激光捕获显微切割富集的神经元群体或单个神经元用于创伤性脑损伤后基因表达分析

本实验的总体目标是演示如何通过激光显微切割技术从冷冻组织切片中获取富集的海马神经元群体及单个神经元，用于后续的基因表达分析。首先，在麻醉舱内对大鼠进行麻醉，随后进行气管插管，实施机械通气，并将大鼠固定于立体定位仪头部固定装置中，以准备进行液体打击式脑损伤模型的制备，接着实施开颅手术。

第二步是实施流体冲击脑损伤。接着在恒冷切片机上对脑组织进行冠状切片，并使用氟代乳酸（fluro aid）染色，后者是变性神经元的标记物，或使用真实紫（real violet）进行弹道染色。最后一步是进行激光显微切割，以收集单个神经元或成组的神经元。

最终，从捕获的细胞中提取总RNA，使用安捷伦生物分析仪检测其质量和浓度，并将其用于下游应用，如定量实时PCR以及通路特异性或全基因组范围的微阵列分析。与现有的手工显微切割等方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够从组织切片中获得富集的神经元群体或其他脑细胞类型（如胶质细胞或免疫调节细胞），甚至是单个神经元。这使得我们能够在大脑中特定的已鉴定细胞类型以及其他由多种细胞组成的异质性组织中进行基因表达分析。演示该实验流程将不可或缺。

Debbie Boone，我们实验室的高级研究助理。首先从零下80摄氏度的冰箱中取出由液体冲击所致创伤性脑损伤或假手术损伤的大鼠脑组织，并转移至零下22摄氏度环境中。在脑组织解冻的同时，将其放入冷冻切片机中放置10分钟，以使脑组织达到切片所需温度。

用含有乙醇的RNA zap擦拭冷冻切片机，并用乙醇清洁刷子。10分钟结束后，将脑组织从离心管中取出，腹面朝上放置在冷冻切片机载物台的纱布上，使用新的剃刀刀片切去脑组织的后部，切口位置分别位于小脑前方和视交叉处的脑组织前部。

用OCT包埋介质填充冷冻模具，并将脑组织腹面朝下放入模具中。让脑组织在包埋介质中冷冻至变白。此过程大约需要10分钟。

现在用OCT将标本盘冻结在脑组织上，然后移除模具。将带有脑组织的标本盘插入标本头中，并拧紧螺丝。

将一次性低剖面刀片插入刀架中，并压紧杠杆。从20微米开始切片脑组织，以去除OCT的外层。当切至海马区时，将微米调节旋钮设为10。

通过将载玻片或正电荷载玻片贴附于组织切片上，收集冠状面连续切片。切片完成后，将载玻片置于无RNA酶的染色架中，并于-20 °C保存直至后续处理。

在进行切片染色之前，使用 ese 擦拭所有染色容器和量筒，并用 Milli-Q 水冲洗。确保所有溶液均使用无 RNA 酶的水配制，并且结晶紫和荧光素 jade 染液在使用前已通过 0.2 微米滤膜过滤。将脑组织切片在室温下用 Thor 处理 30 秒，随后在 75% 乙醇中固定 1 分钟。

然后进行适当的复染，以用于固定后神经元群或单个神经元的激光显微切割（LCM）。将切片在无RNA酶的水中冲洗1分钟，用1%结晶紫染色1分钟。再用无RNA酶的水冲洗三次，每次1分钟。随后用95%乙醇脱水两次，每次30秒；接着用100%乙醇脱水两次，每次30秒；最后用二甲苯处理两次，每次3分钟。

染色后，在通风橱中将所有切片风干15分钟，然后进行激光显微切割（LCM）。此处进行激光显微切割，使用配备红外二极管激光器的P细胞两E显微镜，首先将中心操纵杆调整至垂直位置。

然后旋转并将物镜锁定到位。将一张带有染色海马体切片的载玻片置于显微镜载物台中央，并手动调整，直至视野中出现海马体区域。使用粗调和细调焦旋钮进行对焦。

为使样本进入焦点，按下控制器上的真空按钮以启动真空卡盘。然后旋转并将10倍物镜锁定到位，再使用粗调和微调进行对焦。

将您的宏激光显微切割（LCM）帽装入卡带模块中，并将一顶帽置于加载线位置。旋转帽放置臂并将其环绕在帽的周围，然后抬起帽放置臂，将帽从卡带模块中取出。

将帽盖定位臂旋转至载玻片上方，然后向下降低，将帽盖放置到载玻片上。调节细调焦旋钮，并移动操纵杆，检查细胞是否位于帽盖上的黑色圆圈内。所有需要捕获的细胞都应位于此黑色圆圈内。

现在设置激光参数。首先按下控制器上的激光启用按钮。激光目标光斑将显示为粉红色。

在计算机显示器的视野范围内。将激光光斑尺寸设为小，以聚焦激光，并根据需要将激光功率和持续时间调整至65至75毫瓦，作用时间为1至2毫秒，以实现最佳细胞捕获效果。为测试激光，可使用操纵杆将激光光斑移至无细胞区域，避免误捕细胞。

使用拇指开关发射激光。然后利用操纵杆将激光点移离熔化的聚合物区域，并检查是否存在一个围绕激光照射区域的可见暗环，其中心为透明区域。若要捕获细胞，使用操纵杆将激光点移动至目标细胞区域，然后发射激光。

使用拇指开关，在发射激光的同时移动操纵杆，以捕获大范围的细胞。在所有目标细胞发射完毕后，抬起帽置放臂。捕获的细胞将从组织切片上分离并粘附到帽上。

在视野中，您的帽状结构、残留组织以及缺失的细胞将清晰可见。也可将帽状结构放置在载玻片的空白区域，以观察其表面的细胞。抬起帽状结构放置臂，并将其旋转至帽状结构卸载位。

将盖子放入工位，然后将盖子放置臂旋转回其原始位置。沿着平台滑动插入工具，将工具推至盖子上。提起带有盖子的工具，使其脱离平台。

轻轻将管盖接触便利贴的粘性部分，以清除不需要的组织。将管盖放入含有100微升裂解缓冲液的0.5毫升RNase-free离心管中，裂解缓冲液来自RN Aqueous Micro分离试剂盒。立即涡旋震荡管盖30秒以充分裂解。

将样品在42摄氏度孵育30分钟，然后在负80摄氏度冷冻，直至进行RNA提取。固定后单个损伤神经元的激光显微切割（LCM）染色步骤与成片神经元的染色步骤相似。然而，某些孵育时间有所不同，并且切片在冲洗和脱水前需用氟化物处理四分钟，染色后的具体操作细节请参见方案的文本部分。

再次将所有切片置于通风橱中空气干燥15分钟。在进行激光显微切割（LCM）以捕获单个细胞之前，采用与大范围LCM帽相同的步骤，将捕获HS LCM帽装入帽或盒式模块中。同样，将激光光斑尺寸设为小，以聚焦激光，但此次需将激光功率和持续时间调整为65至75毫瓦，持续0.45至0.5毫秒，以实现单个细胞的最佳捕获效果。

将帽放置臂旋转至载玻片上方，并将臂向下降低靠近载玻片。为将帽置于载玻片上，捕获HS帽的表面应高于样本。在激光捕获显微切割（LCM）过程中，使用操纵杆移动激光，使其对准单个荧光辅助剂阳性的细胞。

捕获的所有细胞必须位于帽盖上的小黑环内，使用拇指开关触发激光。当黑圈区域内的所有细胞均已被激光照射后，抬起帽盖放置臂，被捕获的细胞将从组织切片上分离并粘附到捕获HS帽盖上。现在将另一张载玻片放置在显微镜载物台上，继续收集荧光标记阳性的细胞，直至HS帽盖装满为止。

然后将帽盖放入含有40至50微升裂解缓冲液的0.5毫升无RNA酶的离心管中，涡旋混匀并置于孵育器中，随后再次于-80摄氏度冷冻。如果未立即按照方案文本部分的说明进行RNA提取，则需如此处理。以下图像显示了从大鼠脑组织冷冻的10微米冠状切片中，通过激光捕获显微切割技术分离特定细胞群体的区域。

根据本方案制备，并用结晶紫和墨汁染色。该图像显示了大鼠海马体CA1至CA3亚区的锥体神经元。此处捕获了海马齿状回中的颗粒细胞。

最后，我们展示了从位于第三脑室两侧且在视交叉上方的双侧视上交叉核获取的神经元群。视交叉上核（SCN）包含调控全身昼夜节律的主生物钟。以下图像显示了从大鼠海马组织中通过激光显微切割技术分离单个神经元的过程。

图中显示的是正在退化的氟化物阳性海马体CA3神经元，以及在激光显微切割（LCM）前后存活的氟化物阴性CA3神经元；捕获的细胞可在LCM帽上观察到。以下图像展示了从激光捕获的神经元中分离出的总RNA进行的基因表达分析结果。该图像显示了视交叉上核（SCN）中昼夜节律钟基因表达的定量实时PCR数据。

该热图展示了垂死和存活的海马神经元中基因表达的情况，通过聚焦PCR阵列对凋亡相关基因进行表达谱分析。最后，我们展示了一个热图示例，该图来自对接受假手术损伤、TBI或TBI联合俯卧腺相关siRNA病毒处理的大鼠CA1至CA3神经元进行全基因组ENT微阵列分析所得的基因表达数据。该病毒旨在抑制脑损伤后诱导表达的两种基因——神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase）和谷胱甘肽过氧化物酶1（glutathione peroxidase one）的表达。这些技术为多个研究领域的科学家铺平了道路，包括脑损伤和癌症研究领域，他们利用这些疾病的动物模型对特定细胞群体进行基因组、蛋白质组和代谢组学分析。

例如，我们目前正在利用这些技术从已知参与成瘾过程的前额叶皮层和伏隔核脑区中通过激光捕获特定的细胞群体。