在小鼠脊髓中进行病毒载体的立体定位注射以实现条件性基因操作

本实验的总体目标是通过立体定位注射病毒载体至小鼠腰段背角，实现小鼠脊髓中空间受限的基因表达。该实验的第一步是定位并暴露腰椎椎体。第二步是去除椎体的背侧部分，以暴露脊髓。

一种称为椎板切除术的操作。接下来，将连接至微量注射泵的玻璃移液管置于背角上方，并缓慢插入脊髓。最后一步是缓慢注入载体悬液。

两周后，通过绿色荧光蛋白的表达可观察到背角神经元的转染情况，从而能够追踪病毒的分布。该方法有助于阐明感觉通路中部分神经元的功能。我们将其应用于专注于炎症性或神经病理性疼痛发生机制的研究中。

视觉演示对于学习如何将小鼠放置于立体定位仪框架中至关重要。脊柱必须被正确固定，这对于手术的成功至关重要，因为椎板切除术是一种非常精细的技术。我实验室的研究生 Martin Mole 将演示该操作过程。

研究助理 John Wang 将在手术前一到两天协助他。在手术当天，拉制玻璃移液管，使尖端直径达到 40 微米，并将尖端以 20 度角进行斜面打磨。开始操作时，先对手术器械进行消毒，并准备无菌手术工具，以安装立体定位仪。

将微型注射器安装到操纵器上，并接通设备电源。使用压接接头将一根玻璃微量移液管连接到微型注射器上。然后从微型注射器上取下活塞。

用矿物油填充注射器，然后重新插入活塞并推至针尖端。注意避免产生任何气泡。接着将微量注射器插入注射装置的固定架中。

接下来，从冷冻箱中取出病毒，并在使用前用无菌磷酸盐缓冲液将其稀释至所需颗粒浓度，制备病毒颗粒悬液。用移液器吸取5 µL病毒悬液，滴加到一小块石蜡膜上。然后将玻璃移液器尖端插入液滴中，并拉动活塞以填充微量注射器。

最后，在移液器尖端形成一个小的气泡，以防止其堵塞。在此步骤中，使用消毒剂擦拭加热垫上的实验台面，以准备手术区域。

然后通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉。接着，在每只眼睛上涂抹润滑剂，以防止手术过程中眼睛干燥。随后，剃除小鼠从颈部至下背部的毛发。使用局部消毒剂（如氯己定或聚维酮碘）和70%乙醇交替擦拭，对皮肤进行消毒。

然后用生理盐水将0.25%布比卡因稀释10倍后浸润切口部位。随后沿肋笼底部中线切开皮肤2至3厘米，并分离覆盖脊柱的筋膜。辨认第一腰椎（L1），该椎骨位于最后一对肋骨所连椎骨的尾侧，通过去除其背侧附着的小脊柱肌肉和韧带暴露该椎骨。

然后用有齿镊轻轻提起并固定第一腰椎（L1），接着使用专用的椎板切除镊去除椎骨的背侧部分，包括棘突和椎板，以暴露脊髓。在此操作过程中应避免损伤硬脊膜或脊髓。

然后将小鼠转移至立体定位仪中的加热板上，并在后续操作过程中监测小鼠的体温。现在使用V形槽尖钉固定脊柱，以防止椎骨在呼吸时移动。接着，将微量注射器靠近，使移液器尖端位于椎板切除部位上方。

将移液器推杆缓慢下压，直至观察到病毒悬液从移液头末端流出。用无菌纱布吸除液滴。随后将移液头尖端置于暴露的脊髓最前端部位。

将移液管尖端置于后正中沟上方并横向移动500微米。随后，将尖端降至脊髓表面并刺破硬脊膜。接着，将玻璃移液管尖端向下插入脊髓300微米。

以每分钟 200 纳升的速度注射 1 微升病毒悬液。注射结束后，至少等待两分钟，再缓慢撤回移液管。在暴露的脊髓背侧最突出部位重复注射操作，以实现病毒载体在腰段 L4 脊髓节段内的完全分布。

两个注射位点位于腰段第四节（L4）的头侧和尾侧。注射完成后，为避免靶区组织受损，需从V形切口处松开第一腰椎（L1）的椎骨夹，并将小鼠从立体定位仪框架中取出。接着，使用5-0薇乔线缝合筋膜。

闭合筋膜以覆盖椎板切除部位。随后使用尼龙缝线或外科缝钉关闭皮肤。术后给予持续72小时的镇痛治疗，每天皮下注射卡洛芬，剂量为每千克体重5毫克。

将小鼠转移到铺有柔软、无特殊颗粒垫料的恢复笼中。将小鼠侧放以利于舒适呼吸，随后持续监测直至其完全清醒。

救护车并开始饮水。术后前三天每天进行检查，以监测恢复情况，之后每周每隔一天或每三天检查一次，直至实验结束。

术后7至10天，当伤口愈合完成后，拆除皮肤缝线或缝合钉。该图显示了增强型绿色荧光报告蛋白（EGFP）在L4脊髓左侧背角的表达。

立体定向注射 R-A-A-V-E-G-F-P 两周后，神经元经免疫染色显示神经元核蛋白（红色箭头所示）。箭头指向背柱中散在的转染胶质细胞。内侧背角约 80% 的神经元被成功感染。

该操作可在30至40分钟内完成，请务必在操作过程中保持无菌条件。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对小鼠脊髓的腰膨大部位进行椎管内注射。我们目前使用该技术进行基因操作，但您也可将其改进用于其他用途，例如脊髓内药物注射。