学生 T 检验分析的。三个星号表示在尝试此协议时显着性水平小于 0.01。解剖胚胎和从切片中取出 agros 时要小心，因为保持肢芽中运动轴突的完整性很重要。
概述
本协议描述了鸡胚切片培养以支持正常脊髓运动神经元发育。该方法确保神经元发育能在受控环境中至少有效进行24小时。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育神经生物学
- 神经科学
- 胚胎学
背景
- 鸡胚切片用于研究脊髓运动神经元发育。
- 正常发育需要仔细操作培养条件。
- 免疫荧光显微镜用于观察神经元结构。
- 了解脊髓运动神经元迁移对发育研究至关重要。
研究目的
- 在鸡胚切片中维持正常神经元发育。
- 研究脊髓运动神经元迁移的机制。
- 为神经生物学研究者提供可靠的协议。
使用的方法
- 解剖鸡胚以去除内脏器官。
- 将胚胎嵌入琼脂糖并切片。
- 在37摄氏度的培养基中孵育切片。
- 使用免疫荧光显微镜观察脊髓运动神经元。
主要结果
- 成功维持脊髓运动神经元发育24小时。
- 通过免疫荧光鉴定脊髓运动神经元。
- 为未来研究建立可靠的协议。
- 对脊髓运动神经元迁移机制的洞见。
结论
- 该协议能够有效研究脊髓运动神经元发育。
- 仔细解剖和培养条件对成功至关重要。
- 这种方法可以帮助解决发育神经生物学中的关键问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables controlled study of spinal motor neuron development in a reduced system, supporting mechanistic de-risking in early neurobiology target validation. By maintaining neuronal survival and migration for 24 hours, it provides a disease-relevant system for evaluating neurotrophic factor dependence and cellular positioning. The approach aids in preclinical model refinement by isolating variables that influence motor neuron survival and axonal integrity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neurotrophic factor requirements for spinal motor neuron survival and migration.
- Operational Value: Reduces confounding variables from systemic drug exposure by using isolated embryo slices.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized platform for quantitative assessment of motor neuron marker expression (LHX1, FOXP1) under defined culture conditions.
- Operational Value: Supports assay reproducibility through consistent slice preparation and immunofluorescence readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains developmental continuity by preserving in vivo-like motor neuron positioning and axonal integrity in limb buds.
- Operational Value: Enables risk-adjusted evaluation of culture conditions that support neuronal development without lethality.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target validation requires phenotypic confirmation of neuronal development in a tractable model.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on molecular mechanisms of spinal motor neuron migration and survival.
- Screening: Delivers quantitative immunofluorescence outputs for comparing experimental conditions.
- Analytics: Enables statistical comparison of marker-positive cell percentages across culture conditions using student’s T-test.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining dorsal-ventral and medial-lateral axonal organization.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable slicing and culture platform for developmental neurotoxicity or neuroregeneration screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in neurotrophic factor dependence and migration mechanisms.
- Operational Value: Standardized dissection, embedding, and slicing procedures reduce variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions on targets affecting neuronal survival pathways.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of compounds or genes based on effects on motor neuron marker co-expression.
Implementation Considerations
- Expertise in microsurgical dissection and embryo handling is required to preserve axonal integrity.
- Vibratome sectioning and agarose embedding infrastructure are essential for consistent slice quality.
- Standardization across teams depends on precise incubation timing, serum type, and neurotrophic factor dosing.
- Adaptation to other model systems requires validation of equivalent developmental stages and marker expression.
- Practical limitations include the 24-hour culture window and dependency on precise embryo staging (Hamburger-Hamilton stage 24).
