从人类多能干细胞诱导端脑谷氨酸能神经元的特化

本实验的总体目标是通过模拟人类发育过程中所经历的各个检查点，将人胚胎干细胞（HESCs）诱导分化为头面部神经元。该过程首先使HESCs在HESC培养基中悬浮培养，自发分化；随后将其转移至神经诱导培养基中，以实现更特异性的分化。接着，将胚胎样体或PSC细胞聚集体接种至经组织培养处理的培养板上，使其贴壁，细胞随之扩展并分化形成单层结构。

这些中心形成的神经上皮细胞在形态学上与千米细胞相似。接下来，分离神经上皮细胞并将其置于悬浮培养中，使其形成神经球。最后，将神经球接种到盖玻片上，使其进一步分化。

最终，可以通过免疫染色或电生理学方法获得结果，以显示由多能干细胞分化而来的特定类型神经元。该技术的应用意义广泛，可延伸至多种遗传性疾病的研究，因为还可利用患者特异性的诱导多能干细胞生成神经元，从而阐明其作用机制及潜在治疗方法。尽管该方法能够为研究多能干细胞向端脑神经亚型的分化过程提供重要见解。

该方法也可应用于其他系统，例如与头颅爪状神经元相关的人类疾病。要生成人多能干细胞聚集体，首先将人多能干细胞在添加了基础 FGF 的 HESC 培养基中，于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养 5 至 7 天，此时细胞集落会变大但仍保持未分化状态。当集落达到适当阶段时，在 50 毫升离心管中，根据文本方案，用 D-M-E-M-F12 培养基配制浓度为 1 毫克/毫升的 dis bays 溶液。

吸去细胞中的培养基，然后用 D-M-E-M-F 12 洗涤一次。去除洗涤液后，每孔加入一毫升 dis bays，在 37 摄氏度孵育三至五分钟。在三分钟时，于显微镜下观察细胞卷曲且颜色略深的边缘。

如有必要，可延长细胞孵育时间。当细胞状态合适时，移除dase溶液，用D-M-E-M-F 12洗涤细胞一次，随后更换为1.5毫升HESC培养基以使细胞脱落并分散。将10毫升玻璃移液管的管尖置于孔板底部右侧壁附近的细胞表面，轻轻上下移动，并横向跨越孔板至另一侧，然后沿相反方向返回。

待所有细胞均悬浮后，将其转移至15毫升离心管中，在200 ×g条件下离心2分钟，随后弃去沉淀中的上清液。使用HESC培养基将细胞转移至培养瓶中进行培养。例如，若细胞来自六个孔的HSCs，则使用一个T75培养瓶，并加入50毫升HESC.Medium。

将细胞在37摄氏度下孵育12小时。接下来，为去除细胞碎片，将细胞和培养基转移至50毫升离心管中，洗涤细胞一次，然后加入50毫升新鲜培养基，转移至新的培养瓶中。以这种方式继续培养细胞，直至第5天。

第五天，离心收集细胞并将其转移至新的 T75 培养瓶中。加入 50 毫升神经诱导培养基（NIM），培养 2 至 3 天，每天更换一半的 NIM。在接种细胞时，使用层粘连蛋白（laminin）或胎牛血清（FBS）以促进细胞贴壁。若使用 FBS，每孔加入含细胞的 1.5 毫升培养基。

轻轻摇晃培养板以分散细胞团块，并在37摄氏度下过夜培养，使细胞贴壁。次日在37摄氏度条件下，每孔更换为2毫升NIM培养基。经过一至两天的孵育后，每个细胞团块将铺展形成单层细胞，数天内，其中大部分细胞的中心区域在形态上将类似于柱状细胞。

大约第14至17天，柱状细胞会显得更加致密。有时细胞会形成具有可见管腔的脊状或环状结构。在分离细胞之前，应检查是否存在非EU上皮细胞，并使用移液器吸头将其刮除。

为了分离位于集落中心的神经上皮细胞，使用微量移液器和一支无菌的一毫升带滤芯移液枪头，向集落中心施加压力，使其脱离。注意不要让集落的外围部分同时脱落。

将两块培养皿的分离细胞转移至15毫升离心管中，在200 ×g条件下离心2分钟。去除培养基后，将细胞转移至未经组织培养处理的T25培养瓶中，加入10毫升NIM培养基。加入B27后，于次日继续培养过夜，此时细胞应呈现类似球状的形态。

有时外周细胞也会被分离出来，它们通常会贴附在培养瓶底部。如果发生这种情况，应将球形细胞转移至新的培养瓶中，留下已贴壁的细胞。将神经球悬浮于NIMB 27培养基中培养一周，以促进细胞的存活与增殖。

加入环状AMP和类胰岛素生长因子1。一周结束时，神经球将包含头颅部祖细胞，可准备接种到盖玻片上进行终末分化。为在24孔板中制备聚氨酯层粘连蛋白包被的盖玻片，首先用每毫升0.1毫克的聚氨酯溶液在37摄氏度下过夜孵育洁净的盖玻片，随后在神经分化条件下，用50微升每毫升20微克的层粘连蛋白溶液包被盖玻片。

将培养基加入每个经聚氨酯处理的盖玻片上，注意仅让液体接触盖玻片本身。在37摄氏度下孵育1至2小时。

在层粘连蛋白孵育后，用D-M-E-M-F 12收集并洗涤神经球。如果细胞过大而无法正常贴壁，加入约2毫升Accutase，在37摄氏度孵育3分钟。接着，加入等体积的胰蛋白酶抑制剂，将细胞在200 ×g离心3分钟，弃去上清液，替换为NDM，并使用P200移液器吹打细胞以形成较小的细胞团簇。

将它们置于预先包被的盖玻片上，吸除大部分培养基，并用少量培养基将细胞转移至六厘米的培养皿中，以便在不移除盖玻片上预先包被的层粘连蛋白的情况下更方便地进行挑选。每个培养皿中转移约四到五个神经球。让神经球贴壁至少两到四小时，然后加入0.5毫升添加了B27循环成分的神经分化培养基。

每隔一天更换一半的培养基，并添加微珠（MP）和神经营养因子。细胞可维持培养数月，如此处所示。本方案描述了如何通过多个关键步骤将人多能干细胞（PSCs）分化为端脑谷氨酸能神经元。

PSC 聚集体的形成包括神经上皮细胞的诱导、头端喙部祖细胞的生成，以及这些祖细胞向头端喙部神经元的终末分化。该系统在生成头端祖细胞和谷氨酸能神经元等方面具有高效性和稳健性。在未添加诱导因子的情况下，造血干细胞分化为神经谱系，并在分化后第24天完成该过程。

大多数神经前体细胞对Fox G1呈阳性，Fox G1是一种由头区表达的转录因子，但对HOKs B4呈阴性，HOKs B4是后脑和脊髓细胞的标志物，这表明前脑头区前体细胞已成功生成。这些前脑头区前体细胞具有背侧表型，表现为表达PAX6（背侧前体细胞的标志物），但不表达NKX2.1（腹侧前体细胞的标志物）。

经过进一步分化后，这些头端背侧前体细胞分化为谷氨酸能神经元，且对谷氨酸能标记物呈阳性。持续表达TBR1的神经元也对神经元标记物βIII微管蛋白或MAP2呈阳性。这些细胞还表达囊泡型谷氨酸转运体1（VGLUT1），即成熟谷氨酸能神经元的标记物，表明在培养体系中高效生成了头端谷氨酸能神经元。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如电生理学技术）来回答更多问题，例如这些神经元是否能够与其他细胞形成突触连接。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过若干关键步骤，将人多能干细胞定向分化为头面部谷氨酸能神经元。

多能干细胞聚集体的形成、神经上皮细胞的诱导、头面部前体细胞的产生，以及这些前体细胞向头面部神经元的终末分化。