Name: 长期沉默的1S Intersectin的在小鼠肺的特异性siRNA，通过阳离子脂质体重复交货。通过电子显微镜的击倒效果评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: 了解利用阳离子脂质体复合物通过眶后注射在小鼠肺部实现ITSN-1s基因长期沉默的方法。该技术可安全有效地降低靶蛋白表达，用于研究肺部结构与功能。

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本工作获得了美国国立卫生研究院资助 R01HL089462（资助对象：SP）的支持。

1. 阳离子脂质体的制备
<ol>
 <li>将一个洁净的圆底烧瓶进行高压灭菌，用于脂质体的制备。</li>
 <li>配制储备液：
 <ol class="lalpha">
 <li>- 使用小玻璃瓶将 200 mg 的二甲基二十八烷基溴化铵（DOAB）溶解于 10 ml 氯仿中。</li>
 <li>- 使用小玻璃瓶将 200 mg 胆固醇溶解于 10 ml 氯仿中。</li>
 <li>- 在 100 ml 无 RNA/DNA 酶的蒸馏水中配制 5% 葡萄糖溶液，并进行高压灭菌以达到无菌状态。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>用氯仿冲洗圆底烧瓶。向烧瓶中加入 5–10 ml 氯仿，轻轻旋转混匀，静置数分钟。操作过程中始终用铝箔覆盖烧瓶。随后将氯仿倒出。</li>
 <li>脂质体的制备：
 <ol class="lalpha">
 <li>- 向圆底烧瓶中加入 315 μl DOAB 储备液。</li>
 <li>- 向烧瓶中加入 200 μl 胆固醇储备液。</li>
 <li>- 向烧瓶中加入 9.5 ml 氯仿，通过轻轻旋转混匀。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>将旋转蒸发仪设定为 37 °C，转速为每分钟 100 转（rpm）或更高（100–120 rpm）。旋转蒸发仪应连接至带有正确安装吸管的水泵真空控制系统。</li>
 <li>将氩气钢瓶与旋转蒸发仪连接。</li>
 <li>将烧瓶安装到旋转蒸发仪上，并在将其浸入水浴前调整至最佳设置。通过逆时针旋转完全打开第一个氩气阀门。此阀门应始终最先开启和关闭。第二个阀门用于控制吹入烧瓶的氩气压力，压力应始终保持温和。</li>
 <li>将旋转蒸发仪缓慢降至水浴中，使烧瓶底部接触水但不完全浸没，然后启动转速。</li>
 <li>等待直至所有氯仿完全蒸发，约需 10 分钟，然后停止机器运行。</li>
 <li>关闭旋转蒸发仪的转速及氩气钢瓶的阀门。此时应将烧瓶取下。</li>
 <li>向烧瓶中加入 2 ml 5% 葡萄糖溶液以溶解脂质。</li>
 <li>使用 1 ml 移液器吸头彻底刮擦烧瓶底部，使所有脂质充分溶解。刮擦后，如有必要，可用第二个吸头将残留脂质从原吸头转移至烧瓶中。</li>
 <li>将所得溶液置于 42 °C 水浴中孵育，同时缓慢涡旋（15 rpm）烧瓶。</li>
 <li>在超声波清洗槽中加入冷水。将烧瓶提起，使其底部刚好接触水面，对溶液进行超声处理至少 20–30 分钟。</li>
 <li>将烧瓶再次放入旋转蒸发仪的水浴中，在 42 °C 下加热 20 分钟，转速设为零，此次需将圆底完全浸入水中。</li>
 <li>将脂质体溶液依次通过 0.47 微米和 0.22 微米的注射器滤器进行过滤。</li>
 <li>使用小型挤出器，将脂质体通过 50 nm 的膜过滤，以获得均一的单层脂质体囊泡群体。</li>
 <li>将脂质体转移至离心管（Eppendorf 管）中，并置于冰上保存。</li>
</ol>
2. 制备脂质体：siRNA-ITSN-1 复合物
<ol>
 <li>将靶向小鼠的siRNAITSN重悬于含有20 mM HEPES和150 mM氯化钠、pH 7.4的siRNA缓冲液中，终浓度为2 μg/μl。混合前保持冰上放置。</li>
 <li>按8 nmol脂质体:2 μg RNA（或400 nmol脂质体:100 μg siRNAITSN）的比例制备脂质体:siRNAITSN复合物。在本研究中，我们从储存液（50 μM）中取50 μl siRNAITSN，加入到100 μl新制备的脂质体中，使用无RNA/DNA酶的Eppendorf管进行操作。请注意，siRNAITSN的浓度非常关键，因为单次操作最多可对小鼠进行双侧眶后注射150 μl的混合液。</li>
 <li>在等待注射小鼠期间，将混合物保持在冰上。</li>
</ol>
3. 小鼠眶后静脉注射（眼窝内侧角）
所有小鼠实验均经拉什大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循其指南进行。
<ol>
 <li>通过腹腔注射50 mg/kg体重的氯胺酮和5 mg/kg体重的赛拉嗪（市售混合物）对小鼠进行麻醉。根据动物的体重和年龄调整麻醉剂的体积和浓度。本研究使用的是6至8周龄、体重约25克的雄性CD1小鼠。注射器为1 ml结核菌素型带针注射器。</li>
 <li>一手固定小鼠耳朵，将小鼠侧向翻转以暴露眼内侧角。进针位置应位于半月皱襞内侧，避免接触眼球。</li>
 <li>以45度角（三个轴向上）持注射器接近眼睛的泪阜，注射器内含有混合液。</li>
 <li>缓慢注射混合液，并让小鼠在恢复时保持注射侧朝上。若针头插入处形成较大的液滴，应撤回针头，用注射器吸回液滴后再次尝试。重复注射时最好交替使用双眼，以确保充分恢复。如有疑问，可通过注射蓝色染料（50 μl，0.5%结晶紫甲醇溶液）并暴露小鼠肺部观察蓝色血管分布来验证该技术。</li>
 <li>本研究中的小鼠每隔3天注射一次rd 3周内每天给药，无死亡或不良反应发生。</li>
</ol>
4. 小鼠肺灌注及生化研究组织样本采集
<ol start="0">
 <li>将蠕动泵设置为以1.5 ml/min的流速运行。</li>
 <li>准备实验环境：呼吸机、手术台、手术器械、无菌棉签、棉签、细绳、烧杯、蒸馏水、Hank's 平衡盐溶液、示踪剂</li>
 <li>通过腹腔注射麻醉混合物（100 mg/kg体重的氯胺酮和10 mg/kg体重的赛拉嗪）对小鼠进行麻醉。</li>
 <li>在颈部水平，去除唾液腺并暴露气管。</li>
 <li>从开腹手术开始，切除膈肌，接着进行开胸手术，暴露肺和心脏。</li>
 <li>取出胸腺。</li>
 <li>使用光学显微镜以提高准确性，插管肺动脉。</li>
 <li>进行气管造口术，并通过气管造口插管固定小鼠。将呼吸机设置为频率150次/分钟，潮气量150 μl。</li>
 <li>作为出口，打开左心房。</li>
 <li>使用37 °C预热的Hank's溶液和蠕动泵，对小鼠肺血管系统进行5分钟的灌注以清除血液。</li>
 <li>灌注示踪剂（8 nm 金-白蛋白）16以相同的流速再持续 10 分钟。</li>
 <li>用Hank's溶液对肺脏灌注5分钟，以冲洗未结合的示踪剂。</li>
 <li>接着进行 原位 通过灌注含4%（wt/vol）甲醛、2.5%戊二醛和1%单宁酸的0.1 M PIPES缓冲液（pH 7.2）对肺组织进行固定，灌注时间10分钟。</li>
 <li>取出肺组织，去除多余组织，切成3×3 mm的小块，放入含有2 ml固定液混合物的已标记闪烁瓶中。 </li>
</ol>
 
小鼠将在手术过程中处于完全麻醉状态并安乐死。
5. 小鼠肺组织透射电镜样品制备
<ol>
 <li>制备储备液：1% Palade OsO4、醋酸巴比妥（acetate veronal）和 Kellenberger 缓冲液。
 <ol class="lalpha">
 <li>- 1% Palade-OsO4 缓冲液包含：1 ml 醋酸巴比妥储备液、1.25 ml 4% OsO4、1 ml 0.1 N 盐酸和蒸馏水定容至终体积 5 ml。</li>
 <li>- 醋酸巴比妥储备液的制备：将 1.15 g 无水醋酸钠和 2.94 g 巴比妥溶解于 100 ml 蒸馏水中。</li>
 <li>- Kellenberger 溶液包含：2 ml 醋酸巴比妥储备液、2.8 ml 0.1 N 盐酸、0.05 g 醋酸铀酰和 5.1 ml 蒸馏水，pH = 6。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH = 7.4）清洗肺组织块，短暂冲洗 3 次。</li>
 <li>在含有 4%（w/v）甲醛和 2.5% 戊二醛的 0.1 M PIPES 缓冲液（pH 7.2）中，室温固定样本 1 小时。</li>
 <li>在通风橱中，冰上避光条件下，用 1% Palade-锇（Palade-Osmium）后固定 1 小时。</li>
 <li>用 Kellenberger 缓冲液冲洗一次。</li>
 <li>将样本在 Kellenberger 缓冲液中孵育 2 小时至过夜，室温进行。</li>
 <li>用 50% 乙醇冲洗一次。</li>
 <li>用梯度乙醇脱水，每级 5 分钟：70%、95%，然后 100% 乙醇处理两次，每次 15 分钟。</li>
 <li>转入 100% 环氧丙烷，处理两次，每次 15 分钟。</li>
 <li>去除环氧丙烷，加入 50% 环氧丙烷和 50% Epon 812 的混合液，室温旋转孵育过夜。</li>
 <li>次日早晨，移除混合液，加入新鲜 Epon 812，继续在旋转器上处理至少 4–5 小时。</li>
 <li>使用双锥形模具，先加入半满的新鲜 100% Epon 812，然后放入选定的样本并置于边缘位置。</li>
 <li>将模具转移至 60 °C 的培养箱中，固化 48–72 小时。</li>
 <li>聚合完成后，将组织块送至进行超薄切片（厚度 60–70 nm）。</li>
</ol>

<ol><li>Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin-1s+regulates+the+mitochondrial+apoptotic+pathway+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells.</a> J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li>
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<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li>
<li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li>
<li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dap160%2Fintersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li>
<li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基于先前他人发表的研究9 我们1, 18 我们开发了这种用于长期敲低ITSN-1s的方法 体内 通过每隔72小时连续24天重复静脉注射特异性siRNA/脂质体复合物实现。该实验方法高效、安全，可重复使用，并可轻松扩展用于研究编码任何目标蛋白的基因在肺内皮及肺部稳态中的作用。在我们设定的重复给予siRNA/脂质体的实验条件下，小鼠表现正常，无毒性或免疫反应迹象。全身性给予siRNAITSN/liposome 复合物是癌症及其他代谢性疾病最具临床相关性的给药途径。静脉注射的 siRNA/liposome 复合物首先到达肺部毛细血管床，这可能解释了其高效的基因沉默效果ITSN 在肺中。
该研究的一个局限性是阳离子脂质体随时间推移发生的持续聚集2。为克服这一问题，siRNA/脂质体复合物在制备后立即（2小时内）给予，并在使用前始终置于冰上保存。传统阳离子脂质体（如本研究中所使用的）被认为会被网状内皮系统清除。通过脂质体聚乙二醇化（pegylation）可降低吞噬...

裸露的siRNA因带负电荷而无法穿透细胞膜，且易被血液、组织和细胞中的酶降解。即使近年来通过结构修饰提高了其稳定性，给药后siRNA在靶部位的蓄积量仍然极低，因此需要高效的细胞内递送载体。5阳离子脂质体作为一种安全的核酸载体，能够通过包封核酸并保护其免受酶降解，将大片段的DNA/RNA导入细胞6此外，阳离子脂质体可自发与DNA/RNA相互作用，从而促进基因向细胞的转移2近年来，脂质体已被用于递送疫苗和小分子药物7脂质体递送表达 microRNA-7 的质粒克服肺癌细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的耐药性8在靶向血管内皮时，静脉给药至关重要，因为复合物难以穿越内皮屏障并渗出至间质。9与其他器官相比，肺微血管内皮细胞（ECs）对阳离子脂质体及DNA/RNA复合物的摄取能力最强，且能高效内化这些物质，其次为淋巴结和派尔集合淋巴结。9在啮齿类动物模型中，通过眶后静脉或尾静脉注射递送siRNA已被证明是安全的，即使在50 mg/kg等高浓度下亦无明显毒性。10在已发表的文献中，阳离子脂质体的组成各不相同，取决于脂质的配方及其等摩尔比例。11, 12使用阳离子脂质体进行基因递送具有广泛的应用前景 体内，无论是靶向下调/过表达蛋白质，还是递送疫苗或抗肿瘤治疗13-15需要牢记的是，DNA/RNA与细胞膜相互作用的效率受所形成的复合物与膜脂质之间形态耦合的调控。这表明，根据靶向细胞膜的脂质特征调整脂质组成可能具有优势，并可在特定细胞类型中实现较高的转染效率。6.

<table><tbody><tr><td>二甲基二十八烷基溴化铵 (DOAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2779</td><td></td></tr><tr><td>脂质体挤出仪稳定器（小型挤出装置）</td><td>Avestin Inc.</td><td>LF-STB</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜，直径 19 mm，孔径 50 nm</td><td>Avestin Inc.</td><td>LFM-50</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4432-04</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td></td></tr><tr><td>圆底烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>FHB-275-030X</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 siRNA&lt;sub&gt;ITSN&lt;/sub&gt; - on target </td><td>Dharmacon/ThermoScientific</td><td>J-046912-11</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Ismatec</td><td>REGLO-CDF 数字型，配备 RHOO 泵头</td><td></td></tr><tr><td>呼吸机</td><td>Hugo Sachs Electronik</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>巴比妥酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0500</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>EM Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Epon812</td><td>EM Sciences</td><td>制造商已停产</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙烷</td><td>EM Sciences</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具</td><td>EM Sciences</td><td>69923-05</td><td></td></tr><tr><td>单宁酸</td><td>EM Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>8 nm 金-白蛋白示踪剂</td><td></td><td>实验室自制，方法见文献16</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">配备两个 Avestin 1 ml 气密性注射器（货号：LF-1）</td></tr><tr><td colspan="4">Pyrex，100 ml</td></tr><tr><td colspan="4">修饰型 siRNA，&lt;em&gt;体内&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">IDEX 公司旗下产品</td></tr><tr><td colspan="4">德国马尔奇，D-79232</td></tr><tr><td colspan="4">已替换为 Embed812，货号：14120</td></tr></tbody></table>

通过阳离子脂质体重复递送特异性sirna实现小鼠肺组织中intersectin-1s的长期沉默。利用电子显微镜评估基因敲低效果

关键词：intersectin-1s，sirna，阳离子脂质体，肺组织，基因沉默，电子显微镜，基因敲低

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

先前的研究表明，ITSN-1s 的敲低（KD）ITSN），一种参与调控肺血管通透性和内皮细胞（ECs）存活的内吞蛋白，其长期抑制会诱导细胞凋亡，这是建立长期抑制ITSN-1s的细胞培养系统的主要障碍1使用阳离子脂质体作为载体，我们通过系统性给予靶向ITSN-1基因的siRNA（siRNA），探索了在小鼠肺组织中沉默ITSN-1s基因的效果。ITSN阳离子脂质体在siRNA递送方面具有多种优势：重复给药安全性高、无免疫原性、无毒性且易于生产2脂质体的性能和生物活性取决于其粒径、电荷、脂质组成、稳定性、剂量以及给药途径3此处，高效且特异的KDITSN 通过胆固醇与二甲基二辛十八烷基溴化铵组合，已在小鼠肺组织中实现siRNA的静脉递送。ITSN/阳离子脂质体复合物在第3天短暂敲低了小鼠肺组织中的ITSN-1s蛋白和mRNA水平，随后3天内恢复。利用阳离子脂质体作为可重复使用的安全载体，研究延长至24天。因此，每隔3天通过眶后途径给予新制备的复合物，实现持续性基因敲低ITSN 在整个研究过程中4. 在siRNA处理后多个时间点采集的小鼠组织ITSN 进行透射电子显微镜（EM）分析，以评估长期生酮饮食（KD）的影响ITSN，在肺血管内皮中。高分辨率电镜成像使我们能够评估KDITSN在肺血管床中引起的形态学改变（即 内皮屏障破坏、小窝数量减少以及替代性转运途径的上调），这些特征无法通过光学显微镜检测到。总体而言，这些发现确立了ITSN-1s在内皮细胞功能及肺组织稳态中的重要作用，同时展示了siRNA-脂质体递送系统的有效性 体内.

在siRNA处理后的多个时间点监测了 ITSN-1s 蛋白和 mRNA 水平ITSN 通过Western印迹、常规PCR和定量PCR进行检测，方法如前所述4siRNA 中 ITSN-1s 蛋白和 mRNA 水平ITSN-与对照组相比，在持续敲低ITSN-1s 21天后，处理组小鼠肺组织中的相关指标降低了约75%。在缺失ITSN-1s的情况下，dynamin-2（ITSN-1s的主要相互作用蛋白，且为小窝从质膜上脱离所必需的关键因子）无法被有效募集至内吞位点，从而导致小窝从质膜脱离以及游离囊泡载体形成的过程受到破坏1, 17因此，膜裂变无效及游离囊泡载体形成受损导致内吞作用缺陷和跨内皮转运障碍，内皮间屏障破坏以及肺水肿。图1）。此外，ITSN-1s的下调会激活替代性转运途径，以补偿内吞作用的缺陷。我们观察到膜性环状结构（图2A 和 2a1），多形性小管（图2B），以及扩大的内体与典型的胞膜凹陷小窝融合（...

在小鼠中每72小时重复进行眶后静脉注射阳离子脂质体/siRNA/ITSN-1s复合物，持续24天，可高效将siRNA双链递送至小鼠肺微血管系统，使ITSN-1s的mRNA和蛋白表达水平降低75%。该技术在动物模型中具有高度可重复性，无不良反应，且不会导致动物死亡。

通过阳离子脂质体重复递送特异性siRNA实现小鼠肺组织中Intersectin-1s的长期沉默。利用电子显微镜评估基因敲低效果

关键词：Intersectin-1s，siRNA，阳离子脂质体，肺组织，基因沉默，电子显微镜，基因敲低

先前的研究表明，敲低内吞蛋白ITSN-1s（KDITSN），该蛋白参与调控肺血管通透性和内皮细胞……

以下实验的总体目标是评估长期抑制小鼠肺组织中 intersectin 1s 表达对肺结构与功能的影响。该目标通过以下步骤实现：首先制备特异性的 INA 双链脂质体复合物，以靶向小鼠肺血管系统；第二步，通过眶后注射递送 INA 脂质体复合物，并且每 72 小时重复一次，连续进行 24 天，以实现对 intersectin 1s 表达的有效抑制。随后采集注射小鼠的肺组织，用于生化分析和电镜观察，以评估 intersectin 1 蛋白和 mRNA 水平的变化，并对肺组织进行广泛的形态学分析。通过使用特异性 intersectin 1 抗体对肺组织裂解液进行 Western blot 检测，以及 Q-R-T-P-C-R 分析，结果显示在连续 24 天内实现了特异且高效的 intersectin 1 沉默。该技术相较于现有方法（如病毒或慢病毒）的主要优势在于，离子型脂质体在肺部递送方面具有可重复性高、安全、无毒且对肺血管内皮细胞高效的特点。我们最初萌生这一方法的想法，是在决定评估体内 N 下调的交叉效应，而其他小RNA递送方法均未奏效之时。制备阳离子脂质体时，先将315 µL二甲基二硬脂酰基溴化铵（DOAB）储备液加入圆底烧瓶中，随后加入200 µL胆固醇储备液和9.5 mL氯仿，轻轻涡旋混匀。将烧瓶连接至旋转蒸发仪，设置温度为37°C，转速为100转/分钟或更高。通过顺时针旋转完全打开第一个氩气阀门。每次操作都必须先打开和关闭此阀门。第二个阀门用于控制通入烧瓶的氩气压力。将其部分打开以确保压力温和。一旦干冰开始从连接阿贡气罐与旋转蒸发仪的管路中滴下，将旋转蒸发仪缓慢放入水浴中，直至烧瓶接触水面但未完全浸没。将转速调节至100至120转/分钟。当烧瓶中的氯仿完全蒸发后，停止仪器运行。将旋转蒸发仪的转速调至零，并关闭氩气罐阀门。取下烧瓶，向其中加入2毫升5%葡萄糖溶液以重新悬浮脂质。使用1 mL移液器吸头彻底刮擦烧瓶底部，以充分溶解所有脂质。将所得溶液置于42摄氏度水浴中孵育1小时，同时缓慢涡旋振荡烧瓶。将烧瓶竖直持握，使底部刚好接触超声破碎仪中的冷水，对溶液进行超声处理至少20至30分钟。接着，将烧瓶置于旋转蒸发仪的水浴中，在42摄氏度下加热20分钟，转速为零，确保圆底部分完全浸入水中。通过0.47微米的注射器滤器过滤脂质体，随后再通过0.22微米的注射器滤器过滤。使用小型挤出器，将脂质体通过50纳米的膜过滤，以制备均一的单层脂质体囊泡群体。将脂质体转移至离心管中，置于冰上。按照每八摩尔脂质体配比两微克 RNA 的比例制备脂质体-ITSN 复合物。在此示例中，使用 50 微升 I-A-I-T-S-N。从50微摩尔的储备液中取适量，加入100微升新制备的脂质体中，使用不含A-R-N-A-D-N-A的EOR管操作。将混合物置于冰上，直至注射至小鼠体内。本研究所使用的小鼠年龄约为4至6周，体重约25克。注射前通过捏压脚趾确认动物已完全麻醉。使用的一毫升结核菌素注射器需单手将针头连接固定。抓住小鼠耳朵，将其侧向翻转以暴露眼内侧角度。对准PIKA半月板内侧，避免接触眼球。将装有混合物的注射器以三个轴向均为45度的角度接近眼部泪囊。缓慢注射混合物，然后将小鼠放回笼中，使其在注射侧朝上的情况下恢复。向上。每72小时对小鼠进行一次靶向ITSN1基因的SIR NA处理，持续24天。开始此操作前，通过检查小鼠是否缺乏回缩反射来确认其已完全麻醉。首先进行剖腹手术并切除膈肌。然后进行开胸手术，暴露肺和心脏。使用 StereoZoom 显微镜以提高准确性，摘除胸腺。插管肺动脉。接下来，进行气管切开术，并通过气管造口插管小鼠。将呼吸机设置为每分钟150次呼吸，潮气量为150 µL。使用蠕动泵以每分钟1.5 mL的速度并用预热至37°C的Hank's溶液作为流出通道，打开左心房。用无血的缓冲液灌注小鼠肺血管系统5分钟，随后用示踪剂灌注10分钟。冲洗未结合的示踪剂后，通过灌注4%甲醛、2.5%戊二醛和1%单宁酸溶液10分钟，对肺组织进行原位固定。取出肺组织并去除多余组织。将肺组织切成小块，转移至含有两毫升固定剂混合液的已标记闪烁瓶中。为开始进行肺组织的透射电子显微镜样品制备，首先用0.1摩尔的磷酸钠缓冲液短暂清洗肺组织块三次。接下来，将样品在室温下用含4%甲醛和2.5%戊二醛的0.1 M Pipes缓冲液固定1小时，然后在冰上、避光条件下，在通风橱中用1%四氧化锇后固定1小时。用Karnovsky缓冲液冲洗一次后，将样品在Karnovsky缓冲液中于室温孵育2小时至过夜。用50%乙醇冲洗一次，随后用梯度浓度的乙醇进行脱水。70%乙醇中孵育5分钟，95%乙醇中孵育5分钟，然后在100%乙醇中孵育两次，每次15分钟。随后转移至100%丙酮中，进行两次孵育，每次15分钟。去除环氧丙烷，加入50%环氧丙烷与50%环氧树脂的混合液。在室温下于旋转轮上孵育过夜。次日早晨，移除混合液，加入新鲜环氧树脂，在旋转轮上继续孵育至少4至5小时。将选定的样本加入已装入半量新鲜100%Epon 812的双锥形模具中，置于模具边缘，随后将模具移至60°C的培养箱中，使其固化48至72小时。通过连续21天重复递送ITSN1s siRNA-脂质体复合物，对ITSN1s表达进行慢性抑制，可导致小鼠肺组织中ITSN1蛋白水平显著降低，如以下代表性结果所示：在siRNA递送后的多个时间点，分别对未处理对照组和处理组小鼠的肺组织裂解液进行免疫印迹分析，使用抗ITSN1和抗肌动蛋白（actin）抗体进行杂交检测。代表性高印迹CL膜的密度分析及ITSN1s mRNA的定量R-T-P-C-R结果进一步证实，使用ITSN1s siRNA-脂质体复合物处理可有效下调小鼠肺组织中ITSN1s蛋白的表达。intersectin 1水平的降低导致内吞作用缺陷、内皮细胞间屏障的内皮转运中断以及肺水肿。这些代表性的肺组织电镜图像显示，内皮细胞间连接（IJs）处于开放状态，并在整个连接长度上被8纳米金标记的白蛋白颗粒标记。图A1是图A的放大图像，箭头指示在同一平面上彼此靠近的三到四个金标记白蛋白颗粒，提示IEJ的广泛开放。金颗粒还与图A1和图B中箭头所示的IJs的远腔侧出口相关。另请注意，图A中标星号处显示了CVE A的数量有限以及毛细血管周围间隙的扩张，提示intersectin-1表达的急性下调，从而上调了替代性转运通路以补偿内吞作用的不足。这些电镜图像显示，A 和 A' 图中可见膜性环状结构，B 图中为多形性小管，C 图中为与典型 cve LA 融合的扩大内体，积极参与金标记白蛋白的摄取与转运。此外还观察到血管周围间隙的严重扩张以及蛋白性水肿。持续抑制 intersectin-1 表达 24 天后，可通过部分恢复肺内皮细胞间屏障完整性，减轻小鼠的肺水肿。电镜形态学研究表明，在此时间点，八纳米金标记的白蛋白示踪剂无法穿透内皮-上皮连接处（IEJ），而是积聚在连接处管腔入口处，形成滤过残留物，如箭头所示。然而，血管周围间隙（PVS）出现一定程度的扩张和轻度水肿，提示该连接处对这种尺寸的颗粒具有屏障作用，但仍存在一定的通透性。在靠近细胞膜的多泡体（MVB）中，部分内部小囊泡被八纳米金标记的白蛋白颗粒所标记。此表格显示了对照组与缺陷型小鼠肺内皮细胞中胞吞跨细胞结构的数量。一个重要的发现是，在ITSN1缺陷型小鼠肺血管内皮中，caveolae（小窝）的数量显著减少。长期抑制intersectin 1（ITSN1）的表达可导致替代性内吞细胞通路的激活，并部分恢复由胶体金标记的白蛋白颗粒所显示的膜环状或管状结构的数量。与对照组相比，ITSN1慢性缺陷型小鼠肺血管内皮中的caveolae数量也增加了14倍。通过该实验步骤，还可采用其他方法，例如利用Eliza法检测小鼠肺组织裂解液，以定量评估不同亲水性示踪剂的跨内皮转运情况。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将阳离子脂质体与小干扰RNA（SRNA）的复合物特异性递送至小鼠肺血管内皮，从而敲低目标蛋白并评估其功能。

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