Name: 调查中枢神经系统修复中受伤范式果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 了解果蝇幼虫腹神经索刺伤损伤模型，用于研究中枢神经系统再生修复机制。该方法结合解剖、共聚焦显微镜成像和延时记录技术，可分析胶质细胞增殖、凋亡及形态变化动态。

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感谢Lim Mei Ann对本文稿的审阅，以及本实验室其他成员在本研究过程中给予的讨论与支持。本研究由山田科学基金会和英国皇家学会短期访问奖学金以及欧盟玛丽·居里国际 incoming 奖学金（GRR）资助K.K.，A.H.的研究则获得英国生物技术和生物科学研究生理事会项目资助（BB/H002278/1）和惠康信托设备资助（073228/Z/03/Z）的支持。

1. 分期幼虫的收集
<ol>
	<li>将15只雌性和15只雄性成年果蝇放入圆柱形有机玻璃笼中，在含琼脂和葡萄汁的培养皿上产卵，添加一小勺酵母糊，在25 °C条件下持续3小时。每天更换培养皿3至4次，并弃去第一次使用的培养皿即 从过夜产卵的平板中移除亲代果蝇，并丢弃第一天的平板。从第二天开始，将含有卵的平板置于25 °C下培养。在收集卵7天后，开始使用新的一批亲代果蝇进行下一轮设置。</li>
	<li>约24小时后，幼虫从卵中孵化。用磨细的画笔或镊子钩取幼虫，将35只幼虫从葡萄琼脂转移至含有标准果蝇培养基（10 ml）的试管中（图1A).</li>
	<li>将含有幼虫的小管在25 °C条件下培养3天（卵孵化后96小时，AEL）。</li>
</ol>
2. 用于培养的幼虫腹神经索解剖
<ol>
	<li>用70%乙醇清洁实验台和双手。将4个染色盒、两对镊子和一根针浸泡在70%乙醇中，然后晾干。</li>
	<li>准备4个染色盒，分别加入以下介质：第一个加入蒸馏水（DW），用于清洗并收集已清洗的幼虫；第二个加入2 ml不含蜕皮酮的Shield和Sang M3昆虫培养基（含1%青霉素和链霉素，简称M3 PS培养基），用于解剖幼虫；第三个加入2 ml M3 PS培养基，用于收集解剖后的腹神经索（VNCs）；第四个加入2 ml M3 PS培养基，用于刺伤VNCs。所有试剂必须预先升温至室温（RT）。</li>
	<li>向含有96小时AEL幼虫的试剂瓶中加入水。然后使用刮铲将瓶中的食物连同幼虫轻轻转移到湿润的纸巾上。将10只幼虫转移至含有蒸馏水的染色盒中以洗去食物残留，共更换蒸馏水6次。随后换为M3 PS培养基。</li>
	<li>将其中一只幼虫转移至含有2 ml M3 PS培养基的染色盒中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，采用标准方法小心解剖幼虫脑组织12，但为尽量减少组织损伤，请特别注意按以下步骤操作：将幼虫背面向上放置，用两对镊子（每只手各持一对）夹住身体前段约三分之一处的背面。在固定前段的同时，用镊子拉离后端，撕开表皮。此时脑和腹神经索应从前半部分的后缘可见。仔细去除脂肪体、肠道和表皮，以分离脑与腹神经索复合体。若腹神经索损伤过重，即使未进行刺伤操作，也可能发生完全或部分退化。请注意以下几点：</li>
</ol>
<ul>
	<li>不要从胸部腹神经索（VNC）上拉扯或撕裂成虫盘和外周神经，以免损伤VNC。切断外周神经时，用两对镊子在相邻位置夹住外周神经，然后用镊子牵拉神经将其切断。成虫盘和口器部分可保留在VNC上。</li>
	<li>将环腺和淋巴腺保留在脑部附着处。</li>
	<li>在靠近脑部且食物含量最少的位置切断肠道。</li>
</ul>
<ol start="6">
	<li>使用剪去尖端并略微扩大的P20移液器，将腹神经索（VNC）转移至含有新鲜M3 PS培养基的染色块中。在转移VNC之前，先用移液器反复吹打用于解剖的培养基，以防止VNC粘附在移液尖上。</li>
</ol>
3. 刺伤损伤至 果蝇 幼虫腹神经索
本部分介绍如何对腹神经索（VNCs）进行刺伤操作，以及如何制备用于延时成像分析和免疫染色的刺伤后VNC样本。刺伤后的培养条件和培养时间详见第5节（用于延时成像分析）和第6节（用于免疫染色）。
<ol>
	<li>在收集到足够的腹神经索（VNC）后（活体成像需4-5个，免疫染色需24个以上），将其中一个转移至含有M3 PS的洁净染色板中。</li>
	<li>在解剖显微镜下调整VNC方向，使其背侧神经纤维网朝上可见（图1B）。此方向是VNC附着于视叶时最自然的摆放位置。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用钨针从背侧以近乎直角的方向手动穿刺，目标为VNC的腹部区域（图1B）。</li>
</ol>
需特别注意以下事项：
<ul>
	<li>仅穿刺一次。</li>
	<li>穿刺至针尖触及玻璃容器底部为止，但需注意避免损伤针尖。</li>
	<li>持针器的杆部在穿刺过程中不得接触培养基。</li>
	<li>在解剖显微镜下无法观察到穿刺伤口。</li>
</ul>
注意：与刺伤无关的退行性变化
该操作可能导致腹神经索（VNC）内出现不同于刺伤损伤的细胞退化现象。退化会导致神经纤维网中出现空洞，有时在未受刺伤的标本皮层中也观察到空洞。若标本的神经纤维网发生退化，或退化广泛累及腹神经索表面，则必须弃用。退化可通过以下方式识别：
<ul>
	<li>刺伤后22小时，胸部外侧/腹侧区域表面粗糙。在极端情况下，腹神经索（VNC）呈现凸出状。</li>
	<li>胸部神经髓质出现孔洞或空泡，通过荧光免疫染色可在背景信号中观察到明显的孔洞。</li>
</ul>
4. 针头和镊子的维护
<ul>
	<li>定期检查针尖是否足够锋利。针尖在多次实验使用后可能会弯曲或变钝。此时，应使用阿肯色石或同等材质的磨石 sharpen 针尖。</li>
	<li>镊子的尖端必须完全贴合。随着使用，尖端可能受损。此时，应使用阿肯色石或同等材质的磨石调整尖端。</li>
</ul>
5. 被刺穿的腹神经索的培养与延时成像记录
为了在活体腹神经索（VNC）中可视化轴突神经纤维网，可使用一种标记所有轴突的GFP蛋白捕获品系——G913；为可视化所有胶质细胞（除中线胶质细胞外），可利用胶质细胞特异性驱动子repoGAL4来表达报告基因UASdsRed S197Y 14。通过将G9果蝇与UASdsRedS197Y;;repoGAL4果蝇杂交，可获得子代幼虫的腹神经索，其中轴突呈绿色、胶质细胞呈红色，可在活体组织中进行成像记录。
<ol>
	<li>汇集4-5个腹神经索（VNC）后，将1个VNC转移至含有2 ml M3 PS的洁净染色盒中，并按照第3节所示方法刺穿VNC的腹部部分。</li>
	<li>将刺过的VNC转移至一个涂有聚-L-赖氨酸的3.5 mm玻璃底培养皿中，该培养皿内含1 ml M3 PS。将VNC背侧朝下放置。用镊子的平坦侧面轻轻推动VNC，使其贴附于培养皿底部。</li>
	<li>缓慢加入1 ml含15% FBS的M3 PS，使FBS的终浓度为7.5%。</li>
	<li>使用激光扫描共聚焦显微镜获取图像。对VNC进行扫描，采集贯穿其整个厚度的Z轴层析图像序列。我们使用的是配备温度控制环境室的Leica SP2倒置共聚焦显微镜。任何性能相当的共聚焦显微镜均可使用，但可能需要对扫描参数进行优化。我们进行时间序列共聚焦显微成像的设置如下：环境室温度：25 °C；20X物镜，4倍缩放；扫描模式为xyzt，分辨率为512×512像素，Z轴步进为1 μm，时间间隔为1小时或2小时。</li>
</ol>
<ul>
	<li>Leica SP2 共聚焦显微镜在扫描时存在文件大小限制。使用这些设置时，可扫描 8-9 个时间点。使用其他共聚焦显微镜时，应能够获取更长时间点的图像序列。 即 长达24小时的时间范围内。</li>
</ul>
6. 损伤并固定后的腹神经索的培养与免疫染色
<ol>
	<li>准备一个 24 孔组织培养板，每孔加入 500 μl 的 M3 PS 7.5% FBS。</li>
	<li>为一个 24 孔组织培养板重复解剖获取超过 24 个 VNC。</li>
	<li>使用切去尖端的 P20 移液枪，从样本池中转移 12 个未穿刺的 VNC 至培养板中，每孔放入 1 个 VNC。</li>
	<li>按照第 3 节所述方法穿刺样本池中剩余的 VNC，将每个穿刺后的 VNC 分别转移至单独的孔中。</li>
	<li>将 24 孔板置于 25 °C 培养箱中，根据实验需求培养一定时间。细胞完整性在至少 24 小时内保持不变。</li>
	<li>培养后，使用切去尖端的 P20 移液枪将 12 个 VNC 转移至含有 250 μl 4% 多聚甲醛 PEM 的 1.5 ml 离心管中。随后小心吸出固定液，注意不要损伤 VNC。每管中保留足以覆盖样本的少量固定液。接着加入新鲜固定液，在室温下轻轻震荡固定 50 分钟。</li>
	<li>用 0.3% Triton X PBS 漂洗 2 次，然后在室温下用 0.3% Triton X PBS 洗涤 2 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>在室温下用含 10% 正常山羊血清的 0.3% Triton X PBS 封闭 VNC 1 小时。样本可在 4 °C 下保存至少一个月。</li>
	<li>在 4 °C 下与一抗共同孵育超过 20 小时。</li>
	<li>用 0.3% Triton X PBS 漂洗 2 次，然后在室温下用 0.3% Triton X PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下与二抗共同孵育超过 16 小时。</li>
	<li>用 0.3% Triton X PBS 漂洗 2 次，然后在室温下用 0.3% Triton X PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟（若使用荧光标记二抗，则需避光操作）。</li>
	<li>用 50% 甘油 : 50% PBS 替换 PBS，作用至少 1 小时。</li>
	<li>再替换为 80% 甘油 : 20% PBS，作用至少 1 小时。</li>
	<li>将一个 VNC 置于显微镜载玻片上由两层透明胶带（约 0.06 mm 厚）形成的窗口中。调整其方向后，盖上盖玻片（18×18 mm）。采用此方法可在一张载玻片上固定两个 VNC。</li>
</ol>
使用多种一抗，可分析损伤后的不同细胞反应（例如细胞数量和细胞形态的变化）。
7. 使用 ImageJ 及多种插件分析数据
如果腹神经索（VNC）未出现与刺伤无关的变性，则无论损伤范围大小，该样本都必须纳入分析。由于刺伤操作是手动完成的，每次造成的损伤大小均有所不同。因此，应尽可能对刺伤效应进行统计学分析。
<ol>
	<li>伤口大小测量。伤口的大小是组织修复的一个指标15。刺伤损伤区域表现为无GFP表达。可使用免费的ImageJ软件通过时间序列图像数据测量损伤面积，步骤如下：
	<ol>
		<li>在ImageJ中，从“文件”菜单打开共聚焦图像序列，选择“导入”，然后选择“图像序列”。这会将一系列单独的图像转换为一个图像栈。</li>
		<li>接着，通过“图像”菜单选择“超栈”（Hyperstack），再选择“图像栈转超栈”（Stack to Hyperstack），将“图像栈”转换为“超栈”。</li>
		<li>通过“图像”菜单中的“属性”（Properties）设置体素尺寸。使用Leica SP2共聚焦显微镜获取的数据，其体素尺寸可从扫描软件或与图像一同保存的元数据文本文件中获得。根据第3节所述设置，像素尺寸为xy=0.366211 μm，z=0.99709 μm。</li>
		<li>检查同一时间点的所有光学切片，使用工具栏中的多边形选择工具勾勒出损伤区域的最大轮廓。此区域即为感兴趣区域（Region Of Interest, ROI）。</li>
		<li>通过“分析”菜单，向下滚动选择“工具”（Tools），然后选择“ROI管理器”（ROI manager），点击“添加”（add），将该ROI加入ROI管理器。</li>
		<li>对所有时间点重复上述操作。</li>
		<li>在ROI管理器中点击“测量”（Measure）按钮，获取每个ROI的面积大小。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校正延时记录过程中腹神经索（VNC）的移动。“Stackreg”和“Turboreg”插件16（来自ImageJ网站<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>）：这些插件可用于校正延时成像过程中样品的微小移动。构建一个包含所有时间点的等效代表性光学切片的图像栈，并应用这些插件。这有助于可视化损伤随时间的变化情况。有关这些方法的详细信息和操作手册可从开发这些插件的研究团队获取（<a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/" target="_blank">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</a>）。</li>
	<li>胶质细胞的自动计数。“DeadEasy glia”插件（<a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html</a>）：该插件用于计数果蝇（Drosophila）幼虫腹神经索中REPO阳性胶质细胞的数量，并分析刺伤损伤引起的胶质细胞数量变化17。该插件具有较高的准确性，假阳性率为0.1%，假阴性率为4.3%17。使用该插件时，首先需利用抗REPO抗体通过免疫荧光标记样本中所有胶质细胞（中线细胞除外）。然后在ImageJ中安装该插件，打开共聚焦图像栈并运行插件，约30秒内即可自动完成胶质细胞计数。</li>
	<li>凋亡细胞的自动计数。“DeadEasy Caspase larvae”插件（<a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html</a>）18：该插件用于计数被抗裂解型Caspase3抗体标记的细胞数量，其新版本已适用于幼虫腹神经索。刺伤损伤可导致程序性细胞死亡增加11。使用该插件时，首先需利用抗裂解型Caspase-3抗体通过免疫荧光标记样本中的凋亡细胞。然后在ImageJ中安装插件，打开共聚焦图像栈并运行插件，约30秒内即可自动完成凋亡细胞计数。</li>
</ol>
8. 试剂
<ol>
	<li>培养基：Shield 和 Sang M3 昆虫培养基，含 7.5% 胎牛血清、1% 青霉素和 1% 链霉素。</li>
	<li>无菌去离子水中含 0.01% 多聚赖氨酸（Poly-L-lysin）。</li>
	<li>固定液：4% 甲醛（超纯级）溶于 PEM 溶液（0.1 M PIPES，2 mM EGTA，1 mM MgSO4）中。</li>
	<li>免疫染色封闭液：含 10% 正常山羊血清的 0.3% Triton X PBS 溶液。</li>
	<li>抗谷氨酰胺合成酶 2 抗体（Anti-Glutamine Synthetase 2 antibodies）：以封闭液按 1:250 稀释。</li>
	<li>抗绿色荧光蛋白抗体（Anti-GFP antibodies）：以封闭液按 1:1,000 稀释。</li>
	<li>抗 REPO 抗体（Anti-REPO antibodies）：以封闭液按 1:250 稀释。</li>
	<li>抗 ELAV 抗体（Anti-ELAV antibodies）：以封闭液按 1:250 稀释。</li>
	<li>抗裂解型 Caspase 3 抗体（Anti-cleaved Caspase 3 antibodies）：以封闭液按 1:1,000 稀释。</li>
	<li>二抗（Secondary antibodies）：以封闭液按 1:250 稀释。</li>
</ol>

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</ol>

未声明利益冲突。

我们建立了一种对果蝇（Drosophila）幼虫中枢神经系统进行刺伤损伤的实验方案，用于研究细胞对损伤、修复和再生的响应。通过解剖获取幼虫腹神经索（VNC），对其进行刺伤处理，随后利用延时显微成像或固定样本进行荧光免疫染色，以观察胶质细胞和神经元、细胞凋亡或细胞分裂情况。可对损伤随时间的发展进程进行测量。该方法配套开发了专用软件，用于对损伤后及修复过程中细胞数量变化进行定量与统计分析。
我们对96小时龄的AEL幼虫（这些幼虫或被固定，或允许继续发育）进行了刺伤操作，该发育阶段处于向蛹期及成虫期转变之前。在96小时时，腹神经索（VNC）已足够大，便于进行刺伤；此时幼虫处于三龄中期，尚未开始化蛹；且其神经系统已具备与成虫相似的完整功能。在幼虫期稍晚些时候进行刺伤也是可能的，具体时间应根据研究问题来选择。然而，根据所研究的具体问题，通常需要将VNC培养一段时间，以观察细胞对损伤的反应。在AEL约120小时之后，幼虫开始化蛹，此时中枢神经系统（CNS）发生重塑，因此应尽量避免在此阶段操作。因此，在幼虫期进行刺伤并继而培养的时间窗口相对有限。相比使用成虫，使用幼虫具有显著的技术优势：尽管与成虫类似，其神经系统已完全功能化，但对损伤反应的分析在幼虫中明显更简便、更快速。
将解剖后在培养皿中培养的脑和腹神经索（VNC）与在相同较晚时间点解剖但未在培养皿中培养的 VNC 进行比较时，发现体外培养中的发育速度比体内（in vivo）慢。但在其他方面，体外培养中的发育仍正常进行，组织完整性得以保持，细胞存活并表现出多种反应。损伤后 22 小时内可观察到伤口扩张、神经纤维网修复和胶质细胞增殖。这表明在体外培养中细胞对损伤具有响应能力，因此很可能无需将外植体维持培养超过一天。若需更长期的培养，该方案可能需要进一步优化，例如使用培养板插入装置5。
区分高质量样本与退化样本非常重要。优化本方案需要一定技巧，不可避免地某些样本会出现退化现象。腹神经索（VNC）可能出现“花椰菜”状外观，反映出组织完整性的破坏（图5B）。此外，无论是否进行穿刺操作，若腹神经索出现空泡化，也是退化的表现，这种现象也可能出现在完整、未穿刺的样本中（图5C）。此类样本必须弃用。退化最可能由粗暴的解剖操作引起，这会撕裂神经及表面胶质细胞的保护层。因此，必须格外小心，轻柔操作。其他影响因素包括培养基，必须保持清洁并添加抗生素，并严格遵守方案中规定的清洗步骤和时间。最后，针的长度和持针器的长度、针的尺寸与锋利程度也非常关键。持针器可能污染培养基，而钝针会造成较大损伤，无法自我修复，最终导致退化。因此，定期保持针的锋利至关重要。
在本实验方案中，我们利用果蝇的蛋白质捕获品系，同时结合传统的GAL4-UAS系统对胶质细胞突起进行可视化，以平行观察神经纤维网。这些工具还可与其他独立于GAL4的二元表达系统（如LexA19和Q系统20）联用，从而实现例如在损伤响应过程中轴突与胶质细胞突起之间相互作用的分析。通过进一步结合其他遗传学工具，如树突标记报告基因21或钙离子内流报告系统22，该方法为研究中枢神经系统中胶质细胞、神经元轴突和树突在损伤响应背后的细胞生物学机制提供了重要机会。最后，该方法还可与标准遗传学手段、基因突变或基因过表达相结合，用于检验特定基因在损伤响应与再生过程中的功能。
该方案已成功揭示了中枢神经系统损伤后胶质细胞再生反应背后的基因网络11。鉴于基因功能在进化上的保守性，解析果蝇中这些细胞事件及基因功能，有望为理解哺乳动物中枢神经系统对损伤的响应及再生机制提供重要见解。

动物的再生能力揭示了细胞如何感知机体何时启动并完成生长，以及机体结构完整性是如何实现并维持的。理解细胞这些神秘能力在生物学中具有重要意义。促进再生是医学神经科学的主要目标之一。在人类中，受损的中枢神经系统（CNS）无法再生。研究人员利用啮齿类动物的脊髓损伤模型来探究细胞对损伤的反应。然而，伦理问题、高昂的成本以及动物较长的生命周期限制了研究进展。
果蝇 Drosophila 是发育生物学和神经科学中广泛使用的模式生物。得益于其强大的遗传学工具和较短的生命周期，Drosophila 不断推动着与人类及疾病研究相关的基因功能和基因网络的发现。大量证据表明，基因功能在从果蝇到人类的进化过程中具有高度保守性。
近年来，在Drosophila中已建立了多种神经系统损伤的研究范式。其中一些方法包括损伤沿翅走行的外周神经，或对外周神经进行轴突切断，涵盖感觉1和运动轴突2。然而，外周神经系统与中枢神经系统在许多方面存在差异，众所周知，在多种动物中，外周神经系统能够再生，而中枢神经系统则不能。因此，要研究中枢神经系统的再生机制，直接对中枢神经系统施加损伤更为合适。已有研究成功采用针刺法对Drosophila成年脑实施损伤，以探究其损伤反应3,4。另一种方法中，Ayaz et al. 利用压电驱动的显微切割装置切断离体培养的成年脑中的中枢神经轴突，并对其再生过程进行了为期4天的分析5。这些较新实验设计的优势在于聚焦于脑组织，这无疑具有重要研究价值。但其劣势在于脑结构比腹神经索（VNC）复杂得多，而后者仅涉及运动与感觉调控。成年脑的研究操作也更加耗时：幼虫在4天后即可用于实验，而成虫羽化需约10天，再加5天成熟期。此外，成年脑更难处理，因其被包裹在厚实的角质层中，难以清除。相比之下，腹神经索还具有一个额外优势，即其功能上相当于脊椎动物的脊髓。
Drosophila 幼虫被广泛用作神经科学领域的模式生物6-9。尽管严格来说幼虫处于发育阶段，但它也可被视为一个功能完整的动物。该幼虫具有运动能力，具备多种感觉功能，包括嗅觉、味觉和伤害感受，以及学习与记忆能力。因此，幼虫的腹神经索（VNC）被选为研究中枢神经系统损伤的理想模型。
幼虫和蛹的腹神经索（VNC）可在培养皿中解剖并进行体外培养，细胞完整性可维持长达24小时10。这表明可在腹神经索上施加损伤，随后在此期间对其进行延时成像记录，或在该时间段内任意选定的时间点进行培养后固定。
在此，我们介绍一种利用中枢神经系统损伤的实验范式 果蝇 幼虫腹神经索。首先从幼虫中解剖出腹神经索，并使用钨针手动施加刺伤损伤。随后将腹神经索置于玻璃底盖玻片上，利用延时激光扫描共聚焦显微镜进行成像。 alternatively，腹神经索可培养特定时间，之后通过免疫染色和共聚焦显微镜分析固定样本中的细胞损伤效应。可测量伤口区域，并利用专门开发的软件对细胞数量（细胞增殖与细胞死亡）进行定量分析。该方法易于处理大量样本，从而获得具有统计学意义的结果。这些方法已成功结合了强大的遗传学工具 果蝇 发现中枢神经系统损伤后胶质细胞再生反应背后的基因网络 11.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>染色缸</td><td>Brunel 显微镜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5号镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 11251-20</td><td></td></tr><tr><td>钨针：杆直径 0.5 mm；尖端尺寸 1 &amp;mu;m；长度 2 英寸</td><td>Roboz 外科器械公司</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Roboz 外科器械公司</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>Arkansans 磨石：Dumont 镊子维修套件</td><td>精细科学工具公司</td><td>29000-00</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿（玻璃底直径 27 mm）</td><td>Iwaki</td><td>3930-035</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2-AOBS 共聚焦倒置显微镜（带环境培养室）</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Shield 和 Sang M3 昆虫培养基（无蜕皮激素）</td><td>Sigma</td><td>S3652-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>参见 &lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P1399-25mg</td><td></td></tr><tr><td>甲醛，10%，无甲醇，超纯</td><td>Polysciences</td><td>04018-1</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗谷氨酰胺合成酶抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>兔抗GFP抗体</td><td>Life technologies</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗REPO抗体</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>8D12</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗ELAV抗体</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>7E8A10</td><td></td></tr><tr><td>兔抗活化型caspase 3抗体</td><td>Abcam</td><td>ab13847</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>抗兔Alexa Fluor 488</td><td>Life technologies</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠Alexa Fluor 647</td><td>Life technologies</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠Alexa Fluor 647</td><td>Life technologies</td><td>A21247</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究中枢神经系统修复的损伤范式 果蝇

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

已开发出一种实验方法，利用果蝇Drosophila研究中枢神经系统（CNS）损伤后的细胞反应。理解动物在损伤后的修复与再生机制是生物学中的一个关键问题。人类受损的中枢神经系统无法再生，而如何促进其再生正是医学神经科学的主要目标之一。利用Drosophila强大的遗传工具包，可有效应对中枢神经系统再生这一难题。
使用钨针手动对中枢神经系统腹神经索（VNC，相当于脊椎动物的脊髓）造成损伤。随后可利用激光扫描共聚焦显微镜对VNC进行长达24小时的延时成像，以观察损伤随时间的发展过程。或者，也可将组织进行培养，随后固定并使用免疫荧光染色，通过共聚焦显微镜观察神经元和胶质细胞。借助合适的标记物，可观察到损伤引起的细胞形态和细胞状态的变化。利用ImageJ及专门开发的插件，可进行定量和统计分析，以测量伤口大小随时间的变化以及损伤对细胞增殖和细胞死亡的影响。这些方法支持大样本量的分析，并可结合Drosophila强大的遗传学工具，研究中枢神经系统再生与修复的分子机制。

本文展示了如何对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫腹神经索（VNC）进行刺伤损伤，并利用延时成像和免疫荧光共聚焦显微镜分析细胞对损伤的反应。
对于延时成像数据，损伤区域表现为在具有G9轴突标记的标本神经 Neuropile 中的GFP阴性区域（图2）。刺伤后不久，开始出现微小的GFP阴性区域，形态类似孔洞或空泡（图2A）。这些GFP阴性区域通常在刺伤后约6至8小时逐渐扩大（图2A）。随后，GFP阴性区域缩小，甚至可能完全消失（图2B）。至刺伤后22小时，伤口所占区域通常小于刺伤后6至8小时达到的最大面积（图2A、B）。同样，胶质细胞突起中的DsRed阴性区域最初也会增大，但在刺伤后22小时时缩小。有趣的是，通常在GFP阴性孔洞消失之前，DsRed阳性的胶质细胞突起会填充这些神经 Neuropile 中的GFP阴性区域（图2C）。
使用固定样本的免疫染色技术，可比延时成像更清晰地观察胶质细胞的细微突起及其对损伤的反应。例如，可利用 repoGAL4 胶质细胞驱动子诱导膜锚定报告基因的表达（例如 UAS-mCD8GFP）在果蝇中用于标记所有胶质细胞（中线胶质细胞除外）。该标记还可与其他胶质细胞标记物联用，例如抗GS2抗体，用于标记与神经 Neuropile 相关的胶质细胞（图3A、B）。在此我们显示，尽管腹神经索是从背侧被刺入，但刺伤损伤却在腹侧形成一个凹陷（图 3A，箭头所示）。刺伤似乎对神经网及与神经网相关的胶质细胞造成的损害更为严重，而对表面和皮层胶质细胞的影响较轻。图3B）。神经纤维网中的胶质细胞突起呈现紊乱状态，而在皮层中仍保持其网状组织结构。损伤导致出现GS2阳性细胞碎片，这些碎片与正常细胞明显不同，因其体积显著更小且不与细胞体相连。这表明与神经纤维网相关的胶质细胞受到了损伤图3B）。通过透射电子显微镜也观察到与神经毡相关的胶质细胞发生退变 15. 在神经毡相关胶质细胞中观察到抗活化型Caspase 3阳性凋亡染色 15，表明它们在刺伤损伤后会发生凋亡。与神经纤维网相关的胶质细胞也被证实能够吞噬神经元碎片 15，GS2+信号也可能揭示胶质细胞突起对凋亡神经元的吞噬作用。在大脑皮层中也可观察到Cleaved-Caspase+的凋亡细胞，其中至少部分为Elav+神经元。图3C).
利用固定样品和免疫染色还可对细胞对损伤的反应进行定量分析，例如增殖和凋亡的影响。为此，我们专门开发了两个 ImageJ 插件：DeadEasy Caspase Larva 和 DeadEasy Glia，分别用于自动计数胶质细胞和凋亡细胞。这些插件已验证可在幼虫腹神经索（VNC）上有效运行，且准确性很高。使用这些工具可以观察到，刺伤损伤在22小时时引起 REPO 阳性胶质细胞数量增加（图4A）15。此外，在刺伤后6小时，抗裂解型 Caspase-3 阳性凋亡细胞的数量也有所增加（图4B）15。这种在果蝇中枢神经系统（Drosophila CNS）中因损伤引起的胶质细胞增殖与凋亡增加，类似于脊椎动物中枢神经系统的损伤反应。
本方案的一个关键环节在于腹神经索（VNC）解剖的质量。在解剖过程中，很难立即判断VNC是否受到损伤，因此必须特别注意进行轻柔的解剖操作。然而，不可避免地会产生一些质量较差的样本，必须在后续步骤中识别并剔除。据我们观察，VNC的退化现象与刺伤损伤无关，而是由粗暴的解剖操作所导致。我们并未发现损伤伤口存在特定的关键尺寸阈值，因此只要样本未发生降解，我们均会纳入分析。当VNC保持完整时，其表面通常呈现光滑且有光泽的外观，神经纤维网区域无孔洞出现（图5A）。解剖后24小时，若VNC腹侧和侧区表面变得粗糙，即可识别为VNC退化（图5B）。此外，也可能出现与刺伤无关的神经纤维网退化，表现为免疫染色样本背景信号中出现神经纤维网孔洞。具有此类退化迹象的样本必须予以弃用（图5C）。据我们经验，完整个体及刺伤对照（yw）果蝇中，解剖与损伤操作的成功率均约为70%。该成功率会因操作者的熟练程度以及果蝇基因型的不同而有所差异。
<img alt="幼虫分期与损伤示意图；发育与解剖时间线；神经研究用针具。" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. 幼虫分期与刺伤损伤的示意图。 (A) 第0天，将果蝇置于葡萄汁培养皿中产卵3小时。第1天，收集孵化出的一龄幼虫（L1），转移至含标准酵母食物的试管中，并继续培养3天。第4天，从食物试管中收集幼虫，用于刺伤实验。 (B) 幼虫中枢神经系统的侧面观。腹侧神经索的腹部区域从背侧用针刺入。头端朝左，尾端朝右。
<img alt="VNC损伤的延时进展，G9-GFP轴突成像，repoGAL4&gt;UASDsRed胶质细胞，时间分析。" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
 图2. VNC损伤的延时进展。 对活体腹神经索（VNC）进行共聚焦显微镜观察，其中轴突标记为GFP，胶质细胞标记为DsRed。基因型：UASDsRed/+;G9/+;repoGAL4/+. (A) 损伤区域通过轴突神经纤维网荧光缺失来识别。刺伤后出现GFP阴性空洞，并随时间推移逐渐增大且数量增多。每时间点刺伤后的5个光学切片的投影图像。(B) 轴突神经纤维网损伤区域自刺伤后9小时开始缩小。这些图像为刺伤后不同时间点的单个光学切片。为确定各样本中位置的一致性，选取了延时成像数据堆栈中每个时间点相同编号的切片。通过比较刺伤未影响区域中G9与repoGAL4&gt;UASmCD8GFP所显示的形态模式，验证各切片在Z轴上处于等效位置。(A,B)中的虚线表示伤口边缘。(C) 神经纤维网伤口的高倍放大图像。GFP阴性空洞被DsRed阳性胶质细胞突起填充，随后消失（箭头所示）。水平视角， anterior朝上。
<img alt="VNC 损伤表征；显微图像；repoGAL4&gt;mCD8GFP，GS2 标记物；细胞研究。" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
 图 3. VNC 损伤的细胞表征。 VNC 表达膜结合型 GFP 报告基因以标记所有胶质细胞（中线胶质细胞除外），并使用抗-GFP 和抗-GS2 抗体染色，GS2 是一种与神经纤维网相关胶质细胞的标记物。基因型：+/+;UASmCD8GFP/+;repoGAL4/+. (A) 从背侧刺入造成 VNC 损伤，但在腹侧产生凹陷（箭头所示）。图为单个光学切片的矢状面视图，上方为背侧，左侧为前端。(A, B) 刺伤损伤对神经纤维网相关胶质细胞的影响比皮层和表面胶质细胞更为严重。损伤导致出现 GS2 阳性的细胞碎片（图 B 中箭头所示）。(B) 单个光学切片的水平面视图，上方为前端。箭头指向 GS2 阳性细胞碎片。(C) 凋亡标记物抗-cleaved-Caspase-3 与神经元标记物抗-Elav 的共定位显示，损伤后皮层中部分死亡细胞为神经元。np，神经纤维网；cx，皮层。
<img alt="使用 DeadEasy 进行胶质细胞和凋亡细胞的自动计数；荧光图像及结果。" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
 图 4. 使用 DeadEasy 自动计数胶质细胞和凋亡细胞。 (A) 使用“DeadEasy Larval glia”计数 REPO 阳性胶质细胞的示例。左侧：用抗 REPO 抗体染色的腹神经索（VNC）腹侧半部分；中间：DeadEasy Larval glia 插件输出结果，显示被识别的细胞；右侧：合并图像。右侧数字表示在约 30 秒内对整套光学共聚焦切片自动计数得到的 REPO 阳性细胞数量。在刺伤后的 VNC 中，胶质细胞数量增加。(B) 使用“DeadEasy Caspase larva”的示例。左侧：5 个光学共聚焦切片的投影图像，经抗裂解型 CASPASE 3 抗体染色；中间：插件输出结果，显示被识别的细胞；右侧：合并图像。右侧数字表示在约 30 秒内对整套光学共聚焦切片自动计数得到的 CASPASE 阳性细胞数量。在刺伤后的 VNC 中，凋亡细胞数量增加。
<img alt="退化的腹神经索，显微图像显示神经结构，突出果蝇中的退行性变化。" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 退化的示例。 (A) 健康的腹神经索，无退化迹象。(B) 被刺伤样本的胸部侧面出现退化（箭头所示），星号表示损伤部位。(C) 未被刺伤的腹神经索中，胸段神经毡（白色箭头）和皮层（橙色箭头）出现空洞。凡神经毡受损且存在广泛空泡化的样本必须弃用。本实验中，腹神经索使用神经毡相关胶质标记物抗-Ebony 进行染色。水平视角，前端朝上。

本文描述了一种利用果蝇幼虫腹神经索的损伤模型，用于研究中枢神经系统（CNS）的再生与修复。通过穿刺损伤，结合活体及固定样本的时间序列激光共聚焦显微镜成像，并利用专门开发的软件与遗传学工具进行定量分析，以探究中枢神经系统再生与修复的分子机制。

已开发出一种实验方法，利用果蝇 Drosophila 研究中枢神经系统（CNS）损伤后的细胞反应。

本实验的目的是对黑腹果蝇幼虫中枢神经系统（CNS）的腹神经索造成刺伤损伤，并诱导细胞对此损伤产生反应。该过程首先将果蝇幼虫培养至产卵后96小时以内，随后解剖分离出幼虫的中枢神经系统，并使用精细的舌骨针刺伤腹神经索。最后的步骤是培养被刺穿的腹神经索，然后将其固定用于免疫染色，或仅进行培养以进行延时成像记录。最终，通过共聚焦显微镜观察样本，可以展示伤口进展的动力学过程以及胶质细胞增殖、凋亡和形态的变化。与成年果蝇损伤等16种方法相比，该技术的主要优势在于：尽管仍代表一个功能性的中枢神经系统模型，但幼虫中枢神经系统在技术上更易于操作。通常，初次接触该方法的人可能会遇到困难，因为如果解剖步骤操作不当，坐骨神经可能会退化。首先确保无菌条件：用70%乙醇清洁实验台和双手，将器械用浸有70%乙醇的纸巾包裹后备用。准备处理幼虫时，打开组织包裹，让器械自然风干。对于这些实验方案，镊子尖端必须完全贴合至关重要。如果镊子尖端不贴合，可使用阿肯色石进行调整，其效果是等同的。将一个染色缸装入蒸馏水，另三个染色缸各加入两毫升 M3PS 培养基。选取一个含有 96 小时龄幼虫的试剂瓶，向其中加入一些水。然后使用刮勺轻轻将带有幼虫的食物从试剂瓶中取出，并将其铺展在湿润的纸巾上。用清水将10只幼虫从培养基转移到染色板中。更换清水六次，以彻底清洗幼虫。然后将清水替换为M three PS培养基。将其中一条幼虫转移至含有 M three PS 培养基的染色板中，并置于解剖显微镜下。尽量减少组织损伤，取出腹神经索。首先将幼虫背侧朝上放置。然后在距前端约三分之一处，用两对镊子夹住背部。接着用镊子拉扯后端，撕开表皮。接下来，在肠道最靠近脑部的位置进行剪切，因为该处应含有较少的食物。现在可以从前半部分的后缘看到脑和腹神经索。小心地去除脂肪体、肠道和表皮。用两对镊子靠近夹住胸部腹神经索处的外周神经，然后将其拉开。切勿从胸部腹神经索（VNC）上拉扯或撕下盘状结构或外周神经，否则会导致口器退化。部分结构可保留在腹神经索上，若存在成虫盘，应将其保留在脑部。现在使用更湿润且口径扩大的 P20 加样枪头。在M three PS培养基中进行操作，并用其将VNC转移至含有新鲜M three PS培养基的染色板中，然后对VNC进行损伤处理。确保充分收集，进行延时成像需要4到5个样本，而免疫染色则需要超过24个样本。在解剖显微镜下，将一个腹神经索（VNC）转移至含有三份磷酸盐缓冲液（PS）的洁净染色板中，使背侧神经节呈现在视野中。这是带有视叶的腹神经索最自然的方位。此时仅需使用细针，从背侧以近乎直角的方向手动穿刺腹神经索，目标为腹神经索的腹部半段。穿刺针将轻轻接触组织下方的玻璃表面。因此，务必定期检查针尖是否仍足够锋利以进行下一次操作。如果针尖变钝，请将其磨利。使用 Arkansas 磨石或同等的刺入装置，配备带有 Tango 染色针的神经保护装置是本实验中最关键的步骤，因为这是损伤模型的核心环节。如果针头过于钝化，造成的伤口将过大，且神经保护装置可能退化。在刺入过程中，应防止针持的柄部接触培养基；操作完成后，即使经过荧光免疫染色，伤口也不应可见。在培养22小时后，固定的健康腹神经索中未观察到退化迹象。此操作可能导致腹神经索在刺伤后22小时出现与刺伤无关的细胞退化。请观察表面是否粗糙，尤其是胸段腹侧区域，如箭头所示部位。在极端情况下，腹神经索会凸出。同时注意观察胸段神经团块中的孔洞或空泡，这些结构在荧光免疫染色后可能表现为可见的孔洞。注意箭头所示位置的孔洞。神经柱中出现上述任何退化迹象的样本必须弃用。为了在活体腹神经索（VNC）中观察轴突的神经柱，可使用一种名为G nine的GFP蛋白陷阱标记物，该标记物可标记所有轴突。为了观察除中线胶质细胞以外的所有胶质细胞，可使用胶质细胞驱动子repo G four，例如与U-A-S-D-S red S 1 97 Y报告基因果蝇结合使用；同时携带这两种报告基因的果蝇将具有绿色的轴突和红色的胶质细胞（GL），可在活体组织中通过延时成像进行记录。在刺穿携带必要报告基因的动物腹神经索（VNC）后，将刺穿后的腹神经索转移至预先用多聚赖氨酸包被的3.5毫米玻璃底培养皿中，加入1毫升M3PS培养基。将腹神经索背侧朝下放置，随后用镊子的平坦面轻轻按压腹神经索，使其贴附于培养皿底部。接着，在25°C控温的成像腔室中，小心加入1毫升含15%胎牛血清（FBS）的M3PS培养基。使用共聚焦显微镜在有限的LIR SP2系统上采集腹神经索的图像。使用20倍物镜并设置4倍缩放。将扫描模式设为XYZT。将像素分辨率设为512方像素。将Z步长设置为1微米，并以每1至2小时的时间间隔采集图像。这些设置可在其他共聚焦显微镜上实现8到9个时间点的扫描。调整参数以获取更长时间的图像序列。时间长达24小时。通过延时成像观察到，在携带G九轴突标记物的标本中，VNC损伤表现为神经柱内GFP阴性区域；在刺伤后不久，开始出现一些较小的GFP阴性区域，形似孔洞或空泡。这些GFP阴性区域通常在刺伤后6至8小时内逐渐扩大。随后，GFP 阴性区域进一步缩小，部分区域甚至在刺伤后 22 小时消失。伤口所占据的面积通常小于刺伤后 6 至 8 小时观察到的最大面积。类似地，胶质细胞突起中的 DS 红色阴性区域最初有所增加。然而，在刺伤后22小时，这些结构缩小了。有趣的是，在神经柱中的GFP阴性空洞消失之前，经常有DS红色阳性的胶质细胞突起填充这些空洞。对携带repo GAL4和UAS-MCD8-GFP以通过抗GFP标记胶质细胞膜的固定样本进行免疫染色显示，背侧刺伤损伤导致了凹陷。腹侧刺伤似乎对神经球及其相关的胶质细胞造成的损害比表层和皮层中的胶质细胞更为严重。在神经球中，胶质细胞的突起显得杂乱无章，而在皮层中，它们仍包裹着腹神经索（VNC），并维持其网状结构。损伤导致出现GS2阳性的细胞碎片，如箭头所示。碎片与正常细胞明显不同，其体积显著更小，且不与细胞体相连。这表明神经柱相关胶质细胞受到损伤，表现为抗裂解型caspase阳性。三种阳性凋亡。在神经元和胶质细胞中均观察到染色，表明它们在刺伤损伤后发生了凋亡。一旦掌握，该技术可在一到两小时内完成。解剖腹神经索、对其进行刺穿并完成活细胞共聚焦显微镜延时成像的准备工作需要一小时；两小时内可完成24个腹神经索的解剖、刺穿及培养准备工作，之后可在预定时间点对样品进行固定。

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科研

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本文提供了在黑腹果蝇（Drosophila...

在Drosophila melanogaster轴突死亡过程中对轴突及其突触的形态学与功能评估

本文提供了对成年果蝇（Drosophila）造成穿透性创伤性脑损伤（PTBI）并检测由此引发的神经发生的详细实验方案。...

刺激与分析成年神经发生 果蝇 中枢脑

了解果蝇幼虫腹神经索刺伤损伤模型，用于研究中枢神经系统再生修复机制。该方法结合解剖、共聚焦显微镜成像和延时记录技术，可分析胶质细胞增殖、凋亡及形态变化动态。

一种用于研究中枢神经系统修复的损伤范式果蝇

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一种用于研究中枢神经系统修复的损伤范式 果蝇

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