Name: 从人类多能干细胞的规范在前脑谷氨酸能神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学习利用人类胚胎干细胞通过自发分化、神经诱导和终末成熟等关键步骤生成前脑谷氨酸能神经元的方法。该技术模拟发育检查点，为神经生物学和再生医学研究提供可靠的神经元分化模型。

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作者感谢 Y. Sasai 博士慷慨提供 FOXG1 抗体。本工作得到康涅狄格州干细胞研究基金（08-SCB-UCHC-022 和 11-SCB24）以及痉挛性截瘫基金会的资助。

1. 人类多能干细胞聚集体的生成（D1-D4）
<ol>
	<li>人类多能干细胞在含有基础成纤维细胞生长因子（bFGF，4 ng/ml）的hESC培养基中，于小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上进行培养。培养5-7天后，当细胞集落变大但仍保持未分化状态时，即可进行下一步操作。</li>
	<li>首先应配制酶溶液。在50 ml离心管中，将dispase（或胶原酶）溶解于DMEM/F12培养基中，使其终浓度为1 mg/ml。由于该溶液在加热后更易混匀，将含有培养基和酶的离心管置于37 °C水浴中10-15分钟，随后使用Steriflip滤器进行灭菌。</li>
	<li>吸除细胞上的培养基，用DMEM/F12培养基轻轻冲洗一次，再吸除。每孔加入1 ml dispase，将培养板放入培养箱中孵育3-5分钟（iPSC可延长至10分钟）。在显微镜下观察细胞，当集落边缘略微卷起或颜色稍变深时，表明细胞已准备就绪。建议在3分钟后开始检查细胞，必要时可继续孵育。首次使用本方案时，建议每次仅处理一块培养板，因为必须尽快将细胞从dispase中移出。</li>
	<li>吸除dispase溶液。每孔轻轻加入1.5 ml DMEM/F12培养基（此阶段细胞非常脆弱，容易从培养板上脱落），以充分洗去残留的dispase，随后吸除DMEM/F12。每孔再加入1.5 ml hESC培养基。</li>
	<li>为使细胞脱离并分散成团块，将10 ml玻璃移液管的管口置于孔板右下角（接触细胞表面），上下（垂直方向）移动移液管——上提动作应紧邻下压动作的路径。到达孔的另一侧后，再沿水平方向重复此操作。</li>
	<li>待所有细胞均悬浮后，将其转移至15 ml离心管中，在200 × g条件下离心2分钟，管底应形成细胞沉淀。小心吸除沉淀上方的培养基。</li>
	<li>用于维持细胞聚集体的细胞培养瓶规格取决于初始细胞数量。对于6孔（1块板）的hESC，应使用一个未经组织培养处理的T75培养瓶，并加入50 ml hESC培养基。将第1.6步获得的细胞转移至该培养瓶中，于37 °C培养。</li>
	<li>为去除细胞碎片，约12小时后应更换培养基和培养瓶。操作方法如下：将全部培养基和细胞转移至50 ml离心管中，以200 × g离心2分钟，吸除旧培养基。向细胞沉淀中加入50 ml新鲜hESC培养基，转移至新的T75培养瓶中。此后可每日按此方法换液（直至第5天）。</li>
</ol>
2. 神经上皮细胞的诱导（D5-D17）
<ol>
	<li>将细胞/培养基转移至50 ml离心管中，在200 × g条件下离心2分钟。随后吸除上清液，将细胞转移至新的（非组织培养处理的）T75培养瓶中，加入50 ml神经诱导培养基（NIM）。</li>
	<li>细胞进入NIM后，应每隔一天更换一半培养基。数天后，细胞聚集体应已足够大，可在几分钟内自行沉降至50 ml锥形离心管底部（无需离心）。在NIM中培养2–3天后（总计D7–D8），细胞即可准备铺板。可使用层粘连蛋白或胎牛血清（FBS）促进细胞贴附于培养板上。</li>
	<li>所需组织培养处理的6孔板数量取决于细胞密度，每个聚集体应能在培养板上继续生长数天而不与其他聚集体接触。通常情况下，一个T75培养瓶的细胞可获得约4–6块6孔板的细胞量。</li>
	<li>
	<ol class="ualpha">
		<li>若使用层粘连蛋白，将其用NIM稀释至10–20 μg/ml，用于包被6孔板（约0.5 ml/孔）。包被2–3小时后，将细胞聚集体接种至6孔板中（每孔约20–30个聚集体）。待聚集体贴附后，加入1.5 ml NIM。</li>
		<li>若使用FBS，配制含90% NIM和10% FBS的混合液（1.5 ml/孔）。将含细胞的培养基1.5 ml加入各孔，轻轻前后摇动培养板使聚集体分散，然后置于培养箱中过夜（O/N）使细胞贴附。次日早晨务必更换培养基（每孔2 ml NIM），以去除FBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>铺板后一至两天内，每个聚集体将铺展形成单层细胞。数天内，大多数细胞的中心区域在形态上将呈现类似柱状细胞（细长形）的特征。在此期间，应每隔一天更换一次NIM。某些PSC系（尤其是iPSC）可能形成柱状细胞的效率较低。若出现此情况，可在第2阶段添加BMP和TGF抑制剂（Dorsomorphin29、SB43154219，各2 μM）以促进形成。</li>
	<li>约第14–17天，柱状细胞将显得更为致密。有时这些细胞会形成具有可见管腔的脊状或环状结构。除柱状形态外，此阶段的细胞表达神经上皮标志物，如PAX6和SOX112,26。</li>
	<li>在开始分离前，必须首先观察细胞，判断是否存在非神经上皮细胞。可利用客观标志物识别非神经上皮克隆，并用移液器枪头将其刮除以消除。</li>
</ol>
3. 端脑前体细胞的生成（D17-D24）
<ol>
	<li>克隆中心含有神经上皮细胞，应将其与克隆的其余部分分离。可使用微量移液器和无菌的1 ml滤芯吸头完成此操作。当对克隆中心施加少量压力时，中心部分通常会很容易地脱离。注意避免克隆外周部分同时脱落。如果中心部分难以分离，可在无菌操作台的显微镜下用针进行切割去除。将克隆中心部分转移至15 ml离心管中，在200 × g下离心2分钟。</li>
	<li>应吸除细胞上的培养基。两块培养板的细胞可转移至一个未经组织培养处理的T25培养瓶中，加入10 ml NIM培养基，并添加B27（不含维生素A，1:50）。每块细胞培养板使用5–10 ml培养基。</li>
	<li>次日观察细胞时，应呈现类球状形态。必须将这些细胞转移至新的培养瓶中（继续使用含NIM和B27（1:50）的培养基），因为外周细胞容易悄悄附着到培养瓶底部。</li>
	<li>随后，神经球应在添加B27（1:50）的NIM培养基中悬浮培养一周。为促进细胞存活和增殖，可在悬浮培养期间向培养基中添加环磷酸腺苷（cAMP，1 μM）和胰岛素样生长因子（IGF1，10 ng/mL）。此时，神经球含有端脑前体细胞（FOXG1+），可接种至盖玻片上进行终末分化。</li>
</ol>
4. 进一步分化为端脑神经元（D25+）
<ol>
	<li>
	<ol class="ualpha">
		<li>为接种细胞，准备已用多聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片（置于24孔板中）。首先清洁盖玻片，然后用多聚鸟氨酸包被（0.1 mg/ml，37 °C，过夜），之后储存于冷冻室。 
		 多聚鸟氨酸包被步骤： 
		<ol>
			<li>对盖玻片进行灭菌：将盖玻片放入盛有硝酸的烧杯中，在通风橱内轻轻震荡1小时。倒出硝酸，用去离子水多次冲洗，并将盖玻片置于流动的去离子水中至少15分钟。随后将盖玻片放入95%乙醇中，若立即使用则震荡30分钟，否则可在室温下保存于乙醇中。</li>
			<li>在无菌操作台中，将装有灭菌后盖玻片的50 ml离心管内容物倒入6孔板的盖子中。使用灭菌镊子逐个夹取盖玻片，垂直插入24孔板的单个孔中。重复此操作，使每个孔均含有一片盖玻片。</li>
			<li>待盖玻片完全干燥后，轻敲培养板使盖玻片平落于孔底。随后向每片盖玻片加入100 μl多聚鸟氨酸溶液（0.1 mg/ml，溶于无菌dH2O），于37 °C孵育过夜。</li>
			<li>次日，从培养箱中取出培养板，使其冷却至室温。从盖玻片边缘吸除多聚鸟氨酸溶液，注意避免触碰或刮伤盖玻片表面。吸除后让盖玻片干燥约30分钟，再进行洗涤。</li>
			<li>向每孔加入1 ml无菌dH2O，静置10分钟，然后吸除孔内液体。重复该洗涤步骤两次。待培养板完全干燥后（在操作台中保持敞口），盖上盖子，用铝箔包裹，于-20 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>
		<ol>
			<li>为进行层粘连蛋白包被，向每片经多聚鸟氨酸处理的盖玻片加入50 μl神经分化培养基与层粘连蛋白的混合液（终浓度为20 μg/ml），注意仅使液体接触盖玻片表面，避免溢出。在准备细胞接种前，于37 °C孵育1–2小时。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集神经球，并在15 ml离心管中以200 × g离心2分钟，吸除上清液。</li>
	<li>
	<ol class="ualpha">
		<li>用DMEM-F12培养基清洗细胞，再次离心。若神经球过大而难以有效贴附，可在该步骤使用Accutase进行解离。</li>
		<li>若使用Accutase：在用DMEM-F12洗涤细胞后，加入Accutase（约2 ml）将神经球解离为小细胞团，于37 °C孵育3分钟。随后加入等量的胰蛋白酶抑制剂（约2 ml），并在200 × g下离心3分钟。将细胞重悬于NDM培养基中，使用P200移液器轻轻吹打破碎细胞团。随后将小细胞团接种至预先包被的盖玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除大部分培养基，将细胞置于6 cm培养皿中，保留少量液滴以便于挑选细胞。向每片预先包被的盖玻片接种约4–5个神经球。无需预先吸除层粘连蛋白溶液。</li>
	<li>让神经球贴附至少2–4小时。待其充分贴附后，向每片盖玻片添加更多培养基（0.5 ml/盖玻片），培养基成分为神经分化培养基，并补充B27（1:50）、cAMP（1 μM）以及神经营养因子（BDNF、GDNF和IGF，均为10 ng/ml）。此后可每隔一天更换一半培养基，此类细胞可维持培养数月之久。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在神经分化过程中有几个关键步骤。必须确保人多能干细胞（PSCs）具有多能性，否则这些细胞可能已偏向于非神经谱系的分化。可通过使用针对多能性标志物（如 Oct4、Sox2、Nanog 和 Tra-1-60）的抗体对人 PSCs 进行染色来验证其多能性1-3。若人 PSCs 在传代后贴壁效果不佳，可添加 ROCK 抑制剂（Y27632）以改善。对于难以维持细胞多能性的实验者，可能存在的问题包括饲养层 MEF 细胞的质量/密度，以及所用 KOSR 的批次差异，因为不同批次之间可能存在变异。尽管上述方案中使用了 MEF 饲养层细胞来维持 PSCs，但本方法同样适用于在无饲养层体系中培养的 PSCs。
在将细胞解离形成PSC聚集体时，需将细胞暴露于dispase的时间限制在几分钟内（细胞边缘会变圆）。iPSCs细胞边缘变圆所需的时间（最长可达10分钟）通常比ESCs细胞（3–5分钟）更长。每次仅向一个培养皿的人源PSCs中添加dispase为最佳操作，以确保细胞不会因酶处理时间过长而受到损伤甚至死亡。当细胞进入PSC聚集体阶段后，应保持较低的细胞密度。在接种PSC聚集...

人类多能干细胞（PSCs），包括人类胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs），具有生成体内所有细胞类型（包括神经元）的能力1-3人类多能干细胞向多种神经元亚型的定向分化是其在再生医学中应用的关键。在发育过程中，功能性神经元亚型的生成是一个复杂的过程，涉及神经谱系的诱导、沿头尾轴方向区域化前体细胞的特化，以及由这些区域化前体细胞分化产生终末分裂后的神经元类型。4,5自2001年起，已建立多种系统用于从人胚胎干细胞（hESCs）诱导生成神经谱系，这些系统为后续产生不同神经元亚型提供了平台6,7根据发育学原理，多种神经元类型，例如脊髓运动神经元8-12中脑多巴胺能神经元13-15和神经视网膜细胞16,17 已通过应用在这些神经元类型特化过程中起关键作用的重要形态发生素，从人类多能干细胞（PSCs）中高效地获得了特化的神经元。 体内 发育。其他方案也已开发出来，以通过使用额外因子促进hESCs向神经元的分化18-20 例如小分子或通过与其他细胞类型共培养以促进分化21.
人类新皮层高度发达，包含多种细胞类型，其中包括在学习、记忆和认知功能中发挥重要作用的谷氨酸能神经元22,23。在体外培养中生成谷氨酸能神经元的第一步是定向诱导端脑前体细胞。Yoshiki Sasai 研究组首次报道了通过在含有 DKK1（可抑制 Wnt 信号通路）和 LeftyA（可抑制 nodal 信号通路）的无血清悬浮培养体系中，将小鼠胚胎干细胞（mESCs）定向分化为端脑前体细胞的方法24。随后，包括我们研究组在内的多个团队也报道了在无血清培养基中由人多能干细胞（PSCs）诱导生成端脑前体细胞的方法25-27。由人 PSCs 生成端脑前体细胞无需外源形态发生因子，且前体细胞的诱导效率远高于小鼠 ESCs26,27。本文描述了一种由 Zhang 研究组建立并优化的化学成分明确的神经诱导体系7。在不添加外源后脑化因子的条件下，该方案可高效地从人 PSCs 诱导生成端脑前体细胞27。随后可通过调控 Wnt 和音猬因子（SHH）信号通路，将这些前体细胞进一步分化为背侧或腹侧前体细胞。其中，背侧前体细胞可高效地进一步分化为谷氨酸能神经元27。此外，该方案同样适用于由人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成谷氨酸能神经元28，从而可获得患者特异性的神经元，用于研究多种疾病的发病机制及潜在治疗方法。同时，我们的体系也为研究端脑中多种神经元类型的发育与特化提供了平台。

<table><tbody><tr><td>含F12营养混合物的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM/F12）</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>无血清培养基替代物</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基&amp;#8211;乙醇（14.3 M）</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸氢溴化物（polyornithine）</td><td>Sigma</td><td>116K5103</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白（人）</td><td>Sigma</td><td>L-6274</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白（小鼠）</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>双子座</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>创新细胞技术</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Stemgent</td><td>04-0024</td><td></td></tr><tr><td>成纤维细胞生长因子2（FGF2, bFGF）</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Gibco</td><td>17075</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 明胶</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Foxg1 抗体</td><td>Dr. Y. Sasai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoxb4 抗体（1:50）</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>I12</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 抗体（1:5000）</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>PAX6</td><td></td></tr><tr><td>Nkx2.1 抗体（1:200）</td><td>Chemicon</td><td>MAB5460</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1 抗体（1:2000）</td><td>Chemicon</td><td>AB9616</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT1 抗体（1:100）</td><td>Synaptic Systems</td><td>135302</td><td></td></tr><tr><td>脑源性神经营养因子（BDNF）</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）</td><td>PrepoTech 公司</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素样生长因子1（IGF1）</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>环磷酸腺苷（cAMP）</td><td>Sigma</td><td>D-0260</td><td></td></tr><tr><td>Sonic hedgehog (SHH)</td><td>R&amp;研发</td><td>1845-SH</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>BD</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶（未处理）</td><td>BD</td><td>353009</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶（未处理）</td><td>BD</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Chemiglass生命科学</td><td>1760-012</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 培养皿</td><td>BD</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>9'' 玻璃移液管</td><td>Fisher</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip 滤器（0.22 &amp;mu;M)</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 滤器 1,000 ml（0.22 &amp;mu;M</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>相差显微镜（Observer A1）</td><td>Zeiss</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳培养箱（Hera Cell 150）</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜（SterilGard III Advance）</td><td>The Baker Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机（5702 R）</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从人类多能干细胞诱导端脑谷氨酸能神经元的特化

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

本文介绍了一种从人类多能干细胞（PSCs）高效生成端脑谷氨酸能神经元的逐步操作流程。分化过程首先将人类PSCs分解为细胞团块，当这些细胞置于悬浮培养中时，团块会聚集成球状结构。在第1至第4天，将这些细胞团在hESC培养基中培养，以促进其自发分化。在此期间，细胞具有分化为三个胚层中任意一种的潜能。从第5至第8天，将细胞转移至神经诱导培养基中，促使其向神经谱系分化。大约在第8天，让细胞贴附于6孔板上继续分化，期间神经上皮细胞逐渐形成。这些神经上皮细胞可在第17天被分离。随后可将细胞以神经球形式维持培养，直至准备将其接种至盖玻片上。通过使用不含任何尾部化因子的基础培养基，可将神经上皮细胞特化为端脑前体细胞，并进一步高效地分化为背侧端脑祖细胞及谷氨酸能神经元。总体而言，该体系为研究人员提供了一种生成人类谷氨酸能神经元的工具，可用于研究此类神经元的发育过程及其相关疾病。

本文描述了一种将人类多能干细胞（PSCs）分化为端脑谷氨酸能神经元的实验方案，该过程包括多个关键步骤：PSC细胞聚集体的形成、神经上皮细胞的诱导、端脑前体细胞的生成，以及这些前体细胞向端脑神经元的终末分化（图1）。该体系在生成端脑前体细胞和谷氨酸能神经元方面具有高度稳定性和效率。例如（图2），在未添加尾部化因子的情况下，将人胚胎干细胞（hESCs）向神经谱系分化27。在分化第24天，大多数神经前体细胞表达FOXG1（端脑特异性转录因子），但不表达HOXB4（后脑和脊髓细胞的标志物），表明端脑前体细胞已成功生成（图2D）。这些端脑前体细胞具有背侧表型，表现为表达PAX6（背侧前体细胞标志物）（图2E），而不表达NKX2.1（腹侧前体细胞标志物）（图2F）。经过进一步分化后，这些端脑背侧前体细胞分化为谷氨酸能神经元，其中约80%的细胞表达谷氨酸能标志物TBR127。TBR1阳性神经元同时表达神经元标志物βIII-微管蛋白（<str...

该实验通过模拟人类发育过程中所经历的类似检查点，获得端脑神经元。细胞首先被允许自发分化，随后暴露于促使其向神经谱系分化的因子中，再经过分离后接种至盖玻片上，以促进其终末分化与成熟。

在此，描述了一种从人类多能干细胞（PSCs）高效生成端脑谷氨酸能神经元的逐步操作流程。该……

本实验的总体目标是通过模拟人类发育过程中所经历的各个检查点，将人类胚胎干细胞（H ESCs）诱导分化为头面部神经元。该过程首先使 HSCs 在 HESC 培养基中悬浮培养，自发分化；随后将其转移至神经诱导培养基中，以实现更特异性的分化。接着，将胚胎样体或 PSC 细胞聚集体接种至经组织培养处理的培养板上，使其贴壁，细胞随之扩展并分化为单层结构。中枢形成在形态上类似于千米细胞的神经上皮细胞。接着，将神经上皮细胞分离并置于悬浮培养中，使其形成神经球。最后，将神经球接种到盖玻片上，使其进一步分化。最终可以获得通过免疫染色或电生理学方法显示的特定类型神经元的结果。该技术的应用范围广泛，可延伸至多种遗传性疾病，因为还可利用诱导性多能干细胞生成患者特异性的神经元，从而阐明其作用机制及潜在治疗方法。尽管该方法能够为从多能干细胞发育形成头面部神经亚型的过程提供深入见解。它也可应用于其他系统，例如与塔隆头颅神经元相关的人类疾病。要生成人多能干细胞聚集体，首先将人多能干细胞在添加了碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的HESC培养基中，于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养5至7天，此时细胞集落会变得较大但仍保持未分化状态。当集落达到适当阶段时，在50毫升离心管中进行下一步操作。根据文本方案，用D-M-E-M-F12培养基配制浓度为1毫克/毫升的二硫苏糖醇（disbays）溶液。吸弃细胞中的培养基，然后用D-M-E-M-F 12洗涤一次。去除洗涤液后，向每孔加入1毫升dis bays，在37摄氏度孵育3至5分钟。在3分钟时，于显微镜下观察细胞卷曲且颜色略深的边缘。如有必要，可延长细胞孵育时间。当细胞状态合适时，移除酶解液，并用 D-M-E-M-F 12 培养基洗涤细胞一次，随后更换为 1.5 毫升 HESC 培养基以解离并分散细胞。将 10 毫升玻璃移液管的管口置于培养孔底部右侧壁附近的细胞表面，轻轻上下移动移液管，从一侧缓慢移动至另一侧，再反向返回。 待所有细胞悬浮后，将其转移至15毫升离心管中，在200 G条件下离心2分钟，随后弃去上清液。使用HESC培养基将细胞重悬并转移至培养瓶中进行培养。例如，若细胞来自六孔HSC培养板，则使用一个T75培养瓶，加入50毫升HESC.Medium进行培养。将细胞在37摄氏度下孵育12小时。接下来，为去除细胞碎片，将细胞和培养基转移至50毫升离心管中，洗涤细胞一次，然后加入50毫升新鲜培养基，转移至新的培养瓶中。以这种方式继续培养细胞，直至第5天。第5天，离心收集细胞并将其转移至新的T75培养瓶中。加入50毫升神经诱导培养基（NIM），培养2至3天，每天更换一半的NIM。在接种细胞前，使用层粘连蛋白（laminin）或胎牛血清（FBS）对培养板进行包被，以促进细胞贴壁。若使用FBS，每孔加入含1.5毫升培养基的细胞悬液。轻轻摇晃培养板以分散细胞团，并使细胞过夜贴壁。次日在37摄氏度条件下，每孔更换为2毫升NIM培养基。经过一至两天培养后，每个细胞团将铺展形成单层细胞，数天内，其中大部分细胞的中心区域在形态上将类似于柱状细胞。大约第14至17天，柱状细胞将显得更加致密。有时细胞会形成带有明显管腔的脊状或环状结构。在分离细胞之前，应检查是否存在非EU上皮细胞，并用移液器吸头将其刮除。为了分离位于集落中央的神经上皮细胞，使用微量移液器和一支无菌的1毫升带滤芯移液吸头，对集落中心施加压力，使其脱离。注意避免集落的外围部分同时脱落。将两块培养皿的分离细胞转移至15毫升离心管中，在200 ×g条件下离心2分钟。弃去培养基后，将细胞转移至未经组织培养处理的T25培养瓶中，加入10毫升NIM培养基。加入B27后，于次日继续培养过夜，此时细胞应呈现类似球体的形态。有时外周细胞也会被分离出来，它们通常会贴附在培养瓶底部。如果发生这种情况，将球形细胞转移至新的培养瓶中，留下已贴壁的细胞。将神经球悬浮于 NIMB 27 培养基中培养一周，以促进细胞的存活与增殖。加入环磷酸腺苷（cAMP）和类胰岛素生长因子1（IGF-1）。一周结束时，神经球将包含头面部前体细胞，可进行终末分化，准备接种至盖玻片上。为在24孔板中制备聚-L-赖氨酸-层粘连蛋白包被的盖玻片，首先在37°C条件下，用0.1毫克/毫升的聚-L-赖氨酸溶液过夜包被洁净的盖玻片；随后在神经分化过程中，加入50微升浓度为20微克/毫升的层粘连蛋白溶液，以实现对盖玻片的层粘连蛋白包被。将培养基加入每个经聚氨酯处理的盖玻片上，注意仅让液体接触盖玻片本身。在37°C下孵育1至2小时。层粘连蛋白孵育后，收集神经球并用D-M-E-M-F 12培养基洗涤。若细胞过大而无法正常贴壁，加入约2毫升Accutase，在37摄氏度孵育3分钟。接着，加入等体积的胰蛋白酶抑制剂，将细胞在200 ×g离心3分钟，弃去上清，替换为NDM培养基，用P200移液器吹打细胞以形成较小的细胞团簇。将它们置于预先包被的盖玻片上，吸除大部分培养基，并将细胞转移至六厘米培养皿中，保留少量培养基，以便在不移除预包被盖玻片上的层粘连蛋白的情况下更方便地挑选细胞。每个培养皿转移约四到五个神经球。让神经球贴壁至少两到四小时，然后加入0.5毫升添加了B27循环成分的神经分化培养基。每隔一天更换一半的培养基，并添加微珠（MP）和神经营养因子。细胞可维持培养数月，如此处所示。本方案描述了如何通过多个关键步骤将人多能干细胞（PSCs）分化为端脑谷氨酸能神经元。PSC 聚集体的形成包括神经上皮细胞的诱导、端脑前体细胞的产生，以及这些前体细胞最终分化为端脑神经元。该系统在生成端脑前体细胞和谷氨酸能神经元方面具有良好的稳健性和高效性。在不添加诱导因子的情况下，HSCs 自发分化为神经谱系，并在分化后第 24 天完成这一过程。大多数神经前体细胞对Fox G1呈阳性，Fox G1是头部表达的一种转录因子，但对HOKs B4呈阴性，HOKs B4是后脑和脊髓细胞的标志物，这表明端脑头部前体细胞已成功生成。这些端脑头部前体细胞具有背侧表型，表现为表达PAX6（背侧前体细胞的标志物），而不表达NKX2.1（腹侧前体细胞的标志物）。经过进一步分化后，这些头端背侧前体细胞分化为谷氨酸能神经元，对谷氨酸能标记物呈阳性。持续表达TBR1的TBR1神经元也对神经元标记物βIII微管蛋白或MAP2呈阳性。这些细胞还表达囊泡型谷氨酸转运体1（VGLUT1），即成熟谷氨酸能神经元的标记物，表明在培养中高效生成了头端谷氨酸能神经元。完成此操作后，还可进行其他方法，例如电生理学实验，以回答进一步的问题，例如这些神经元是否能够与其他细胞形成突触连接。观看本视频后，您应已充分理解如何通过若干关键步骤将人多能干细胞分化为头面部谷氨酸能神经元。多能干细胞聚集体的形成、神经上皮细胞的诱导、头颅祖细胞的产生，以及这些祖细胞最终分化为头颅神经元的过程。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

从人类多能干细胞的规范在前脑谷氨酸能神经元

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

多能性人类干细胞（hPSCs）的神经元分化方案通常耗时较长，且需要较高的细胞培养技术。本文中，我们改进了一种基于小分子的分化方法，将其应用于多孔板体系，从而能够以简单、快速且高效的方式在受控条件下生成人类神经元。...

在多孔板格式中快速高效地从人类多能干细胞生成神经元

本视频演示了将拟胚体（EBs）分化为神经外胚层聚集体，并进一步将其分离为神经元和胶质细胞的过程。该方法可高效生成神经元和胶质细胞。...

从人诱导性多能干细胞衍生的拟胚体生成神经元和胶质细胞

本视频展示了通过转染携带受四环素反应元件调控的神经发生转录因子基因的工程化慢病毒，诱导人多能干细胞分化为神经元，并随后用四环素衍生物和成熟培养基处理的过程。...

利用基因工程慢病毒实现人多能干细胞向神经元的分化

我们基于发育生物学知识和已发表的研究，开发了一种优化的方案，可高效地从人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞中生成A9型中脑多巴胺能神经元，该技术将有助于帕金森病的疾病建模及细胞替代治疗。...

由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮层中大多数兴奋性突触的所在部位。本方法描述了对来源于诱导 多能干细胞的人类皮层锥体谷氨酸能神经元的树突棘形态进行三维定量分析。...

源自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析

人诱导多能干细胞（hiPSCs）被认为是药物和化学物质筛选以及新药开发的有力工具 体外...

人诱导性多能干细胞向神经元与胶质细胞混合培养物分化的实验方案用于神经毒性检测

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。...

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

线粒体运输和形态异常与多种神经退行性疾病相关。本方案利用诱导性多能干细胞分化的前脑神经元，评估遗传性痉挛性截瘫中的线粒体运输和形态。该方案可实现对轴突中线粒体运输的表征及其形态学分析，有助于推动神经退行性疾病的机制研究。...

分析遗传性痉挛性截瘫患者来源的人诱导多能干细胞衍生神经元中的线粒体运输与形态

我们描述了一种用于诱导人源多能干细胞分化为脊髓星形胶质细胞和神经元，并将其共培养以进行电生理记录的方法。...

建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

从人类多能干细胞（hPSC）中诱导生成肠神经系统（ENS）谱系细胞，为研究ENS的发育与疾病以及再生医学应用提供了可扩展的细胞来源。本文详细描述了一种 体外...

从人多能干细胞分化出肠神经系统谱系

学习利用人类胚胎干细胞通过自发分化、神经诱导和终末成熟等关键步骤生成前脑谷氨酸能神经元的方法。该技术模拟发育检查点，为神经生物学和再生医学研究提供可靠的神经元分化模型。

从人类多能干细胞诱导端脑谷氨酸能神经元的特化

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