Name: 微观粒子图像测速技术，微血液流动的速度剖面测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学习使用微观粒子图像测速技术测量微通道中血液流动的速度剖面。该方法通过图像互相关分析获取位移矢量场，可计算剪切率和最大流速，为生物医学工程研究提供重要的血流动力学数据。

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作者感谢加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）提供的资金支持，感谢Catherine Pagiatikis在初始实验运行中的帮助，感谢Sura Abu-Mallouh和Frederick Fahim对实验方案的测试，感谢LaVision公司Richard Prevost提供的技术支持，以及感谢蒙特利尔大学Guy Cloutier出借Dalsa高速相机。

1. 微芯片制备
第一步是制备或购买微通道。微芯片材料有多种选择。
最常选用的材料之一是聚二甲基硅氧烷（PDMS）。已有大量文献报道了通过软光刻技术制备PDMS的操作方法16,17,18。
PDMS 通道制备完成后，可通过多种表面处理方法逆转其天然的疏水性。其中，氧气等离子体处理是一种常用方法。
Zhou、Ellis 和 Voelcker（2009）综述了表面处理及其对 PDMS 的影响。然而，这些结果是针对水的，而血液具有不同的性质。Pitts 已开展研究，探讨该表面处理对血液的意义。 等 (2012a)
对于此处展示的结果，微流控芯片表面及其所键合的玻璃载片均经过45秒的氧气等离子体处理，随后被紧密压合，从而形成永久性键合。
2. 血液制备
<ol>
	<li>从经认证的机构采集血液样本。例如，可使用乙二胺四乙酸（EDTA）作为抗凝剂的猪血。将1 g EDTA溶于4 ml水中，然后将该溶液加入1 L全血中，轻轻混匀10次。</li>
</ol>
采集血样后，应让其缓慢冷却至室温。血样应保持新鲜，最好在采集当天使用，以维持血液的流变学特性。
样本可在室温下冷藏一次；然而，不含抗凝剂的全血在冷藏后将无法使用。根据所用抗凝剂的不同，红细胞可在冷藏条件下保存最长42天，全血可在冷藏条件下保存35天，但在非医疗场所中可能存在污染风险21。
此外，采集牛或猪样本时需注意采集方法，避免骨髓污染。
<ol start="2">
	<li>将血液样本以3,000 rpm离心3次，每次10分钟。第一次离心后，移除血浆和白膜层，并弃去。通常先移除血浆最为方便，然后可选择弃去或保存以备后续使用，再单独移除白膜层。</li>
</ol>
缓慢插入移液管，以免将白膜层重新混入血液中。去除白膜层后，加入约 20 ml 磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻混匀，再次离心。重复上一步骤。第三次离心后，移除 PBS 及残留的白膜层，并弃去。
如果希望保留血液的聚集特性，也可以使用天然血浆代替PBS。注意不要将任何血沉棕黄层或白细胞混入血浆中。
<ol start="3">
	<li>取清洁后的红细胞（RBCs），用 PBS 或血浆悬浮至所需浓度（红细胞压积）。使用微量离心机（CritSpin FisherSci, USA）检测红细胞压积。</li>
</ol>
血细胞比容为10%至20%的血液应比40%或50%（生理血细胞比容）更易于观察。在微循环中，血液的血细胞比容通常约为大循环的一半，因此H=20是足够的15。
<ol start="4">
	<li>将荧光示踪粒子以所需浓度加入血液样本中。一般原则是每个相关窗口内应有10个粒子，该数值可预先计算得出。</li>
</ol>
例如，在视频所示的实验设置中，将 30 μl 颗粒加入 1 ml 血液溶液中。或者，也可对红细胞本身进行荧光标记。
<ol start="5">
	<li>此外，使用水和荧光微粒配制校准溶液。必须使用牛顿流体溶液对系统进行校准。</li>
</ol>
例如，当使用10倍物镜且通道尺度为100 μm时，合适的浓度是将300 μl的微粒与15 ml蒸馏水混合。另一种选择是使用蒸馏水稀释甘油，使其黏度达到3 cP，这更接近血液的宏观黏度。
3. μPIV 测量
<ol>
	<li>激光安全：检查温度和湿度。佩戴合适的激光防护眼镜。关闭激光防护帘或打开实验室门上的激光警示标志，以防止未受保护的人员暴露于激光下。</li>
	<li>Davis 软件的操作流程见视频演示。更多详细信息请参考特定系统的产品用户手册。</li>
	<li>在采集数据之前，需使用显微测微尺对相机标尺进行校准。</li>
	<li>为降低系统顺应性，应使用最短的管路和尽可能小的刚性注射器，例如 15 或 50 μl 的 Hamilton Gastight 注射器。为减少血液泄漏或空气进入系统，需将管路与注射器及芯片之间进行密封。可使用胶水、PDMS 或凡士林进行密封（注意避免污染血液）。</li>
</ol>
由于微注射器的体积通常远小于需填充的体积，因此应使用反向灌注法将含有示踪粒子的水注入微注射器中。
我们的回流方法是通过通道的出口，使用一个辅助的塑料注射器，将液体注入微注射器和通道中。具体操作如下：首先移除微注射器的活塞，然后将连接在通道出口处的普通塑料注射器推动，使液体流入，让液体从微注射器末端流出，直至微注射器、管路或芯片中的所有微小气泡完全排出，最后将活塞重新插入，并拔下塑料注射器。微小气泡的存在与否可通过显微镜进行观察确认。
<ol start="5">
	<li>调节注射泵以使管路保持水平。将注射泵设置为所需的流速。</li>
</ol>
需注意可能存在的瞬态效应，例如刚性系统中的“瓶颈效应”或系统顺应性对实际流速的影响。系统的特征时间可根据系统的材料和尺寸进行估算。（第2章，第77-81页，Tabeling，2005）
<ol start="6">
	<li>将微芯片置于显微镜载物台上并启动泵。使用含有颗粒的水对系统进行校准，以获得中间速度分布，并校准 dT（脉冲图像之间的时间）。</li>
</ol>
为了获得良好的相关性，颗粒在相邻帧之间的移动距离应为5到10个像素11。校准时，应注意在通道的中央区域进行测量，因为中间层面的焦平面具有最高的流速8。
若使用圆形通道，请注意阴影效应。
使用脉冲相机拍摄的样本图像如图2所示，其中上方图像为第一次脉冲捕获的图像，下方图像为第二次脉冲捕获的图像。从图中可以看出，最亮的点（发出荧光的颗粒）处于最清晰的焦平面。
<ol start="7">
	<li>可选：通过采集不同高度的数据，可将各个矢量叠加至单幅图像中，重建出三维速度分布图。视频展示了一种为实现该过程自动化而开发的实验流程。</li>
	<li>使用血液采集数据时，采用与取水样相同的方法，用所需量的血液填充注射器。将注射泵设定至所需的流速，并采集所需数据。此处展示了获得的原始图像示例。 图2注意红细胞沉降问题。每次运行或每隔一次运行后重新填充注射器，可减少红细胞的沉降。</li>
	<li>获取图像后，需对图像对进行互相关运算，以获得图像间的速度矢量场。获得高质量的图像对于实现良好的相关性至关重要。在进行相关运算前，可进行预处理以去除背景噪声。</li>
</ol>
在相邻图像的窗口之间进行互相关运算，窗口的大小和形状可以调整，以影响相关性结果。互相关运算完成后，可对图像进行后处理，以去除错误的矢量或异常值。
不同可选方法及其准确性的详细描述可参见 Pitts et al. (2012b)，其中发现针对血液的最佳处理方法是采用“图像重叠”法，即使用沿流动方向延长并对齐的窗口。这些操作可在 MATLAB 等程序中手动完成，也可在您系统配套的软件包中实现。软件本身并不重要，操作背后的数学原理更为关键，每一项操作都可能影响最终速度分布的准确性。
可对所得矢量在通道内进行空间平均，以获得瞬时速度分布，然后进一步进行时间平均，以得到具有代表性的平均速度分布。Kloosterman et al. (2011) 阐述了在景深较大时 μPIV 测量中的误差问题。关于本文所述数据处理方法的误差讨论，可参见 Pitts et al. (2012b) 对脉冲测量的分析，以及 Chayer et al. (2012) 对高速测量的分析。
速度分布的示例如图3和4所示。图3展示了在140 μm宽的通道中，红细胞在H=10条件下以10 μl/hr流速流动时中心线处的单个速度分布。
通过在通道内对相关联的矢量进行平均，得到速度分布，再对时间进行平均，从而获得具有代表性的测量结果。本例中，在视场范围内对100组数据对进行了时间上的平均。
在程序设定流速为 30 μl/hr 的 100 μm 方形通道中进行水校准流动时，所获取的三维重建轮廓示例见图 4。在图 4中，轮廓以 1 μm 间隔进行测量。
<ol start="10">
	<li>可选：在图示的实验装置中，可通过更换相机（及数据采集系统）在相同条件下拍摄高速图像。这有助于可视化通道中的无细胞层，并用于定量分析聚集情况。数据分析方法略有不同（Chayer et al., 2012）。</li>
</ol>
在 H=20 条件下，图5 展示了存在和不存在红细胞聚集时的白光图像示例。上方图像显示的是在 PBS 中 H=20、流速为 1 μl/hr 的情况，此时红细胞无法发生聚集。下方图像为在天然血浆中 H=20、流速为 0.5 μl/hr 的情况，可见明显的红细胞聚集现象。
<ol start="11">
	<li>测量完成后，以安全的方式关闭系统。在激光电源完全关闭之前，应始终遵循正确的激光安全操作规程。</li>
</ol>

<ol><li>Santiago, J. G., Wereley, S. T., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+particle+image+velocimetry+system+for+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">A particle image velocimetry system for microfluidics.</a> Experiments in Fluids. 25, 316-319 (1998).</li>
<li>Evaluation of Velocity Measurement in Micro Tube by Highly Accurate PIV Technique. Sugii, Y., Okamoto, K., Nishio, S., Nakano, A. 4th International Symposium on Particle Image Velocimetry (PIV '01), 17-19 Sept. 2001, , 1-5 (2001).</li>
<li>Park, J. S., Choi, C. K., Kihm, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sliced+micro-PIV+using+confocal+laser+scanning+microscopy+%28CLSM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Optically sliced micro-PIV using confocal laser scanning microscopy (CLSM).</a> Exp. Fluids. 37 (1), 105-119 (2004).</li>
<li>King, M. R., Bansal, D., Kim, M. B., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hematocrit+and+leukocyte+adherence+on+flow+direction+in+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+of+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">The effect of hematocrit and leukocyte adherence on flow direction in the microcirculation.</a> Ann. of Biomed. Eng. 32 (6), 803-814 (2004).</li>
<li>Lima, R., Wada, S., Tsubota, K., Yamaguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+micro-PIV+measurements+of+three-dimensional+profiles+of+cell+suspension+flow+in+a+square+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Meas.+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Confocal micro-PIV measurements of three-dimensional profiles of cell suspension flow in a square microchannel.</a> Meas. Sci. Tech. 17 (4), 797-808 (2006).</li>
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<li>Olson, M. G., Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out-of-focus+effects+on+particle+image+visibility+and+correlation+in+microscopic+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">Out-of-focus effects on particle image visibility and correlation in microscopic particle image velocimetry.</a> Experiments in Fluids. 29, S166-S174 (2000).</li>
<li>Wereley, S. T., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+micro-particle+image+velocimetry+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Recent advances in micro-particle image velocimetry techniques.</a> Ann. Rev. Fluid Mech. 42, 557-576 (2010).</li>
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<li>Chiu, J. J., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium%3A+Pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiol. Rev. 91 (1), 327-387 (2011).</li>
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<li>Popel, A. S., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+and+hemorheology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechancis%22%5BJournal%5D)">Microcirculation and hemorheology.</a> Annual Review of Fluid Mechancis. 37, 43-69 (2005).</li>
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<li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+of+poly%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated of poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24, 3563-3576 (2003).</li>
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<li>Hovav, T., Yedgar, S., Manny, N., Barshtein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+red+blood+cell+aggregability+and+shape+during+blood+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Alteration of red blood cell aggregability and shape during blood storage.</a> Transfusion. 39, 277-281 (1999).</li>
<li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow%3A+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Measurement Science and Technology. 23, 105302(2012).</li>
<li>Kloosterman, A., Poelma, C., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+rate+estimation+in+large+depth-of-field+micro-PIV%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Flow rate estimation in large depth-of-field micro-PIV.</a> Exp. Fluids. 50 (6), 1587-1599 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在微循环尺度上使用μPIV进行血流测量，可为大量相关的生物医学、机械工程和化学工程过程提供深入见解。需要考虑的一些关键因素包括红细胞（RBC）本身的密度、RBC的聚集性和变形能力、荧光示踪微粒的聚集或运动，以及RBC在通道中的沉降。只要遵循上述一般性指导原则，这些因素均可得到有效控制。使用该系统进行良好测量时，需牢记一个基本检查清单。首先，确定系统或拟用系统的顺应性程度。为最小化顺应性，应使用尽可能短的管路和尽可能小的注射器。刚性系统顺应性较低，但可能导致瓶颈效应。尽管测量尺度很小，重力仍会影响RBC。理想情况下，应使注射器、管路和通道处于同一高度。其次，确定悬浮液的浓度。确保溶液中存在足够数量的荧光示踪粒子，同时RBC浓度不宜过高。增加样品中示踪粒子的密度无法克服RBC本身固有的不透明性。示踪粒子的数量会影响互相关结果，但RBC过多会使流体变得不透明，导致示踪粒子难以成像。样品的整体红细胞压积（hematocrit）必须足够低，以确保能够清晰成像通道的中层平面。这需要在红细胞压积与通道尺寸之间进行权衡。即使红细胞压积较低，随着深度增加，物镜与测量平面之间的RBC数量也会增多。为了成像较高红细胞压积的样品或更大尺寸的通道，可采用“鬼细胞...

人体内含有大量直径小于50 μm的血管，这些血管是血液与组织之间进行物质交换的主要场所。由于测量尺度极小以及血液本身的流体特性，研究这些血管中的血流状况面临巨大挑战。包括微动脉和微静脉中的压力梯度、管壁剪切力以及速度分布在内的这些测量参数，是与生理反应密切相关的关键因素。得益于在微尺度上研究微循环的新实验技术，如今已前所未有地具备了解决这些测量难题的机遇，从而应对这一多尺度的科学问题。
微粒子图像测速技术（μPIV）是一种基于粒子的流动可视化方法，通过互相关分析来评估微通道中血液流动的速度分布。μPIV 最初由 Santiago et al. 开发，自 2001 年 Sugii et al. 首次将其用于测量 100 μm 圆形玻璃管中的血流以来，该技术已广泛应用于血液流变学研究1,2。目前存在多种 μPIV 实现方式：可采用高速相机对红细胞（RBCs）的运动进行相关分析，也可利用脉冲图像对示踪粒子的运动进行相关分析。根据具体应用需求，上述任一方法均可与正置或倒置显微镜联用。在这两种情况下，均可获得二维速度分布图。另一种方法是结合共聚焦显微镜以获取二维和三维速度分布图，该方法已被应用于血液研究3,4,5。
与宏观PIV相比，微尺度PIV存在若干技术难点。在宏观PIV中，可通过片状光将数据限制在单一平面内，但在微尺度下必须采用体照明。体照明在微血管血流成像中带来更大的挑战，因为红细胞（RBC）本身的尺寸相对于微通道较大，若以RBC作为示踪粒子，会导致相关深度（DOC）增大，从而显著降低互相关分析结果的准确性6,7,8。根据Wereley et al.（1998）的研究，在使用RBC作为示踪物时，40 μm高的通道其DOC为8.8 μm，而使用1 μm示踪粒子时DOC为6.7 μm。当改变通道高度和放大倍数时，这种差异会更加显著。此外，RBC具有不透明性，增加流体中RBC的密度会导致成像困难。 Santiago et al.（1998）首次使用的荧光示踪微粒被推荐为一种有效手段，可在使用尽可能小的粒子时减少离焦粒子的干扰。结合激光使用直径为1 μm的荧光微粒，是一种有望缓解微血管血流成像中焦深问题的方法10。目前已有若干关于μPIV技术发展现状的综述文章，均强调了μPIV在血液流动研究中的重要性11,12。在将μPIV应用于血液研究时，必须考虑若干关键因素。在微尺度下，由于微循环的尺度极小，血液不能被视为均质流体，而是一种由可变形的红细胞（RBC）、较大的白细胞、血小板及其他蛋白质悬浮于牛顿流体（血浆）中所形成的复杂悬浮液。
此处测量的速度分布可用于评估微血管血流的某些特性。微循环流变学中的重要参数包括血流速率、速度分布的形状以及血管壁处的剪切应力。这些信息具有临床意义，因为微循环是体内营养物质交换的场所，而这种交换依赖于剪切力。目前已有若干综述研究探讨了微循环领域的研究现状13,14,15。
本文介绍了一种利用微粒子图像测速技术（μPIV）测量聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道中血液流动的实验方案。PDMS微通道根据本方案第1节所述方法自行制备。猪血样本取自经认证的屠宰场，并按照方案第2节进行清洗处理。所有数据均使用LaVision MITAS μPIV系统采集，该系统在方案第3节中有详细描述。该系统由一台Nd:YAG激光器（New Wave Research，美国）、一台CCD相机（Image Intense，LaVision）组成，二者由可编程触发单元控制，配备荧光显微镜及三轴移动载物台，以及一台计算机；此外，还增加了一台高速相机（Dalsa 1M150，荷兰），用于红细胞（RBC）本身的可视化观察。两台相机均连接至一个双通道光学分光盒（由Zeiss公司，德国，定制）。在典型的in vivo（体内）血液流动测量中，通常使用直立显微镜直接追踪红细胞；而在典型的in vitro（体外）应用中，则使用倒置显微镜追踪示踪粒子。本实验采用独特的双相机配置，通过光学分光盒，使倒置显微镜可同时成像两种示踪物。血液通过高精度注射泵（Nexus3000，Chemyx Inc.，美国）引入微芯片。系统示意图见图1，图中上半部分表示由PDMS制成的140 μm × 40 μm矩形微通道，下半部分展示了整个系统，包括两台相机、激光器、注射泵和显微镜。
目前可用的微粒子图像测速（μPIV）系统通常配备专有软件，包括TSI、Dantec Dynamics和LaVision。标准的互相关算法可通过多种软件实现，其中包括MATLAB。软件本身并非关键，更重要的是理解对话框中各项参数所对应的数学含义，这将使用户受益更多。本实验方案中使用了LaVision的专有软件DaVis或MATLAB。该方案不依赖于特定软件，但不同软件包中的菜单选项位置可能有所不同。

<table><tbody><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS），&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>荧光微粒</td><td>Microgenics/FisherSci</td><td>R900</td><td></td></tr><tr><td>甘油（可选）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6279-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; CritSpin</td><td>FisherSci</td><td>22-269-291</td><td></td></tr><tr><td>注射器，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; 50 &amp;mu;l 耐压型</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>相机，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; Imager Intense，高速</td><td>LaVision, Dalsa</td><td>Imager Intense</td><td></td></tr><tr><td>显微镜，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG 激光器</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>注射泵，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; Nexus3000</td><td>Chemyx, Inc.</td><td>Nexus-3000</td><td></td></tr><tr><td>柔性管路，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; Tygon</td><td>FisherSci</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>数据处理软件，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; DaVis</td><td>LaVision</td><td>DaVis</td><td></td></tr><tr><td>离心机，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr></tbody></table>

微粒子图像测速法用于微小血流速度分布测量

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

微粒子图像测速技术（μPIV）用于可视化血液流动中示踪微粒的成对图像。通过对图像进行互相关分析，可获得精确的速度分布。本文介绍了一种在微通道中进行血液流动μPIV测量的实验方案。在微循环尺度下，血液不能被视为均质流体，因为它是由悬浮在牛顿流体——血浆中的柔性颗粒组成的悬浮液。通过这些测量，可推导出剪切速率、最大速度、速度分布形状以及流量等关键参数。为了确保获得准确且有用的数据，本文还介绍了若干关键参数，如焦深、示踪粒子浓度和系统顺应性，并提供了不同红细胞压积和流动条件下的示例及代表性结果。

在所有图中，原始图像中的流动方向为从左到右，计算得到的速度分布图中流动方向为从下到上。以下为红细胞压积 H=10 的血液流动时所获得原始数据的示例 10 μl/hr 如图所示 图2原始数据可直接进行互相关分析，无需任何数据预处理，即可获得速度分布曲线。Pitts 对预处理及数据处理方法的影响进行了讨论。 等，（2012b）。基于类似数据得到的速度分布剖面示例 图2 在血细胞比容 H=10 和流速为 10 μl/hr 如图所示 图3，显示了来自水校准的三维轮廓 图4. 图3 和 4 包含标准的数据处理。这些速度分布可用于测量不同流动条件、通道构型和生理状态下的通道中心最大流速、通道内的流量以及壁面处的剪切速率。 图5 展示了红细胞（RBC）聚集前后的一例高速图像。此类高速图像如 图5 也可用于通过互相关计算速度分布。
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微粒图像测速技术（μPIV）用于可视化血流中示踪微粒的成对图像，通过互相关分析获得精确的速度分布。剪切速率、最大流速、速度分布形态及流量等参数均可由这些测量结果推导得出，这些参数均具有临床应用价值。

微粒子图像测速技术（μPIV）用于可视化血流中示踪微粒子的成对图像。通过对这些图像进行互相关分析以……

本实验的总体目标是利用微粒成像液滴定位对称性（microparticle Image LOC symmetry）测量微通道内血液溶液的速度分布。首先，使用微通道中的牛顿流体溶液对系统进行校准，以设定标度、调节图像和时序，并确定通道的中心平面。第二步是将血液溶液引入通道装置，并确保其中无微小气泡。接下来，使用脉冲相机拍摄的图像对或高速相机拍摄的视频，在微通道内选定的平面上成像血流。最后一步是在图像对或视频序列之间进行互相关分析，以获得通道内的位移矢量场。最终，可通过在通道内及测量时间段上对位移矢量场进行平均，得到具有代表性的速度分布剖面。该轮廓可进一步用于分析或计算。此方法可用于解答生物医学和生物流体领域中的关键问题，例如微血管内流速轮廓的形状以及血管壁处的剪切速率。通常，初次使用该方法的用户在使用血液等生物样本以及进行精确测量时会遇到困难。第一步是获得聚甲基倍半硅氧烷或PDMS中的微通道。本实验中的微通道深度约为50微米，宽度约为150微米。将PDMS与液体接触的一面以及其将要键合的玻璃载片置于氧等离子体中处理45秒。然后用力将它们压在一起，以实现永久性结合。本实验使用 freshly collected pore sign blood。制备时，将 0.5 克 EDTA 加入 2 毫升水中。然后将该溶液加入一升温热的全血中，轻轻混匀10次，并在血液达到室温时使其冷却至室温。将50毫升血液样本在3000 RPM下离心10分钟。操作完成后，使用移液器去除血浆。然后缓慢插入移液管以去除血沉棕黄层，避免在去除后重新混入血液中。加入约 20 毫升磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻混匀，重复离心、去除血浆和血沉棕黄层，并再次加入 PBS，共重复两次。最后一次离心后，去除 PBS 及残留的血沉棕黄层。取清洗后的红细胞，用 PBS 或血浆将其悬浮至所需浓度。此处样本的红细胞比例为 10%，即红细胞压积为 10。然后向血液样本中加入 1 微米的荧光示踪颗粒，浓度按每 1 毫升血液加入约 30 微升在此系统中进行。同时，在此步骤中，使用去离子水和荧光微粒配制校准溶液。本实验的数据采用配备脉冲相机的激光成像系统进行采集，并与 Nd:YAG 激光器耦合使用。在采集数据之前，需采取激光操作所需的所有必要安全防护措施。使用尽可能小的注射器（此处为50微升）和最短的管路，将微芯片连接到注射器系统。使用PDMS胶或凡士林将管路与芯片中的注射器密封，以减少液体泄漏和空气进入。注意避免液体可能受到污染。首先使用校准液填充微量注射器以校准系统。首先，用含有荧光微粒的水溶液填充标准注射器。从微量注射器中取出活塞。使用标准注射器将校准溶液注入微通道的输出端。这将导致液体充满微型注射器并从其开口端溢出。持续注入液体，直至微芯片管路或微型注射器中无任何微小气泡为止。为确认无微气泡存在，更换微量注射器的活塞，并使用显微镜检查系统。此处展示了系统中无微气泡时的示例；当系统中无微气泡时，拔下标准注射器，并更换为用于收集流出液的注射器。接着，将装有校准液的微量注射器连接至注射泵，并调平泵体。因此，管道应保持水平。将注射泵设定为所需的流速。将微流控芯片置于倒置显微镜的载物台上。现在校准系统。首先，测量通道中心处的速度分布。同时校准脉冲图像之间的时间间隔。颗粒在帧与帧之间应移动5到10个像素。为获得良好的相关性，需注意在通道中部进行测量。校准完成后，移除微量注射器、活塞和出流注射器，并用纯水冲洗系统。然后使用标准注射器将制备好的血液注入微通道的出口，从而填充系统。持续操作直至在显微镜下确认无微小气泡为止。随后更换微量注射器的活塞。接下来，将含有血液的微量注射器放入注射泵中并调平。保持泵的设置不变。将微流控芯片置于显微镜载物台上，然后启动泵。开始采集数据，以防止红细胞在注射器中沉降，每次运行一到两次后即重新装填。所有数据采集完成后，所得图像如图所示。这是在红细胞浓度为10%、流速为10 µL/h的条件下获得的原始数据。上方的图像是第一帧。下方的图像拍摄于100分之1秒后。这些图像在预处理后会进行背景噪声的去除。通过图像间的互相关分析获得速度场。此图为含有10%红细胞、流速为10微升/小时的系统所测得的速度分布结果示例。注意，纵轴表示速度。通过使用不同的相机和数据采集系统，可以拍摄高速图像。这对于可视化通道中的无细胞层以及定量分析聚集现象非常有用。这些图像中的样本在上方图像中红细胞含量为20%。流速为每小时一微升，血细胞悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中，这会消除其聚集能力。在下方图像中，流速为每小时0.5微升，血细胞悬浮于天然血浆中。在此情况下，可以观察到聚集现象。在进行该操作时，需要牢记：聚焦清晰的图像能够使连续图像对之间的相关性达到最佳。观看本视频后，您应能更好地理解如何将微粒图像测速对称性方法应用于血液微流，尽管血液作为一种工作流体存在固有的困难。

micro-particle-image-velocimetry-for-velocity-profile-measurements

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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