Name: 在体内的巨噬细胞成像采用MR靶向造影剂化脓性关节炎的纵向评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-20T21:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 了解使用超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒进行巨噬细胞磁共振成像的方法，用于兔化脓性关节炎模型的纵向评估。该技术可无创监测关节内巨噬细胞浸润及抗生素治疗效果。

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我们衷心感谢 F. Bierry 在视频制作与编辑过程中提供的帮助。

所有涉及动物受试者的实验程序均已获得大学医院机构动物护理委员会的批准。
1. 关节内细菌接种
<ol>
	<li>注射前，通过在竖脊肌内注射氯胺酮（30 mg/kg 体重）与赛拉嗪（4 mg/kg）混合物对兔进行肌内麻醉。通过捏压足掌无反应确认动物已完全麻醉。本方案可为膝关节关节腔注射提供充分麻醉。麻醉期间将动物置于氧气面罩下。</li>
	<li>剃除动物膝关节部位毛发。采用聚维酮碘溶液擦拭与酒精交替清洁三次，进行无菌注射前准备，最后再涂抹一次聚维酮碘溶液。</li>
	<li>使用无菌针帽或无菌探针手动识别膝关节前方的髌腱，其为一弹性结构。</li>
	<li>在直视下，采用前入路法，将25 G&#160;针头经皮穿刺通过髌腱，插入12只兔的右侧膝关节。</li>
	<li>向每侧膝关节注射1 ml浓度为106&#160;CFU/ml的金黄色葡萄球菌（Neumann菌株）细菌悬液。若注射时无明显阻力，提示针尖已位于关节腔内。</li>
	<li>注射操作完成后，将动物置于对流热源下以防止热量散失，并通过观察胸部运动监测呼吸频率。动物苏醒后，将其饲养于笼中，自由摄取食物和饮水。</li>
	<li>通过每8小时给予一次0.1&#160;mg/kg的丁丙诺啡肌内注射来控制疼痛。</li>
	<li>每日对兔进行临床观察，记录食物和水的摄入量、体重变化、体温及整体行为表现。</li>
	<li>为成像感染急性期，当动物出现明显体重下降（10%）时，应尽快进行首次磁共振成像检查；通常发生在约2天后。</li>
	<li>若磁共振检查前需静脉给药，可建立耳缘静脉通路（见下文）。</li>
</ol>
2. MRI检查
在对活体动物进行成像时，细致的动物安置是确保动物舒适和最佳麻醉效果的关键因素。这有助于获得最佳的成像结果，并保证在纵向研究中图像采集的可重复性。由于动物体型较大，使用临床规格的磁共振设备（1.5 T 或 3 T）最为合适。采用8通道临床膝关节线圈，因其能为兔膝关节的探测提供足够的分辨率和信噪比对比度。
<ol>
	<li>在将成像系统安装前，通过耳缘静脉建立外周静脉通路，用于注射对比剂。
	<ol>
		<li>剃除耳部毛发并消毒。</li>
		<li>通过皮下注射利多卡因进行局部麻醉。</li>
		<li>在耳缘静脉内插入25 G导管。</li>
		<li>通过注射1 ml无菌生理盐水评估通透性。</li>
		<li>使用粘性胶带固定导管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过肌肉注射氯胺酮（30 mg/kg 体重）与赛拉嗪（4 mg/kg）混合物使动物麻醉。当动物对足垫夹捏无反应时，表明已完全麻醉。将面罩置于兔面部，以200 ml/min的流速供给氧气。</li>
	<li>完全麻醉后，将动物转移至磁共振成像单元。放置动物时，使双膝位于磁共振线圈中心。将动物下肢完全伸展，使胫骨长轴与磁共振成像仪台面平行。使用尼龙搭扣固定带或沙袋维持下肢处于最佳位置。</li>
	<li>由于麻醉方案允许动物在自主呼吸条件下进入深麻醉状态，因此无需进行心肺功能监测，但必须对动物进行覆盖以防止麻醉引起体温散失。</li>
	<li>MR方案详见于 表1包括最佳安装在内的总采集时间平均约为20分钟。</li>
	<li>在不同平面进行磁共振成像。然而，膝关节的横断面（垂直于胫骨）为参考平面，因其可确保连续纵向检查时图像位置的解剖学可重复性，并实现与组织学切片的最佳对应。</li>
	<li>在完成无增强序列后，通过耳缘静脉通路注射UPSIO对比剂。以150 μmol Fe/kg的单次剂量缓慢注射氧化铁颗粒。随后注射1 ml无菌生理盐水冲洗导管。</li>
	<li>注射后24小时重复进行增强的GRE加权序列扫描。这一延迟时间允许颗粒被巨噬细胞吞噬。</li>
	<li>用于评估药物效应的纵向研究（抗生素、类固醇、抗巨噬细胞抗体） 等等），使用上述方案重复进行连续的磁共振检查。</li>
</ol>
3. 图像分析
<ol>
	<li>进行纵向评估时，应在相同的解剖层面进行测量，并定义一个易于识别的解剖标志。例如，通过髌骨最大直径所在的轴位层面进行扫描，是获得可重复测量结果的可靠方法（图1）。</li>
	<li>使用基于DICOM的软件（如Osirix）或图像处理软件（ImageJ）进行图像分析。</li>
	<li>在ImageJ软件中，使用“&#34;不规则区域&#34;”绘图工具，对USPIO增强的GRE T2加权图像上显示信号减低的滑膜区域进行分割。勾画出信号变暗的滑膜区域后，点击“&#34;分析&#34;”以获取该区域的面积/像素数量（图2）。</li>
</ol>

<ol><li>Madri, J. Inflammation and healing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadri%2C+J+%22Anderson%27s+Pathology%22">Anderson's Pathology</a>. Kissane, J. , 67-110 (1990).</li>
<li>Sephel, G., Woodward, S. Repair, regeneration, and fibrosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSephel%2C+G+%22Rubin%27s+Pathology%22">Rubin's Pathology</a>. Rubin, R., Strayer, D. , 5th ed, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. 71-98 (2008).</li>
<li>Verdrengh, M., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophages+in+Staphylococcus+aureus-induced+arthritis+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Role of macrophages in Staphylococcus aureus-induced arthritis and sepsis.</a> Arthritis Rheum. 43 (10), 2276-2282 (2000).</li>
<li>Heale, J., Speert, D. Macrophages in bacterial infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeale%2C+J+%22The+Macrophage%22">The Macrophage</a>. Burke, B., Lewis, C. , Oxford University Press. Oxford, England. 210-252 (2008).</li>
<li>Bierry, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activity+in+infected+areas+of+an+experimental+vertebral+osteomyelitis+model%3A+USPIO-enhanced+MR+imaging--feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage activity in infected areas of an experimental vertebral osteomyelitis model: USPIO-enhanced MR imaging--feasibility study.</a> Radiology. 248 (1), 114-123 (2008).</li>
<li>Bierry, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+of+macrophages+in+infectious+knee+synovitis%5BTitle%5D)+AND+%22AJR+Am.+J.+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">MRI of macrophages in infectious knee synovitis.</a> AJR Am. J. Roentgenol. 194 (6), W521-W526 (2010).</li>
<li>Lutz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+synovial+macrophages+in+an+experimental+rabbit+model+of+antigen-induced+arthritis%3A+ultrasmall+superparamagnetic+iron+oxide-enhanced+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Detection of synovial macrophages in an experimental rabbit model of antigen-induced arthritis: ultrasmall superparamagnetic iron oxide-enhanced MR imaging.</a> Radiology. 233 (1), 149-1457 (2004).</li>
<li>Weissleder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasmall+superparamagnetic+iron+oxide%3A+an+intravenous+contrast+agent+for+assessing+lymph+nodes+with+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging.</a> Radiology. 175 (2), 494-498 (1990).</li>
<li>Lefevre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septic+arthritis%3A+monitoring+with+USPIO-enhanced+macrophage+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Septic arthritis: monitoring with USPIO-enhanced macrophage MR imaging.</a> Radiology. 258 (3), 722-728 (2011).</li>
<li>Sigovan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid-clearance+iron+nanoparticles+for+inflammation+imaging+of+atherosclerotic+plaque%3A+initial+experience+in+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Rapid-clearance iron nanoparticles for inflammation imaging of atherosclerotic plaque: initial experience in animal model.</a> Radiology. 252 (2), 401-409 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管非特异性的钆基对比剂可提供有关细胞外空间体积和灌注的信息，但通过超小超顺磁性氧化铁（USPIO）增强的磁共振成像进行巨噬细胞成像，能够在无需组织取样的情况下，对感染滑膜内巨噬细胞浸润实现精确的解剖定位和定性评估9。由于USPIO具有高敏感性，即使在感染早期存在的轻微细胞浸润也能被检测出来。在有效的抗生素治疗下，随着病原体被逐步清除，这种浸润被认为会减少，从而导致滑膜内USPIO摄取量降低。由于低信号区域与组织内的铁含量相关，因此USPIO给药后的滑膜信号可被视为一种生物标志物，即对细胞浸润程度的定量表征，并可用于纵向评估10。此外，与其他成像方式（如光学成像或同位素成像）不同，细胞磁共振成像能够生成高分辨率的解剖图像，从而精确定位与细胞相关的信号变化。
巨噬细胞成像能够在无需组织取样的情况下，评估目标组织内细胞的存在与分布情况，从而避免了反复组织取样常带来的两个主要缺陷 体内 侵入性生物研究会改变原生组织的正常生物学特性。此外，在无法耐受重复应激操作的小型动物中，可能无法实现连续的组织取样，从而限制了纵向评估的实施。...

磁共振成像（MRI）被认为是显示感染性滑膜炎的首选影像学方法，因其具有高空间分辨率和良好的软组织对比度。关节炎在MRI上表现为T1加权像低信号、T2加权像高信号，反映了细胞外水分含量的增加；在给予钆基对比剂后出现明显强化，这与组织学所见一致，即由于血管扩张和血管新生导致的血管生成增加。1然而，MRI 常常无法在抗生素治疗期间显示感染的消退，因为在临床和生物学上已愈合的化脓性关节炎患者中，由于细胞外间隙增大（肉芽组织、纤维瘢痕）持续存在，关节内可持续观察到增强信号。2除了细胞外的变化，炎症细胞（包括大量募集的巨噬细胞）会大量浸润受感染的滑膜组织。巨噬细胞在细菌感染的急性和慢性阶段均发挥重要作用。 3它们可诱导清除病原微生物所必需的炎症反应，并协调炎症的消退过程，因为巨噬细胞引发的炎症会持续存在，直到坏死组织被清除，否则将阻碍修复过程的启动4因此，经有效治疗后感染滑膜中巨噬细胞浸润的减少可作为感染消退的可靠指标。细胞成像能够显示病理组织内的特异性细胞浸润。利用靶向对比剂的特异性巨噬细胞磁共振成像已得到广泛研究，并已证明其可用于显示关节炎症或感染。5-7静脉注射后，此类靶向对比剂（如超小超顺磁性氧化铁颗粒，USPIO）会被巨噬细胞等吞噬细胞摄取，并因其磁性特性，导致呈现巨噬细胞浸润的组织发生信号改变8对这些MR信号变化的纵向随访治疗允许进行 体内 无创评估巨噬细胞浸润，而超小超顺磁性氧化铁（USPIO）标记巨噬细胞相关信号变化的减少可表明治疗成功。本报告旨在介绍如何通过巨噬细胞磁共振成像，无创监测化脓性关节炎，以展示滑膜内巨噬细胞浸润的减少。

<table><tbody><tr><td>试剂/材料名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td>备注</td></tr><tr><td>P904</td><td>Guerbet</td><td></td><td>剂量：150 &amp;mu;mol Fe/kg</td></tr><tr><td>氯胺酮（500 mg/ml 氯胺酮）</td><td>Virbac</td><td></td><td>剂量：30 mg/kg</td></tr><tr><td>Rompun（20 mg/ml 塞拉嗪）</td><td>Axience</td><td></td><td>剂量：4 mg/kg</td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Vetoquinol</td><td></td><td>剂量：0.1 mg/kg/8 小时</td></tr><tr><td>BD 22 G，1 英寸</td><td>BD Biosciences</td><td>381423</td><td></td></tr><tr><td>BD 25 G，5/8 英寸</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr></tbody></table>

体内 巨噬细胞成像：利用磁共振靶向对比剂对败血性关节炎进行纵向评估

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

巨噬细胞是启动、发展和调控细菌感染所致炎症反应的关键细胞。在感染早期，巨噬细胞即被大量且持续地募集至脓毒性关节，随着病原体被有效清除，其浸润程度预计会逐渐消退。准确识别 体内 因此，感染关节中巨噬细胞的活性可提供两个主要应用：急性滑膜炎的早期检测和治疗监测。
体内非侵入性检测巨噬细胞可通过使用氧化铁纳米颗粒（如超小超顺磁性氧化铁，USPIO）的磁共振成像实现。经血管内或关节腔内给药后，USPIO 可被活化的巨噬细胞特异性吞噬；由于其磁性特性，可导致含有巨噬细胞浸润的组织出现信号改变。通过定量评估信号丢失区域（即注射颗粒后梯度回波磁共振图像上暗像素的数量），可对浸润程度进行量化，因为该区域的大小与组织内铁含量相关，从而反映摄取 USPIO 的细胞数量。
本文介绍了一种在脓毒性关节炎动物模型中利用超小超顺磁性氧化铁增强的磁共振成像进行巨噬细胞成像的实验方案，可实现对巨噬细胞浸润的早期及纵向体内无创评估，并可用于评价治疗效果。

在未增强的图像上，感染膝关节的滑膜表现为中等信号的弥漫性肿胀，与周围软组织无法区分，而股骨和髌骨则呈现为低信号结构（图1）。
在给予对比剂24小时后的超小超顺磁性氧化铁（USPIO）增强图像上，含有USPIO负载巨噬细胞的滑膜区域将显示信号丢失（图1和图2）。
可利用特异性免疫染色显示滑膜内的巨噬细胞浸润（图3）。普鲁士蓝染色可检测铁颗粒，其表现为蓝色颗粒（图4）。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>GRE T2 加权</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重复时间 (msec)</td>
			<td>450</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>回波时间 (msec)</td>
			<td>4</td>
	...

我们展示了如何在化脓性关节炎中使用超小超顺磁性对比剂（USPIO）进行巨噬细胞磁共振成像，从而实现对巨噬细胞浸润的初始及纵向体内无创评估，并评价治疗效果。

巨噬细胞是细菌感染引发、发展和调控炎症反应过程中的关键细胞。巨噬细胞是……

本实验的总体目标是纵向评估滑膜内巨噬细胞的浸润情况。在利用磁共振成像研究兔类脓毒性关节炎模型时，可通过使用氧化铁颗粒标记巨噬细胞，从而揭示其存在。巨噬细胞在关节炎（尤其是脓毒性关节炎）的发生、发展和消退过程中起着关键作用。在感染关节内对其存在及分布进行活体示踪，可能成为一种有价值的监测手段。抗生素治疗下的病变关节不应出现大量巨噬细胞浸润。巨噬细胞可能因细胞丢失而减少。He R 对比剂如超小超顺磁性氧化铁（USPIO）。静脉注射后，它们可被活化的巨噬细胞特异性摄取。USPIO 由氧化铁核心组成，其晶体尺寸约为 40 纳米。它们作为小型磁体，可产生磁共振信号变化，从而在含有巨噬细胞的组织中显影。从这两幅兔膝关节的轴位 Mr.Mags 图像中可以看出，在给予 U-S-P-I-O 后 24 小时，滑膜区域出现明显且弥散的信号丢失。由于 SPI OED 巨噬细胞的存在，磁共振成像上观察到的暗像素数量与组织内的铁含量相关，因而也与巨噬细胞的数量相关。因此，对与超小超顺磁性氧化铁（U-S-P-I-O）相关的R信号变化进行纵向随访，可以在治疗期间对约翰体内巨噬细胞的存在情况进行活体评估。您好，我叫Guian Bii。我是法国斯特拉斯堡大学医院放射科的助理教授。今天，我们将向您展示如何在脓毒性关节炎动物模型中使用磁共振成像（MRI）进行巨噬细胞成像。在第一部分中，我们的研究人员将向您讲解如何通过直接关节内注射金黄色葡萄球菌在兔膝关节中诱导脓毒性关节炎。随后在第二部分中，我们将演示如何实施MRI检查、如何注射对比剂，以及最终如何分析和利用成像结果。将动物置于专用的隔离笼中，通过注射替来他明和氯胺酮进行麻醉，可维持30分钟的手术麻醉状态。剃除膝关节部位的毛发，并用聚维酮碘擦拭消毒。辨认髌韧带为前方的弹性结构。然后将35号针头穿过此处进入关节腔，注入1毫升细菌悬液。注射时应无阻力，以确认针头位于关节腔内的正确位置。将动物放回笼中，并每天使用肌肉注射牛用镇痛药物进行镇痛治疗。一段时间后，我们观察两天。该动物的自发睡眠运动减少，证实存在关节感染。因此可以进行R检查。将动物放入专用的限制性笼具中。用聚维酮碘擦拭此处。在静脉内插入一根24号导管，并用辅料固定。该静脉通路将用于给予造影剂。通过肌内注射氯胺酮对动物进行麻醉。然后将动物俯卧于MR膝关节线圈内。膝关节完全伸展后，需将双腿固定于MR检查床上，并可用胶带固定以维持伸展状态。该序列是首选，因为它能够实现最敏感的超小超顺磁性氧化铁（U-S-P-I-O）检测。以下是我们目前使用的磁共振（MR）参数示例。在第一次磁共振检查结束时，通过静脉通路缓慢注射U-S-P-I-O，并用1毫升细胞培养基冲洗。第二次磁共振检查在给予对比剂后24小时进行，采用与之前所述相同的检查流程。您可以在左侧看到兔子膝关节的两个轴位T2加权梯度回波图像，未使用对比剂；右侧为给予USPO后24小时的图像。如右图所示，当用USPI标记后，巨噬细胞会因信号丢失而呈现暗像素区域。暗像素的数量与铁含量相关，进而反映载有USPI的巨噬细胞中MicroAge浸润的程度。通过普鲁士蓝染色可在组织学上显示这些铁负荷细胞，其中含铁细胞呈现为蓝色小点。单幅磁共振图像上观察到的暗像素数量可借助不同软件进行计数。以下是一个示例，使用 M SGA 软件，在对当前区域面积进行手动或自动阈值分割后，该软件可提供计数结果。USPA OS MRI 可用于间接评估巨噬细胞的分布情况，这些巨噬细胞可能在治疗过程中被持续监测。巨噬细胞浸润的减少将伴随着活体 MRI 成像中暗像素数量的减少。使用特定的对比剂可无创评估膝关节内巨噬细胞群体。在治疗过程中，无需进行组织取样，即可在天然环境中动态监测巨噬细胞的存在及其分布情况，这对于纵向研究具有重要意义。

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