Name: 立体定向注射病毒载体的基因操作在小鼠脊髓条件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学习通过立体定向注射病毒载体在小鼠脊髓腰段背角实现基因靶向表达的技术。该方法利用显微注射泵和玻璃微电极进行精准定位，为研究脊髓神经功能和疼痛机制提供了可靠的实验手段。

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我们感谢马萨诸塞州查尔斯顿市麻省总医院神经科学中心病毒载体开发与生产部主任 Bakhos A. Tannous 博士为我们提供 rAAV-eGfp 载体，以及 John Whang 提供的技术支持。本研究由美国国立神经疾病与中风研究所资助项目 R01 NS050408（J.S. 负责）支持。

所述手术程序已获得哥伦比亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 设备与病毒颗粒悬液的制备
<ol>
	<li>清洁并消毒设备，对将用于固定第一腰椎（L1）的手术器械和V型缺口棘突进行灭菌。</li>
	<li>拉制并修整玻璃移液管。我们使用的移液管尖端直径为40 μm，并以20°角度修整。对玻璃移液管进行灭菌。</li>
	<li>安装立体定位仪，将微量注射器固定在操纵器上，并将注射器与控制器连接。</li>
	<li>使用压接套件将一根玻璃移液管连接到微量注射器上。</li>
	<li>从微量注射器中取出活塞，用矿物油填充注射器。可在矿物油中加入油红O（1-(2,5-二甲基-4-(2,5-二甲基苯基偶氮)苯基偶氮)-2-萘酚）以增强其可见性。重新插入活塞并将其推至注射器尖端，注意避免产生气泡。</li>
	<li>在生物安全柜中制备病毒颗粒悬液。将冷冻保存的病毒在冰上解冻，使用前用无菌磷酸盐缓冲液稀释至所需颗粒浓度。</li>
	<li>将微量注射器插入注射装置的固定架中。</li>
	<li>将5 μl病毒悬液移液至一小片塑料膜上， 例如 Parafilm。将玻璃移液器尖端插入液滴中，拉动活塞以填充微量注射器。在移液器尖端形成一个小的气泡，以防止堵塞。</li>
</ol>
2. 椎板切除术
<ol>
	<li>使用消毒剂擦拭实验台和加热垫，准备手术区域。</li>
	<li>对小鼠进行麻醉。我们采用异氟烷吸入麻醉（诱导时浓度为3%，维持时浓度为2%–3%）。</li>
	<li>在每只眼睛上涂抹润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。</li>
	<li>剃除小鼠从下背部至颈部的毛发，并使用局部抗菌剂（如氯己定或聚维酮碘）与70%乙醇交替擦拭皮肤进行消毒。用手术巾隔离无菌处理后的区域，并在切口部位浸润布比卡因（0.25%，用生理盐水1:10稀释）。</li>
	<li>沿中线在肋骨后端处切开皮肤（2–3 cm），并分离覆盖脊柱的筋膜。</li>
	<li>由于脊髓在出生后发育过程中比椎柱更早停止生长，因此脊髓节段L4位于第一腰椎（L1）下方。L1椎骨位于最后一对肋骨所附着的椎骨的尾侧。通过去除附着在其背侧的小型脊柱肌肉和韧带，识别并暴露L1椎骨。</li>
	<li>用Adson镊子轻轻提起并固定L1椎骨。使用专用的椎板切除镊子去除椎骨的背侧部分（棘突和椎板），暴露脊髓。注意避免损伤脊髓。</li>
	<li>将小鼠转移至立体定位仪中的加热板上。在后续操作过程中持续监测小鼠体温。</li>
</ol>
3. 注射
<ol>
	<li>用V形槽钉固定第一腰椎（L1），确保脊柱稳定，防止椎体在呼吸过程中移动。</li>
	<li>将微量注射器移近，使移液尖端位于椎板切除部位上方。缓慢下压推进器，直至观察到病毒悬液从移液尖端流出。使用无菌棉签清除液滴。</li>
	<li>将移液尖端定位在暴露的脊髓最前端区域。将移液尖端置于后正中沟上方中央位置，然后将尖端向侧方移动500 μm。将尖端降至脊髓表面，刺穿硬脊膜；若使用的是无斜面玻璃移液管，可先用带斜面的钢制套管刺穿硬脊膜，再将玻璃移液管尖端插入脊髓300 μm深度。</li>
	<li>以200 nl/min的速率注射1 μl病毒悬液。</li>
	<li>注射结束后，至少等待2分钟，再缓慢撤出移液管。</li>
	<li>在暴露的脊髓最尾端区域重复步骤3.3至3.5，以实现病毒载体在L4脊髓节段的完全分布。两个注射位点分别位于L4节段的头侧和尾侧，以避免对目标区域造成组织损伤。</li>
</ol>
4. 伤口闭合
<ol>
	<li>松开固定腰椎 L1 的 V 型槽夹具，将小鼠从立体定位架上取出。</li>
	<li>使用 5.0 Vicryl 线缝合筋膜。闭合的筋膜可覆盖椎板切除部位。</li>
	<li>使用尼龙缝线或外科缝钉闭合皮肤。</li>
</ol>
5. 术后护理
<ol>
	<li>将小鼠转移至带有柔软、无碎屑垫料的恢复笼中，侧放以利于舒适呼吸。持续监测动物状态，直至其完全清醒、能够自主活动并开始饮水。</li>
	<li>术后提供为期72小时的镇痛处理，每日皮下注射卡洛芬（5.0 mg/kg）。</li>
	<li>术后恢复期间，前3天每日检查一次，之后每周检查2至3次，直至实验结束。</li>
	<li>手术后7至10天，当伤口完全愈合后，拆除皮肤缝线或钉合钉。</li>
	<li>实验结束后，对动物实施安乐死。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

立体定位病毒载体注射可用于靶向脊髓神经元，以实现多种应用，例如基于跨突触病毒扩散的神经网络示踪6,7或光遗传学解析8、损伤后再生过程中的轴突导向9,10，以及用于预防或治疗神经退行性疾病的基因治疗11,12。病毒载体已被用于脊髓中的基因操作，以研究躯体感觉、运动及自主神经通路9,10,13-15。小鼠是进行脑或脊髓立体定位注射病毒载体研究中最广泛使用的模式生物，但该技术也已应用于其他物种，包括非人灵长类动物16。
立体定位法将载体注射至小鼠脊髓是安全的；此处描述的手术过程仅需在注射部位进行一次椎板切除术，因此动物术后脊柱运动不会出现不稳。插管注射及缓慢撤出导管的操作在10分钟内完成，包括皮肤准备和伤口缝合在内的整个手术过程约持续40分钟。术后我们使用卡洛芬（carprofen）——一种非甾体抗炎镇痛药——提供长达72小时的镇痛处理。
为了尽量减少组织损伤，我们采用拉制的玻璃毛细管，其尖端直径为 4...

小鼠中条件性基因操作的先进技术为探索中枢神经系统中的突触通路和功能连接提供了多方面的研究手段。转基因的表达可通过小分子效应物进行调控，例如四环素控制的转录激活因子（tetracycline-controlled transactivator）可被强力霉素（doxycycline）所调节，该系统可被设计为基因转录的抑制子或激活子；此外，他莫昔芬（tamoxifen）可识别雌激素受体中突变的配体结合结构域1。不可逆的转基因修饰通常通过脱氧核糖核酸（DNA）重组酶实现。Cre（causes recombination）和Flp（flippase recombination enzyme）分别催化位于loxP（locus of crossing over, P1）或Frt（flippase recognition target）位点之间的DNA片段发生切除、倒位或易位1。这些技术的应用包括基因的激活或沉默，以及可诱导的核糖核酸（RNA）干扰2。通过条件性表达荧光蛋白或酶报告基因（如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶），可用于标记神经元并研究其空间分布与连接性3。北美地区（<a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a>）和欧洲（<a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a>）的大规模诱变项目正在构建一系列小鼠胚胎干细胞克隆文库，这些克隆携带条件性基因靶点和基因捕获元件，最终将覆盖整个小鼠基因组。由这些克隆产生的小鼠可与越来越多的转基因小鼠品系杂交，后者在特定神经元群体特异的启动子或基因座驱动下表达DNA重组酶，从而实现靶向性的基因操作（<a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php</a>）。
然而，如果缺乏针对特定神经元群体的特异性启动子，或该启动子未在目标区域的所有神经元中表达，则仅依靠遗传靶向技术可能无法将基因操作限制在特定的神经元群体或特定感兴趣区域。在脊髓中，实验设计可能需要将基因操作的空间范围限制在一至两个颅尾向节段内。通过立体定位注射表达Cre或Flp的病毒载体，可将基因重组限制在小鼠脊髓中DNA片段两侧含有loxP或Frt位点（即所谓的floxed或flrted等位基因）的区域。与通过将动物与表达重组酶的小鼠杂交所导致的组成型DNA重排不同，该策略还可实现对基因激活或沉默的时间控制。携带floxed或flrted转基因的病毒载体则为在神经元特异性启动子驱动下表达相应重组酶的小鼠提供了反向基因操作的选择。目前已有多类具有神经元趋向性的重组载体可供使用4。高容量（无壳）腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和慢病毒是常用的嗜神经病毒载体。根据研究问题选择合适的病毒类型是实验设计中的关键环节，需综合考虑转基因的大小、递送途径、对神经元而非胶质细胞的感染特异性、感染效率以及炎症和毒性副作用等因素4。
本文介绍了将病毒载体立体定位注射至脊髓背角的技术，该技术被我们用于疼痛神经生物学研究中的条件性基因调控。脊髓背角接收来自初级躯体感觉神经元（包括伤害性感受神经元）的传入输入。局部中间神经元对信息进行处理后，由投射神经元将信号从背角传递至大脑5。我们展示了在脊髓节段L4水平，利用嗜神经的重组腺相关病毒（rAAV）感染背角神经元，该病毒在组成型活性的巨细胞病毒启动子驱动下表达增强型绿色荧光蛋白（eGfp）。

<table><tbody><tr><td>脊柱基板</td><td>David Kopf Instruments</td><td>912</td><td></td></tr><tr><td>小型动物立体定位仪</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>小动物气体麻醉头部固定器</td><td>David Kopf Instruments</td><td>923-B</td><td></td></tr><tr><td>可调式基座安装架</td><td>David Kopf Instruments</td><td>982</td><td></td></tr><tr><td>V型槽尖钉</td><td>David Kopf Instruments</td><td>987</td><td></td></tr><tr><td>小动物温控系统</td><td>David Kopf Instruments</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>阿顿镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>椎板切除镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump（一台）配SYS-Micro4控制器</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器，65RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>RN压缩接头，1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>微量研磨器</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr></tbody></table>

在小鼠脊髓中进行病毒载体的立体定位注射以实现条件性基因操作

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

向脑实质内注射病毒载体可实现对中枢神经系统中特定神经元群体或特定区域的条件性基因操作。本文演示了一种立体定位注射技术，可在小鼠脊髓背角实现靶向基因表达或基因沉默。该手术过程简短，仅需切除单个椎骨的椎板，从而实现动物快速恢复及脊柱运动功能不受影响。通过控制低速注射少量病毒载体悬液，并使用带有斜面玻璃套管的微量注射器，可最大限度减少组织损伤。机体对病毒载体的局部免疫反应取决于所用病毒的内在特性；根据我们的经验，当使用重组腺相关病毒时，该反应轻微且持续时间短暂。报告基因（如增强型绿色荧光蛋白）有助于监测病毒载体的空间分布，以及转染效率和细胞特异性。

成功的转染可在注射侧背角的神经元中实现高效的基因表达（图1），而不影响对侧背角、腹角以及背根神经节。
<img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="神经组织的荧光显微镜图像，合并图像中显示用于分析的红色和绿色标记。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 背角神经元的转染。 (A) 在立体定位注射rAAV-eGfp（血清型AAV2/8，109基因组拷贝/μl）两周后，L4脊髓左侧背角中荧光报告基因eGfp（绿色）的表达。神经元经神经元核蛋白（NeuN，红色）免疫染色标记。箭头指示背柱中散在的转染胶质细胞。比例尺，150 μm。(B) 背角内侧约80%的神经元被感染。比例尺，20 μm。免疫染色使用EMD Millipore公司的NeuN单克隆抗体，稀释比例为1:2,000。

病毒载体可实现靶向基因操作。本文演示一种在小鼠脊髓中进行条件性基因表达或基因剔除的方法，通过立体定位注射将病毒载体注入脊髓背角，此处是初级躯体感觉传入神经与中枢神经系统神经元之间突触联系的重要部位。

在中枢神经系统特定神经元群体或特定区域的实质内注射病毒载体，可实现条件性基因操作。

本实验的总体目标是通过立体定位将病毒载体注射至腰段背角，从而在小鼠脊髓中实现空间限制性的基因表达。实验的第一步是定位并暴露腰椎椎骨。第二步是去除椎骨的背侧部分，以暴露脊髓。一种称为椎板切除术的操作。接下来，将连接至微量注射泵的玻璃移液管置于背角上方，并缓慢插入脊髓。最后一步是缓慢注入载体悬液。两周后，通过绿色荧光蛋白的表达可证明背角神经元的转染成功，从而能够追踪病毒的分布情况。该方法有助于阐明感觉通路中部分神经元的功能。我们将其应用于专注于炎症性或神经病理性疼痛发生机制的研究中。直观演示对于学习如何将小鼠放置于立体定位仪框架中至关重要。由于椎板切除术是一项极为精细的技术，因此确保脊柱被正确固定对于手术成功至关重要。我实验室的研究生 Martin Mole 将演示该操作过程。研究助理 John Wang 将在手术前一到两天协助他。在手术当天，拉制玻璃移液管，使尖端直径达到 40 微米，并将尖端以 20 度角进行斜面打磨。开始手术前，先对手术器械进行消毒，并准备无菌手术工具，以安装立体定位仪。将微型注射器安装到操纵器上并接通电源。使用压接接头将一根玻璃移液管连接到微型注射器上。然后从微型注射器上取下活塞。用矿物油填充注射器，然后重新插入活塞并推至针尖端。注意避免产生任何气泡。随后将微量注射器插入注射装置的固定 holder 中。接下来，从冷冻箱中取出病毒，在使用前用无菌磷酸盐缓冲液将其稀释至所需的颗粒浓度，以制备病毒颗粒悬液。用移液器吸取5 µL病毒悬液，滴加到一小块param上。然后将玻璃移液尖端插入液滴中，拉动活塞以填充微量注射器。最后，在移液器尖端形成一个小的气泡，以防止其堵塞。在此步骤中，使用消毒剂擦拭加热垫上的实验台面，以准备手术区域。然后通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉。接着，在每只眼睛上涂抹润滑剂，以防止手术过程中眼睛干涩。随后，剃除小鼠从下背部至颈部的毛发。使用局部消毒剂（如氯己定或聚维酮碘）和70%乙醇交替擦拭皮肤进行消毒。随后用生理盐水将0.25%布比卡因稀释十倍，浸润切口部位。接着在肋笼的抱窝端沿中线切开皮肤，长度为2至3厘米，并分离覆盖脊柱的筋膜。辨认第一腰椎（L1），该椎骨位于最后一对肋骨所连椎骨的头侧，通过去除附着在其背侧的小脊肌和韧带将其暴露出来。然后用一把持针器和镊子轻轻提起并固定第一腰椎（vertebra L1）。接着，使用专用的椎板切除镊去除椎骨的背侧部分，包括棘突和椎板，以暴露脊髓。在此操作过程中，应避免损伤硬脑膜或脊髓。然后将小鼠转移至立体定位架上的加热板，并在后续操作过程中监测小鼠体温。现在使用V形槽钉固定脊柱，以防止椎体在呼吸时移动。接着，将微量注射器移近，使移液管尖端位于椎板切除部位上方。将活塞缓慢下压，直至观察到病毒悬液从移液器尖端流出。用无菌纱布吸去液滴。然后将移液器尖端置于暴露的脊髓最前端部位。将移液管置于后正中沟

stereotaxic-injection-viral-vector-for-conditional-gene-manipulation

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

立体定向注射病毒载体的基因操作在小鼠脊髓条件

来源：Porlan, E., 等．用于分析成年小鼠V-SVZ神经干细胞自主性与非自主性效应的稳定高效遗传修饰细胞方法．J. Vis. Exp.

小鼠模型中用于稳定遗传修饰的病毒立体定位注射

来源： Chen, S., et al., 新生小鼠脑纹状体细胞遗传学操作的立体定位手术。J. Vis. Exp. (2018)本视频演示了将编码 Cre 重组酶和绿色荧光蛋白（GFP）的病毒载体通过立体定位注射至基因改造小鼠幼崽的纹状体，以切除两侧带有 loxP 位点的 STOP...

立体定向显微注射病毒载体用于小鼠幼崽纹状体的基因操作

来源：Tadokoro, T.，等。成年小鼠软膜下腺相关病毒9型（AAV9）载体递送。J. Vis. Exp.

小鼠脊髓软膜下基因递送以评估基因表达

来源：Pereira, M. et. al., 通过脑内注射病毒载体在体内直接重编程常驻胶质细胞为中间神经元。J. Vis. Exp.

小鼠模型中胶质细胞重编程的立体定位病毒载体注射

来源：Fricano-Kugler, C. J., et al. 通过立体定位注射设计、包装和递送高滴度 CRISPR 逆转录病毒和慢病毒。J. Vis. Exp.

小鼠脑内靶向神经元基因编辑的立体定位病毒注射

来源：Li, D., et al. 成年小鼠中重组腺相关病毒的直接鞘内注射. J. Vis. Exp.

在小鼠模型中通过鞘内递送病毒治疗中枢神经系统疾病

CRISPR/Cas9 系统有望使靶向基因组编辑技术在科学界变得易于获取且成本低廉。本实验方案旨在演示如何利用 CRISPR/Cas9...

高滴度CRISPR逆转录病毒与慢病毒的设计、包装及通过立体定位注射递送

通过注射依赖重组酶的重组腺相关病毒（rAAV）可操控脊髓中任意基因标记的细胞类型。本文介绍如何转导腰段脊髓背角中的神经元。该技术可实现对被操控神经元亚型的功能性研究。...

腺相关病毒介导的脊髓遗传学定义神经元中转基因表达

本方案演示了将一种可逆向运输的病毒载体注射到大鼠脊髓组织中的操作。该载体在突触处被摄取，并逆向运输至靶神经元的胞体。此模型适用于重要脊髓通路的逆向示踪，或用于基因治疗应用中对特定细胞的靶向递送。...

直接注射慢病毒载体突出显示大鼠脊髓中的多条运动通路

本方案展示了一种新方法，通过向新生大鼠出生后5至10天的体躯运动皮层注射顺向化学遗传修饰剂，并向颈段脊髓注射可逆向运输的Cre重组酶，实现对特定细胞亚群的基因治疗。...

使用双病毒载体通过联合脑部与脊柱手术靶向新生大鼠皮质脊髓束

腰椎鞘内注射是一种具有转化相关性的给药途径，可用于将基因治疗递送至中枢神经系统。本标准化操作方案全面涵盖了新生期、幼年期及成年小鼠和大鼠的腰椎鞘内注射技术，旨在指导研究人员在临床前基因治疗研究中采用该技术。...

小鼠和大鼠中枢神经系统靶向基因治疗载体的腰椎鞘内注射

学习通过立体定向注射病毒载体在小鼠脊髓腰段背角实现基因靶向表达的技术。该方法利用显微注射泵和玻璃微电极进行精准定位，为研究脊髓神经功能和疼痛机制提供了可靠的实验手段。

在小鼠脊髓中进行病毒载体的立体定位注射以实现条件性基因操作

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