皮肤癌发生过程中的细胞群体分析

本实验的总体目标是在小鼠皮肤癌基底细胞癌模型中进行细胞群体分析。首先在小鼠中诱导目标基因的表达，随后从小鼠皮肤中分离表皮组织。

在制备单细胞悬液后，表皮细胞将用特定的细胞表面标志物进行标记。最终可通过流式细胞术分析监测皮肤肿瘤发生过程中细胞群体的变化。癌症的发生是一个涉及多种细胞类型的过程。

本实验的目的是帮助研究人员探究不同细胞在皮肤癌发生过程中的作用。该方法可揭示皮肤癌发展过程中细胞间的相互作用，也可应用于其他系统，如胰腺癌的研究。该方法的可视化演示至关重要，因为若无直观评估，很难确定实验应在何时终止。

首先，将角蛋白14-CreER小鼠（简称K14小鼠）与携带YFP标记的突变型smoothened基因SMO^M2的Rosa26小鼠（简称SMO小鼠）进行交配。接着，将从三至六周龄双阳性小鼠身上采集的长约0.5厘米的尾部组织样本浸入直接PCR尾裂解液中，加入终浓度为1毫克/毫升的蛋白酶K。然后在55摄氏度下振荡孵育过夜。次日，将组织样本在微型离心机中以最高速度离心，以去除碎片。

然后，对每只动物进行基因型鉴定，取每个样本的1 µL SNAT，分别进行PCR反应，引物和反应条件按供应商推荐的方法进行。使用弯曲的20号喂养针通过口服灌胃法连续五天向动物给予他莫昔芬。对K14-Cre和ROSA26双阳性小鼠连续给药五天，以诱导角质形成细胞中OOM2的表达。

通常，为了获取皮肤进行细胞分析，GFP标记的K14 OO小鼠的耳部和尾部表型更为明显。首先，使用脱毛器去除已处死动物的毛发。然后剥离小鼠皮肤，并将组织浸入Disbe溶液中，在37°C下孵育一至两小时。

经过dispase处理后，使用一对镊子将表皮与真皮分离。接着用一把剪刀将表皮剪碎。然后将组织置于50毫升离心管中，加入胶原酶IV溶液，于37°C孵育1至2小时。

每20分钟轻轻涡旋混匀试管，以解离细胞。当在胶原酶溶液中观察到单个细胞时，使用显微镜确认细胞解离效果。将样本额外孵育30分钟，以提高细胞得率。

然后将组织混合物通过70微米细胞筛过滤，并在500 × g、室温条件下离心洗涤细胞10分钟。开始标记细胞时，先将刚洗涤获得的细胞沉淀重悬于含10% FBS的PBS中，细胞浓度为每毫升2.5 × 10⁶个细胞。随后将细胞悬液置于冰上孵育30分钟，以阻断非特异性结合。接下来，将细胞悬液分装至1.5毫升微量离心管中，用于特异性抗体标记。

将抗体加入各管中，终浓度为每毫升2微克。轻轻涡旋振荡管子数秒，使抗体与细胞充分混匀，然后将管子放回冰上静置30分钟。用1毫升PBS洗涤管中样品后，将沉淀重悬于PBS中，并加入DPI，使其终浓度为每毫升1毫克。

分析数据时，首先根据前向散射与侧向散射图选择单个细胞，并排除DABI阳性的死亡细胞。小鼠不会发生基底细胞癌，除非如本图所示激活了Hedgehog信号通路。他莫昔芬诱导的致癌性Smoothened（smooth M two YFP）表达导致皮肤表型改变，即使在这些动物的皮肤H&E染色标本中，也能在解剖水平上明显观察到。

在 K14 SMU 小鼠中可观察到皮肤肿瘤。在没有 SMU M 两倍 YFP 诱导的情况下，动物皮肤的 H&E 染色未显示异常形态。这些点图展示了对正常小鼠和荷瘤小鼠中髓系细胞的代表性分析。

CD11b阳性GR1阳性细胞来源于髓系细胞，其中部分细胞在正常及非smuM2 YFP诱导的小鼠中为髓系来源的抑制性细胞。CD11b阳性GR1阳性细胞群体在正常情况下几乎不可检测，但在炎症或肿瘤发生时其数量增加。在K14-smuM小鼠中亦可见此现象。

皮肤中smu M two YFP和角质形成细胞的诱导表达导致CD11B阳性、GR1阳性细胞群体增加。该技术将使皮肤生物学领域的研究人员能够在小鼠中对B细胞癌进行分子分析。