在转基因鱼类完整大脑中记录特定神经元的电活动

本实验的总体目标是从完整鱼类脑组织中记录神经元的电活动。首先，使用 MS 222 对一条 4 至 6 个月大的转基因 meca 鱼进行麻醉，随后解剖取出其脑组织。接着，用记录电极接触由 GFP 标记的特定目标神经元，并通过松膜片钳或全细胞膜片钳电生理技术记录该神经元的电活动。

最终，实验结果可显示在完整大脑中，不同处理条件下动作电位放电频率或膜电位的变化。与现有的细胞电生理、培养或脑片制备等方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够在神经回路完整的全脑制备中表征神经元的电生理特性。尽管该方法为生殖神经内分泌学研究提供了重要见解，但也可通过使用斑马鱼等模式生物，应用于其他神经系统的研究，例如神经元调控动机与情感行为的研究。

本演示使用了转基因斑马鱼，其中 GnRH3 神经元通过基因标记与 GFP 相连。首先，将成年斑马鱼浸入 5 毫升 MS-222 溶液中进行麻醉。当鳃部运动停止后几分钟内，将其转移至含有鱼用生理盐水的 60 毫米培养皿中。随后用剪刀在颅骨后端将鱼体断头。

将头部转移至一个直径为35毫米的培养皿中，培养皿内装有一半鱼用生理盐水，并铺有yl护垫。培养皿底部需带有中央凹陷，用于放置头部，使其背侧朝上，并用昆虫针固定。用精细剪刀小心地沿颅骨周围切开其背侧部分。

然后用镊子轻轻去除颅骨，暴露脑的背侧部分，包括脊髓的前部。接着用尖头镊子轻轻提起脊髓，再用精细剪刀切断双侧的连接神经。这包括切断颅神经、脊神经、腹侧视神经以及前嗅神经。

将完全解剖出的脑组织置于盛有新鲜鱼类生理盐水的新培养皿中，在显微镜下仔细检查，确保整个脑组织和垂体完整无损，未被切割或刺破。若发现脑组织有损伤，应弃用并重新使用解剖针开始操作。

在记录室中央滴一滴少量速效胶，如氰基丙烯酸酯。将胶水滴均匀涂抹至约一平方厘米的面积。随后迅速将脑组织转移至胶水上。

将其腹侧朝上固定。现在向记录室中加入约一毫升鱼用生理盐水，以覆盖脑组织。使用尖头镊子，小心地从记录区域的脑表面向前逐步去除脑膜。

以每分钟至少 200 微升的速度，持续用充氧的鱼类生理盐水灌注脑组织。制备 6 至 10 个电阻为兆欧级的玻璃微电极，并用松散的膜片钳记录液将其后向填充至约一半位置。使用配备冷却 CCD 相机的直立荧光显微镜，从 10 倍物镜开始，寻找表达 GFP 的终末神经 gnRH3 神经元。

然后切换至40倍物镜，定位位于嗅球腹侧表面或其前方靠近头端的位置。现在切换至显微镜实时成像的视频监视器。该神经元簇包含8到10个GnRH神经元。

将微电极置入记录室的灌流液中，使电极尖端位于目标神经元上方。施加持续的轻微正压，以防止微电极堵塞。用电极尖端轻柔地接近目标神经元，同时使用Axo graft软件检查并监测电极阻抗。

在电压钳模式下使用封接测试时，当电极尖端接触神经元表面时，此时电极电阻会发生轻微变化。必要时释放正压，并施加轻微负压以形成低电阻封接。获得良好记录最关键的一步是选择一个干净的神经元突起，这有助于在电极与细胞膜之间形成理想的封接。

现在切换到电流钳模式。打开 Chart（PowerLab 程序），开始连续记录膜电位，不施加任何电流输入；必要时调整电压的显示尺度和记录速率，在施加任何处理前，先用正常鱼用任氏液记录约五分钟的基础电活动。药物、激素、肽类等试剂应通过灌流方式加入脑组织标本，灌流速度为 200 微升每分钟。

在定位细胞后，使用普通鱼用生理盐水进行冲洗期，并在电压钳模式下检查和监测电极电阻。当电极尖端位于神经元表面且电极电阻发生轻微变化时，释放正压并施加少量负压，以在神经元上形成高阻封接。

轻轻用嘴吸液。使封接的细胞膜破裂。当膜破裂时，电阻会立即下降至约 120 到 250 兆欧。

现在切换到电流钳模式，使用图表连续记录膜电位，不施加任何电流输入。根据需要再次调整电压的刻度和记录速率。在正常鱼用生理盐水中记录约五分钟的电活动基线后，施加处理，随后进行洗脱期。moca终末神经 GnRH3 神经元的自发性电活动在电流钳模式下记录。

典型的放电频率为0.5至6赫兹动作电位。电位通常以强直性或节律性模式发放，峰电位间间隔相对规则，峰电位间的膜电位平均约为负48毫伏。该实验方法还可成功记录位于成年转基因动物前脑中GFP标记的促性腺激素释放激素神经元。

在转基因斑马鱼离体完整脑中记录神经元电活动。斑马鱼神经元电活动的记录方法与DACA类似，采用松散贴片法。相同技术也可实现全细胞记录。

与三叉终末神经中的GnRH神经元不同，斑马鱼位于前嗅区、腹侧头区及下丘脑的GnRH神经元在自发动作电位放电模式上通常表现为不规则。若操作得当，掌握该技术后可在一小时内完成一次持续15分钟的记录。祝你好运。