通过阳离子脂质体重复递送特异性siRNA实现小鼠肺组织中Intersectin-1s的长期沉默。利用电子显微镜评估基因敲低效果 关键词：Intersectin-1s，siRNA，阳离子脂质体，肺组织，基因沉默，电子显微镜，基因敲低

以下实验的总体目标是评估长期抑制小鼠肺组织中 intersectin 1s 表达对肺结构与功能的影响。该目标通过以下步骤实现：首先制备特异性的 INA 双链脂质体复合物，以靶向小鼠肺血管系统；第二步，通过眶后注射递送 INA 脂质体复合物，并且每 72 小时重复一次，连续进行 24 天，以实现对 intersectin 1s 表达的有效抑制。

随后采集注射小鼠的肺组织，用于生化分析和电镜观察，以评估 intersectin 1 蛋白和 mRNA 水平的变化，并对肺组织进行广泛的形态学分析。通过使用特异性 intersectin 1 抗体对肺组织裂解液进行 Western blot 检测，以及 Q-R-T-P-C-R 分析，结果显示在连续 24 天内实现了特异且高效的 intersectin 1 沉默。该技术相较于现有方法（如病毒或慢病毒）的主要优势在于，离子型脂质体在肺部递送方面具有可重复性高、安全、无毒且对肺血管内皮细胞高效的特点。

我们最初萌生这一方法的想法，是在决定评估体内 N 下调的交叉效应，而其他小RNA递送方法均未奏效之时。制备阳离子脂质体时，先将315 µL二甲基二硬脂酰基溴化铵（DOAB）储备液加入圆底烧瓶中，随后加入200 µL胆固醇储备液和9.5 mL氯仿，轻轻涡旋混匀。将烧瓶连接至旋转蒸发仪，设置温度为37°C，转速为100转/分钟或更高。

通过顺时针旋转完全打开第一个氩气阀门。每次操作都必须先打开和关闭此阀门。第二个阀门用于控制通入烧瓶的氩气压力。

将其部分打开以确保压力温和。一旦干冰开始从连接阿贡气罐与旋转蒸发仪的管路中滴下，将旋转蒸发仪缓慢放入水浴中，直至烧瓶接触水面但未完全浸没。将转速调节至100至120转/分钟。当烧瓶中的氯仿完全蒸发后，停止仪器运行。

将旋转蒸发仪的转速调至零，并关闭氩气罐阀门。取下烧瓶，向其中加入2毫升5%葡萄糖溶液以重新悬浮脂质。

使用1 mL移液器吸头彻底刮擦烧瓶底部，以充分溶解所有脂质。将所得溶液置于42摄氏度水浴中孵育1小时，同时缓慢涡旋振荡烧瓶。将烧瓶竖直持握，使底部刚好接触超声破碎仪中的冷水，对溶液进行超声处理至少20至30分钟。

接着，将烧瓶置于旋转蒸发仪的水浴中，在42摄氏度下加热20分钟，转速为零，确保圆底部分完全浸入水中。通过0.47微米的注射器滤器过滤脂质体，随后再通过0.22微米的注射器滤器过滤。使用小型挤出器，将脂质体通过50纳米的膜过滤，以制备均一的单层脂质体囊泡群体。

将脂质体转移至离心管中，置于冰上。按照每八摩尔脂质体配比两微克 RNA 的比例制备脂质体-ITSN 复合物。在此示例中，使用 50 微升 I-A-I-T-S-N。

从50微摩尔的储备液中取适量，加入100微升新制备的脂质体中，使用不含A-R-N-A-D-N-A的EOR管操作。将混合物置于冰上，直至注射至小鼠体内。本研究所使用的小鼠年龄约为4至6周，体重约25克。

注射前通过捏压脚趾确认动物已完全麻醉。使用的一毫升结核菌素注射器需单手将针头连接固定。抓住小鼠耳朵，将其侧向翻转以暴露眼内侧角度。

对准PIKA半月板内侧，避免接触眼球。将装有混合物的注射器以三个轴向均为45度的角度接近眼部泪囊。缓慢注射混合物，然后将小鼠放回笼中，使其在注射侧朝上的情况下恢复。

向上。每72小时对小鼠进行一次靶向ITSN1基因的SIR NA处理，持续24天。开始此操作前，通过检查小鼠是否缺乏回缩反射来确认其已完全麻醉。首先进行剖腹手术并切除膈肌。

然后进行开胸手术，暴露肺和心脏。使用 StereoZoom 显微镜以提高准确性，摘除胸腺。插管肺动脉。

接下来，进行气管切开术，并通过气管造口插管小鼠。将呼吸机设置为每分钟150次呼吸，潮气量为150 µL。使用蠕动泵以每分钟1.5 mL的速度并用预热至37°C的Hank's溶液作为流出通道，打开左心房。

用无血的缓冲液灌注小鼠肺血管系统5分钟，随后用示踪剂灌注10分钟。冲洗未结合的示踪剂后，通过灌注4%甲醛、2.5%戊二醛和1%单宁酸溶液10分钟，对肺组织进行原位固定。取出肺组织并去除多余组织。

将肺组织切成小块，转移至含有两毫升固定剂混合液的已标记闪烁瓶中。为开始进行肺组织的透射电子显微镜样品制备，首先用0.1摩尔的磷酸钠缓冲液短暂清洗肺组织块三次。

接下来，将样品在室温下用含4%甲醛和2.5%戊二醛的0.1 M Pipes缓冲液固定1小时，然后在冰上、避光条件下，在通风橱中用1%四氧化锇后固定1小时。用Karnovsky缓冲液冲洗一次后，将样品在Karnovsky缓冲液中于室温孵育2小时至过夜。用50%乙醇冲洗一次，随后用梯度浓度的乙醇进行脱水。

70%乙醇中孵育5分钟，95%乙醇中孵育5分钟，然后在100%乙醇中孵育两次，每次15分钟。随后转移至100%丙酮中，进行两次孵育，每次15分钟。

去除环氧丙烷，加入50%环氧丙烷与50%环氧树脂的混合液。在室温下于旋转轮上孵育过夜。次日早晨，移除混合液，加入新鲜环氧树脂，在旋转轮上继续孵育至少4至5小时。

将选定的样本加入已装入半量新鲜100%Epon 812的双锥形模具中，置于模具边缘，随后将模具移至60°C的培养箱中，使其固化48至72小时。通过连续21天重复递送ITSN1s siRNA-脂质体复合物，对ITSN1s表达进行慢性抑制，可导致小鼠肺组织中ITSN1蛋白水平显著降低，如以下代表性结果所示：在siRNA递送后的多个时间点，分别对未处理对照组和处理组小鼠的肺组织裂解液进行免疫印迹分析，使用抗ITSN1和抗肌动蛋白（actin）抗体进行杂交检测。

代表性高印迹CL膜的密度分析及ITSN1s mRNA的定量R-T-P-C-R结果进一步证实，使用ITSN1s siRNA-脂质体复合物处理可有效下调小鼠肺组织中ITSN1s蛋白的表达。intersectin 1水平的降低导致内吞作用缺陷、内皮细胞间屏障的内皮转运中断以及肺水肿。这些代表性的肺组织电镜图像显示，内皮细胞间连接（IJs）处于开放状态，并在整个连接长度上被8纳米金标记的白蛋白颗粒标记。

图A1是图A的放大图像，箭头指示在同一平面上彼此靠近的三到四个金标记白蛋白颗粒，提示IEJ的广泛开放。金颗粒还与图A1和图B中箭头所示的IJs的远腔侧出口相关。另请注意，图A中标星号处显示了CVE A的数量有限以及毛细血管周围间隙的扩张，提示intersectin-1表达的急性下调，从而上调了替代性转运通路以补偿内吞作用的不足。

这些电镜图像显示，A 和 A' 图中可见膜性环状结构，B 图中为多形性小管，C 图中为与典型 cve LA 融合的扩大内体，积极参与金标记白蛋白的摄取与转运。此外还观察到血管周围间隙的严重扩张以及蛋白性水肿。持续抑制 intersectin-1 表达 24 天后，可通过部分恢复肺内皮细胞间屏障完整性，减轻小鼠的肺水肿。

电镜形态学研究表明，在此时间点，八纳米金标记的白蛋白示踪剂无法穿透内皮-上皮连接处（IEJ），而是积聚在连接处管腔入口处，形成滤过残留物，如箭头所示。然而，血管周围间隙（PVS）出现一定程度的扩张和轻度水肿，提示该连接处对这种尺寸的颗粒具有屏障作用，但仍存在一定的通透性。在靠近细胞膜的多泡体（MVB）中，部分内部小囊泡被八纳米金标记的白蛋白颗粒所标记。此表格显示了对照组与缺陷型小鼠肺内皮细胞中胞吞跨细胞结构的数量。

一个重要的发现是，在ITSN1缺陷型小鼠肺血管内皮中，caveolae（小窝）的数量显著减少。长期抑制intersectin 1（ITSN1）的表达可导致替代性内吞细胞通路的激活，并部分恢复由胶体金标记的白蛋白颗粒所显示的膜环状或管状结构的数量。与对照组相比，ITSN1慢性缺陷型小鼠肺血管内皮中的caveolae数量也增加了14倍。

通过该实验步骤，还可采用其他方法，例如利用Eliza法检测小鼠肺组织裂解液，以定量评估不同亲水性示踪剂的跨内皮转运情况。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将阳离子脂质体与小干扰RNA（SRNA）的复合物特异性递送至小鼠肺血管内皮，从而敲低目标蛋白并评估其功能。