激光捕获显微切割富集的神经元群体或单个神经元用于创伤性脑损伤后基因表达分析

本实验的总体目标是演示如何通过激光显微切割技术从冷冻组织切片中获取富集的海马神经元群体及单个神经元，用于后续基因表达分析。首先，在麻醉舱内对大鼠进行麻醉，随后进行气管插管并实施机械通气，将大鼠固定于立体定位头架上，以准备进行液体冲击性脑损伤模型的建立，接着实施开颅手术。

第二步是实施流体冲击脑损伤。随后在冷冻切片机上对脑组织进行冠状切片，并使用氟代乳酸（fluro aid，一种变性神经元的标记物）或真实紫（real violet，一种用于标记损伤的染料）进行染色。最后一步是进行激光显微切割，以收集单个神经元或成组的神经元。

最终，从捕获的细胞中提取总RNA，使用安捷伦生物分析仪进行质量分析和定量，并用于后续应用，如定量实时PCR以及通路特异性或全基因组范围的微阵列分析。与现有的手工显微解剖等方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够从组织切片中获得富集的神经元群体或其他脑细胞类型（如胶质细胞或免疫调节细胞），甚至是单个神经元。这使得我们能够在大脑中特定的已鉴定细胞类型以及其他由多种细胞组成的异质性组织中进行基因表达分析。演示该实验流程将由Missed完成。

Debbie Boone，本实验室的高级研究助理。首先从负80摄氏度冰箱中取出经液体打击、创伤性脑损伤或假手术损伤的大鼠脑组织，并转移至负22摄氏度。在脑组织解冻的同时，将其放入冷冻切片机中10分钟，以达到切片所需的温度。

用含有乙醇的 RNA zap 擦拭冷冻切片机，并用乙醇清洁刷子。10 分钟结束后，将脑组织从管中取出，腹面朝上放置在冷冻切片机载物台的纱布上，使用新的剃刀刀片切去脑组织的后部，切面位置分别位于小脑前方和视交叉处的前部脑区。

用OCT包埋介质填充冷冻模具，并将脑组织腹侧朝下放入模具中。让脑组织在包埋介质中冷冻至变白。此过程大约需要10分钟。

现在用 OCT 将样本盘冷冻固定到脑组织上，然后取下模具。将带有脑组织的样本盘插入样本头，并拧紧螺丝。

将一次性低剖面刀片插入刀架中，并拧紧杠杆。从20微米开始切片脑组织，以去除OCT包埋剂的外层。当切至海马区时，将微米调节旋钮设为10。

通过将载玻片或正电荷载玻片贴附于脑组织切片上，收集冠状面连续切片。将载玻片置于无RNA酶的染色架中，并于-20 °C保存，直至切片完成。

在进行切片染色之前，使用ese擦拭所有染色容器和量筒，并用超纯水冲洗。确保所有溶液均使用无RNA酶的水配制，并且在使用前，甲苯胺蓝和Fluoro Jade染色剂已通过0.2微米滤膜过滤。将脑组织切片在室温下用75%乙醇固定30秒，随后再固定1分钟。

然后进行适当的复染，以用于固定后神经元群或单个神经元的激光显微切割（LCM）。将切片在无RNA酶的水中冲洗1分钟，用1%结晶紫染色1分钟。再用无RNA酶的水冲洗三次，每次1分钟。接着用95%乙醇脱水两次，每次30秒；随后用100%乙醇脱水两次，每次30秒；最后用二甲苯处理两次，每次3分钟。

染色后，在通风橱中将所有切片风干15分钟，然后进行激光显微切割（LCM）。在此处进行激光显微切割，使用配备红外二极管激光器的P细胞两E显微镜，首先将中心操纵杆调整至垂直位置。

然后旋转并将物镜锁定到位。将一张带有染色海马体切片的载玻片置于显微镜载物台中央，并手动调整，直至视野中出现海马体区域。使用粗调和细调焦旋钮进行对焦。

为使样本进入焦点，按下控制器上的真空按钮以启动真空卡盘。然后旋转并将10倍物镜锁定到位。再次使用粗调和微调进行对焦。

将您的宏激光捕获显微切割（LCM）帽装入帽架、盒式模块中，并将一顶帽置于加载线位置。旋转帽放置臂并将其环绕在帽的周围，然后抬起帽放置臂，将帽从盒式模块中取出。

将帽盖定位臂旋转至载玻片上方，然后向下降低，将帽盖放置在载玻片上。调节细调焦旋钮，并移动操纵杆，检查细胞是否位于帽盖上的黑色圆圈内。所有需要捕获的细胞都应位于此黑色圆圈内。

现在设置激光参数。首先按下控制器上的激光启用按钮。激光目标光斑将显示为粉红色。

在计算机显示器的视野范围内。将激光光斑尺寸设为小，以聚焦激光，并根据需要将激光功率和持续时间调整至65至75毫瓦，持续一到两毫秒，以实现最佳细胞捕获效果。测试激光时，使用操纵杆将激光光斑移至无细胞区域，以确认激光功能正常。

使用拇指开关发射激光。然后通过操纵杆将激光点移离熔化的聚合物区域，检查是否存在一个围绕激光照射区域的可见暗环，其中心为透明区域。如需捕获细胞，使用操纵杆将激光点移动至目标细胞区域，然后发射激光。

使用拇指开关，在发射激光的同时移动操纵杆，以捕获大范围的细胞。在所有目标细胞发射完毕后，抬起帽置放臂。捕获的细胞将从组织切片上分离并黏附到帽上。

在视野中，您的盖片、残留组织和缺失的细胞将清晰可见。也可将盖片放置在载玻片的空白区域，以观察盖片上的细胞。抬起盖片放置臂，并将其旋转至盖片卸载位。

将瓶盖放入工位，将瓶盖放置臂旋转回原位。沿平台滑动插入工具，将瓶盖推至插入工具上。将带有瓶盖的工具从平台抬起。

用移液器吸头轻轻接触便利贴的粘性部分，以清除不需要的组织。将吸头放入一个含有100 µL来自RN水相微量分离试剂盒的裂解缓冲液的无RNA酶的0.5毫升离心管中。立即涡旋震荡吸头30秒以实现裂解。

将样品在 42 摄氏度孵育 30 分钟，然后在负 80 摄氏度冷冻，直至进行 RNA 提取。固定后单个损伤神经元的 LCM 染色步骤与成片神经元的染色步骤相似。然而，某些孵育时间有所不同，并且切片在漂洗和脱水前需用氟化物处理四分钟，染色后的具体细节请参见方案的文字部分。

再次将所有切片置于通风橱中空气干燥15分钟。在进行激光显微切割（LCM）以捕获单个细胞之前，采用与大范围LCM帽相同的步骤，将捕获HS LCM帽装入帽架或盒式模块中。同样，将激光光斑尺寸设为小，以聚焦激光，但此次需将激光功率和持续时间调整为65至75毫瓦，0.45至0.5毫秒，以实现单个细胞的最佳捕获效果。

将帽放置臂旋转至载玻片上方，并将臂向下降低靠近载玻片。为将帽置于载玻片上，捕获HS帽的表面应高于样本。在激光捕获显微切割（LCM）过程中，使用操纵杆移动激光，使其对准单个荧光辅助剂阳性的细胞。

所有待捕获的细胞必须位于帽盖上的小黑圈内，使用拇指开关触发激光。当黑圈区域内的所有细胞均已被激光照射后，抬起帽盖放置臂，被捕获的细胞将从组织切片上分离并粘附到捕获HS帽盖上。现在将另一张载玻片放置在显微镜载物台上，继续收集荧光标记阳性的细胞，直至HS帽盖装满为止。

然后将帽盖放入含有40至50微升裂解缓冲液的0.5毫升无RNA酶的离心管中，涡旋混匀并置于孵育器中，随后再次于-80摄氏度冷冻。如果未立即按照方案文本部分的说明进行RNA提取，请执行此步骤。以下图像显示了从大鼠脑组织冷冻的10微米冠状切片中，通过激光捕获显微切割技术分离特定细胞群体的区域。

根据本方案制备，并用结晶紫和墨汁染色。该图像显示了大鼠海马体CA1至CA3亚区的锥体神经元。此处捕获了海马齿状回中的颗粒细胞。

最后，我们展示了从位于第三脑室两侧、视交叉上方的双侧视上核获取的神经元区域。视上核（SCN）包含调控全身昼夜节律的主生物钟。以下图像显示了从大鼠海马组织中通过激光显微切割技术分离单个神经元的过程。

图中显示的是正在退化的氟化物阳性海马体CA3神经元，以及在激光显微切割（LCM）前后存活的氟化物阴性CA3神经元；捕获的细胞可在LCM帽上观察到。以下图像展示了从激光捕获的神经元中分离出的总RNA进行的基因表达分析结果。该图像显示了视交叉上核（SCN）中昼夜节律钟基因表达的定量实时PCR数据。

该热图展示了垂死与存活的海马神经元中基因表达的情况，通过聚焦式PCR阵列对凋亡相关基因进行表达谱分析。最后，我们展示了一个热图示例，该图来自对接受假损伤、TBI或TBI联合俯卧腺相关siRNA病毒处理的大鼠CA1至CA3神经元进行的全基因组ENT微阵列基因表达分析；该病毒旨在抑制脑损伤后诱导表达的两种基因——神经元型一氧化氮合酶和谷胱甘肽过氧化物酶1的表达。这些技术为多个研究领域的科学家奠定了基础，包括脑损伤和癌症研究领域，这些领域的研究人员利用这些疾病的动物模型，对特定细胞群体进行基因组、蛋白质组和代谢组学分析。

例如，我们目前正在利用这些技术从已知参与成瘾过程的前额叶皮层和伏隔核脑区中通过激光捕获特定的细胞群体。