从人类多能干细胞的规范在前脑谷氨酸能神经元

该程序的总体目标是通过类似于人类发育过程中观察到的检查点，从人类胚胎干细胞或 H ESC 中产生头部神经元。这是通过首先让 HSC 在 HESC 培养基中的悬浮液中自发分化，然后将它们转移到神经诱导培养基中以更具选择性地分化来实现的。接下来，胚胎体或 PSC 聚集体被允许附着在组织培养处理的板上，细胞在那里扩增并分化成单层。

中心形成神经上皮细胞，形态类似于公里细胞。接下来，分离神经上皮细胞并置于悬浮培养物中，在那里它们形成神经球。最后，将神经球接种在盖玻片上，在那里它们可以进一步区分。

最终，可以获得显示通过免疫染色或电生理学形成的特定类型神经元的结果。这项技术的影响延伸到多种遗传性疾病，因为患者特异性神经元也可以从诱导多能干细胞中产生，其中的作用机制和潜在的疗法可以阐明。尽管这种方法可以深入了解多能干细胞的爪头神经亚型的发育。

它也可以应用于其他系统，例如与爪头神经元相关的人类疾病 为了产生人类多能干细胞聚集体，首先在补充有碱性 FGF 的 HESC 培养基中的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养人类多能干细胞 5 到 7 天，菌落会很大，但仍然未分化。当菌落在 50 mL 试管中达到正确的阶段时。根据文本方案，在 D-M-E-M-F 12 培养基中制备每毫升 1 毫克的 dis bays 溶液。

从细胞中吸出培养基，然后用 D-M-E-M-F 12 冲洗一次。去除洗涤液后，向每个孔中加入 1 毫升 dis bay，并在 37 摄氏度下孵育 3 到 5 分钟。在 3 分钟标记处，在显微镜下检查看起来更暗的卷曲边缘。

如有必要，将细胞孵育更长时间。当细胞准备好后，去除 dase 溶液并用 D-M-E-M-F 12 洗涤细胞一次，然后用 1.5 毫升 HESC 培养基代替洗涤液以分离和分解细胞。将 10 毫升玻璃移液器的尖端放在细胞上，朝向孔的右下壁，上下小幅移动，穿过孔移动到另一侧，然后沿相反方向返回。

一旦所有细胞都处于悬浮状态，将它们放入 15 毫升试管中，并以 200 G 离心 2 分钟，然后从沉淀中取出培养基。使用 HESC 培养基，将细胞转移到培养瓶中进行培养。例如，对于来自 6 个 HSC 孔的细胞，使用一个装有 50 mL HESC 的 T 75 培养瓶。中等。

将细胞在 37 摄氏度下孵育 12 小时。接下来，为了去除任何细胞碎片，将细胞和培养基转移到 50 mL 试管中，洗涤细胞一次，然后用 50 mL 新鲜培养基将其转移到新培养瓶中。继续以这种方式喂养细胞，直到第 5 天。

第 5 天，离心细胞并将其转移到新的 T 75 培养瓶中。用 50 毫升神经诱导培养基或 NIM 孵育它们 2 到 3 天，每天在孵育板后更换一半的 NIM，细胞使用层粘连蛋白或 FBS 帮助它们附着在板上。使用 FBS，向每个培养基中加入 1.5 毫升含细胞的培养基。

轻轻摇动板以分散聚集体，并让细胞附着过夜。第二天在 37 摄氏度时，用每孔 2 mL NIM 替换所有培养基。孵育一两天后，每个聚集体将展开形成单层，几天内，大多数这些细胞的中心在形态上看起来与柱状细胞相似。

大约第 14 至 17 天，柱状细胞会显得更加紧凑。有时细胞会形成脊或环，内部有可见的管腔。在分离细胞之前，检查它们是否存在任何非欧盟上皮细胞，并使用移液器吸头将其刮掉。

分离在集落中心发现的神经上皮细胞。使用微量移液器和无菌的 1 毫升过滤移液器对菌落中心施加压力，使其升起。注意不要让菌落的外部也分离。

将两板分离的细胞转移到 15 mL 试管中，以 200 G 离心 2 分钟。去除培养基后，将细胞转移至含有 10 ml NIM 的非组织培养处理的 T 25 培养瓶中。加入 B 27 后，第二天孵育过夜，细胞应具有球状外观。

有时外周细胞也会被分离出来，它们通常会附着在培养瓶的底部。如果发生这种情况，请将球形细胞转移到新的培养瓶中，留下附着的细胞培养。神经球和悬浮液在 NIMB 27 中放置一周，以促进细胞耐力和增殖。

添加环状 A MP 和胰岛素样生长因子 1。在周末，神经球将包含头部祖细胞，并准备接种在盖玻片上以进行终末分化。为了在 24 中制备聚氨酯层粘连蛋白包被的盖玻片，孔板首先在 37 摄氏度下用每毫升 0.1 毫克/毫升的聚氨酯溶液涂覆干净的盖玻片过夜，然后在盖玻片上涂上 50 微升每毫升 20 微克层粘连蛋白的层粘连蛋白神经分化。

中等到每个聚氨酯处理的盖玻片。注意不要让液体接触盖玻片本身。将它们在 37 摄氏度下孵育 1 到 2 小时。

层粘连蛋白孵育后，在 D-M-E-M-F 12 中收集并洗涤神经球。如果细胞太大而无法正确附着，则加入约 2 毫升 Accutane，并在 37 摄氏度下孵育细胞 3 分钟。接下来，加入等体积的胰蛋白酶抑制剂，将细胞以 200 G 离心 3 分钟后，用 NDM 替换溶液，并使用 P 200 将细胞打碎成小簇。

将它们放在预包被的盖玻片上，吸出大部分培养基，并将细胞转移到 6 厘米的培养皿中，加入几滴培养基中，这样无需从预包被的盖玻片中取出层粘连蛋白即可更容易地选择它们。将大约 4 到 5 个神经球转移到每个神经球。让神经球附着至少 2 到 4 小时，然后加入 0.5 毫升补充有 B 27 cyclic 的神经分化培养基。

A MP 和神经营养因子每隔一天更换一半的培养基。细胞可以维持数月，如图所示。该方案描述了如何通过几个关键步骤将人类 PSC 分化为爪头谷氨酸能神经元。

PSC 的形成聚集了神经上皮细胞的诱导、爪头祖细胞的产生以及这些祖细胞末端分化为爪头神经元。例如，该系统在头、祖细胞和谷氨酸能神经元的产生中非常健壮和有效。在没有添加化因子的情况下，HSCs 分化为神经谱系和分化后 24 天。

大多数神经前体对 Fox G 1 阳性，头部表达的 A 转录因子，但对 HOKs B 4 阴性，后脑和脊髓细胞的 A 标志物表明端子头部祖细胞已成功产生。这些端子头部祖细胞具有背侧表型，如 PAC six 的表达所示。由背侧祖细胞表达的标志物，但不表达 NK X 2.1 腹侧祖细胞的标志物。

进一步分化后，这些头部背侧祖细胞分化为谷氨酸能神经元，谷氨酸能标志物呈阳性。TBR 1 持续阳性的神经元 TBR 1 神经元也对神经元标志物 β 3 微管蛋白或图 2 呈阳性。这些细胞还表达囊泡谷氨酸转运蛋白 1 或 V glut one，这是成熟谷氨酸能神经元的标志物，表明在培养物中有效产生爪头谷氨酸能神经元。

按照这个程序，可以执行其他方法，如电生理学，以回答其他问题，如这些神经元是否可以与其他细胞建立突触连接。看完这个视频，你应该有一个很好的理解。它必须通过几个关键步骤分化人类多能干细胞并分化为头部谷氨酸能神经元。

多能干细胞的形成聚集了神经上皮细胞的诱导、头部祖细胞的产生以及这些祖细胞向头部神经元的末端分化。